專利名稱：一種dna分子及重組質粒和大腸桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種DNA分子及重組質粒和大腸桿菌。
背景技術：
L-蘇氨酸是人體所必需的8種氨基酸之一，廣泛應用于醫藥、食品、飼料等，目前L-蘇氨酸主要以微生物發酵的方法生產，多種細菌可用于L-蘇氨酸生產，如谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌等。由于大腸桿菌發酵生產L-蘇氨酸具有繁殖迅速、發酵溫度高、生理生化基礎研究較深入的優勢，逐漸成為L-蘇氨酸生產的常用菌株。隨著世界對L-蘇氨酸需求量的不斷增加，L-蘇氨酸高產菌株的研究越來越受到重視。其中，影響大腸桿菌高產的最關鍵的一個因素就是其耐受L-蘇氨酸的能力，只有解除L-蘇氨酸對代謝途徑的抑制，才能進而增加L-蘇氨酸的產量。雖然野生型的大腸桿菌具有表達L-蘇氨酸耐受蛋白的基因，但該基因所表達的蛋白量較低，僅為大腸桿菌正常生長所需，并不能耐受大于0.1M濃度的L-蘇氨酸，使得野生型的大腸桿菌的產酸能力較低。因此，利用生物技術手段對野生型大腸桿菌進行改造，使其能夠具有較高L-蘇氨酸耐受能力，對L-蘇氨酸的生產具有十分重要的意義。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的是提供一種DNA分子及重組質粒和大腸桿菌，使得所述大腸桿菌對L-蘇氨酸具有較高的耐受活性。為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案:一種DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發明從NCBI數據庫獲得來自于耶爾森氏菌屬-Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica8081菌株的一段蛋白質序列，長度為206個氨基酸,其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，NCBI蛋白序號為G1:123440599，該蛋白具體功能尚未得到公開確認，而經申請人研究其具有耐受L-蘇氨酸的活性，但是表達該蛋白的基因(Gene bank中的編號為FR718698.l，621bp，DNA序列3775-4395)來源于同大腸桿菌種屬差異較大的耶爾森氏菌屬，其在大腸桿菌中并不能正確表達該蛋白。故本發明按照大腸桿菌W3110密碼子的偏好性,優化密碼子,通過核酸合成儀合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子，測序驗證該序列的正確性，合成基因酶切位點為Smal/Hindlll，其中優化、合成工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。本發明還提供一種重組質粒pKR-E，由質粒pKK223-3在其Sma I和HindIII酶切位點間插入如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子獲得，經PCR和酶切驗證并測序，表明如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子已成功構建至質粒pKK223-3中Sma I和HindIII酶切位點間，其質粒圖譜見圖1。
本發明還提供一種重組質粒PKTR-E，其由以下方法制備:以重組質粒pKR-E為模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的下游引物擴增，BamHI/SphI雙酶切擴增產物，獲得由Tac啟動子、SEQ ID NO:1 所不核苷酸序列的DNA分子、rrnB TlTerminator 終止子、rrnB Terminator終止子組成的片段，然后與經過BamHI/SphI雙酶切的質粒pKK223_3_ThrA’ BC連接即得；其中，所述Tac啟動子、rrnB TlTerminator終止子位于片段兩端,SEQ ID N0:1所不核苷酸序列的DNA分子位于Tac啟動子、rrnB Terminator終止子之間，rrnB Terminator終止子位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB TlTerminator終止子之間。經PCR和酶切驗證并測序，表明所述片段已成功構建至質粒pKK223-3-ThrA’BC中BamHI和SphI酶切位點間，其質粒圖譜見圖2。質粒pKK223_3和pKK223_3_ThrA，BC已在文獻“Kwang Ho Lee,Molecular SystemsBiOlOgy3:149，2007”中公開，并可通過市售獲得，兩者皆為強表達質粒，以兩者為基礎質粒構建的重組質粒PKR-E和pKTR-E 有助于本發明所述DNA分子在大腸桿菌中的表達。其中，pKR-E帶有基礎質粒PKK223-3的Tac強啟動子，能增加大腸桿菌中所述DNA分子的拷貝數和表達量，并通過基礎質粒PKK223-3原有的具有強終止結構的rrnB TlTerminator終止子和rrnB Terminator終止子終止該基因的表達，以防所述DNA分子中TAG終止密碼子不能終止基因表達造成的通讀。pKTR-E是以pKR-E為模板,將上述帶有Tac啟動子、rrnB TlTerminator終止子和rrnB Terminator終止子的所述DNA分子克隆到質粒pKK223_3_ThrA’ BC中BamHI和SphI酶切位點間，同樣具有上述優勢。此外，pKTR-E帶有基礎質粒pKK223-3-ThrA’BC的定點突變蘇氨酸操縱子-ThrA’BC，該操縱子與引入的強Tac啟動子可以共同增強所述DNA分子的表達量，有利于改造后的大腸桿菌的L-蘇氨酸耐受能力的提高。本發明將重組質粒pKR-E按照本領域常規方法轉化到經氯化鈣法制備的大腸桿菌W3110感受態細胞中，得到一種能夠耐受L-蘇氨酸的新型大腸桿菌，命名為MHZ-0212-1，經PCR和酶切驗證并測序，表明所述重組質粒pKR-E已成功轉入大腸桿菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6689，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。本發明將重組質粒pKTR-E按照本領域常規方法轉化到經氯化鈣法制備的大腸桿菌W3110感受態細胞中，得到一種能夠耐受L-蘇氨酸的新型大腸桿菌，命名為MHZ-0212-2，經PCR和酶切驗證并測序，表明所述重組質粒pKTR-E已成功轉入大腸桿菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6690，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。所述大腸桿菌W3110購自于美國模式培養物集存庫，商品貨號為ATCCaNumber:39936 。將保藏編號為CGMCC No:6689和CGMCC No:6690的大腸桿菌(以下簡稱為MHZ-0212-1 和 MHZ-0212-2)與分別轉入 pKK223_3 和 pKK223_3_ThrA’ BC 的兩株大腸桿菌W3110 (以下簡稱為W3110-pKK和W3110-pKT)進行L-蘇氨酸耐受試驗，結果表明，MHZ-0212-1和MHZ-0212-2兩菌株均可耐受0.8-0.9M的L-蘇氨酸，而W3110_pKK和W3110-pKT兩菌株在0.1-1.0M范圍內均不耐受，表明本發明所述的新型大腸桿菌菌殼耐受較高濃度的L-蘇氨酸。此外，將MHZ-0212-1、MHZ-0212-2、W3110-pKK 和 W3110-pKT 分別在相同環境下進行L-蘇氨酸發酵試驗，結果表明，MHZ-0212-1和MHZ-0212-2兩菌株L-蘇氨酸產量分別為
0.51g/L、2.06g/L,而W3110-pKK和W3110-pKTL_蘇氨酸產量分別為0、0.9g/L，本發明所述新型大腸桿菌L-蘇氨酸產量均高于各自的對照菌株，表明其可以應用于L-蘇氨酸發酵中。由以上技術方案可知,本發明以一段功能未知的蛋白序列為參照，優化并合成一段新DNA序列，并克隆至強表達載體pKK223-3和pKK223_3_ThrA’ BC中，轉化到大腸桿菌W3110中得到兩株具有高L-蘇氨酸耐受活性的新型大腸桿菌，能夠應用于L-蘇氨酸的發酵中。生物材料保藏信息說明:1、MHZ-0212-1大腸桿菌，已于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6689，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。2、MHZ-0212-2大腸桿菌，已于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6690，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。
:圖1示本發明所述重組質粒pKR-E質粒圖譜；圖2示本發明所述重組質粒pKTR-E質粒圖譜；圖3示本發明所述重組質粒pKR-E和pKTR_E的電泳鑒定圖；其中，最右側為Marker,從上之下依次為 8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;中間泳道條帶為pKTR-E雙酶切產物的兩條條帶，從上至下依次為5201bp、4824bp ;最左側泳道條帶為pKR-E雙酶切產物的兩條條帶，從上至下依次為 4296bp、893bp。
具體實施方式
:本發明公開了一種DNA分子及重組質粒和大腸桿菌，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的DNA分子、重組質粒、大腸桿菌已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明。其中，實施例部分如未說明，則所有分子克隆、轉化等生物技術方法均參照《分子克隆試驗指南》(J.薩姆布魯克等著，科學出版社出版，第三版)。實施例1:本發明所述DNA分子的優化和合成本發明從NCBI數據庫獲得來自于耶爾森氏菌屬-Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica8 081的一段蛋白質序列，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所不，NCBI蛋白序號為G1:123440599。本發明按照大腸桿菌W3110密碼子的偏好性，優化密碼子，通過核酸合成儀合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子，測序驗證該序列的正確性，合成基因酶切位點為Smal/Hindlll。以Smal/Hindlll為插入位點，將其克隆到高拷貝質粒載體PUC57上，以大腸桿菌DH5 a為受體菌株進行擴增。
其中優化、合成工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。實施例2:構建重組質粒pKR-E提取上述大腸桿菌DH5 a中pUC57質粒，Smal/Hindlll雙酶切，50 體系，Tbuffer+BSA,酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，待合適時間取下凝膠，切膠回收目的基因片段，取3iU與已制作好的同樣用Smal/Hindlll雙酶切的pKK223_3質粒I y I混合，力口入高效連接酶4iU制作8iU的連接體系。16°C過夜連接，次日轉化已制作好的大腸桿菌Trans Tl感受態細胞，終濃度100 U g/ml氨芐青霉素LB平板篩選，培養20h后挑單菌落，提質粒用使用HindIII和BamHI雙酶切驗證，見圖3。結果表明，已將所述DNA分子構建至PKK223-3，形成新重組質粒pKR-E，質粒圖譜見圖1。由圖3可知，質粒轉化大腸桿菌能夠提出質粒，酶切條帶位置正確、大小正確，且測序結果與所述DNA分子序列一致，說明該質粒已經構建成功。實施例3:構建重組質粒pKTR-E 提取實施例2中大腸桿菌中的質粒pKR-E做模板，以序列表中SEQID N0:2和SEQ ID N0:3所示引物，擴增目的基因片段，該片段帶有pKTR-E上的一段源于基礎質粒pKK223_3 的 Tac 啟動子序列和 rrnB Tl Terminator>rrnB Terminator 終止子序列。BamHI/SphI酶切擴增產物，取3 u I與已制作好的同樣用BamHI/SphI雙酶切的pKK223_3_thrA’BC質粒Iyl混合，加入高效連接酶4 ii I制作8iU的連接體系。16°C過夜連接，次日轉化已制作好的大腸桿菌Trans Tl感受態細胞，終濃度100 u g/ml氨芐青霉素LB平板篩選，培養20h后挑單菌落，提質粒HindIII酶切驗證，見圖3。結果表明，已將所述片段構建至pKK223-3-thrA’ BC，形成新重組質粒pKTR-E，質粒圖譜見圖2。由圖3可知，質粒轉化大腸桿菌能夠提出質粒，酶切條帶位置正確、大小正確，且測序結果與所述DNA分子序列一致，說明該質粒已經構建成功。實施例4:轉化重組質粒pKR-E至大腸桿菌W3110氯化鈣法制備大腸桿菌W3110感受態細胞，從實施例2中的大腸桿菌Trans Tl感受態細胞中提取質粒PKR-E，轉化W3110菌株，氨芐青霉素濃度100 u g/ml濃度平板篩選，得到MHZ-0212-1大腸桿菌。經PCR和酶切驗證并測序，表明所述重組質粒pKR-E已成功轉入大腸桿菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6689，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。實施例5:轉化重組質粒pKTR-E至大腸桿菌W3110氯化鈣法制備大腸桿菌W3110感受態細胞，從實施例3中的大腸桿菌Trans Tl感受態細胞中提取質粒PKTR-E，轉化W3110菌株，氨芐青霉素濃度100 u g/ml濃度平板篩選，得到MHZ-0212-2大腸桿菌。經PCR和酶切驗證并測序，表明所述重組質粒pKTR-E已成功轉入大腸桿菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6690，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。實施例6:L-蘇氨酸耐受試驗參照實施例4或實施例5的方法，將質粒pKK223-3和質粒pKK223-3_thrA’ BC分別轉化到大腸桿菌W3110中，得到W3110-pKK和W3110-pKT大腸桿菌。
按照《分子克隆試驗指南》配制1.5%瓊脂的M9基本培養基，115°C滅菌20min，分別配制成含 0、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M 的 L-蘇氨酸的培養基，待冷卻到60 °C左右，加入100mg/ml氨芐青霉素使終濃度100 y g/ml，IM的IPTG0.1 u 1/ml，倒平板。菌株培養過夜，稀釋10000倍取100 Ul涂布平板，每12h觀察生長狀況，培養96h菌落生長情況結果見表I。表I各菌種L-蘇氨酸耐受試驗結果
權利要求
1.一種DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種重組質粒pKR-E，其特征在于，由質粒pKK223-3在其Sma I和Hindi II酶切位點間插入如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子獲得。
3.—種重組質粒pKTR-E，其特征在于，由以下方法制備: 以重組質粒PKR-E為模板，用核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的下游引物擴增，BamHI/SphI雙酶切擴增產物，獲得由Tac啟動子、SEQ ID NO:1 所不核苷酸序列的 DNA 分子、rrnB TlTerminator 終止子、rrnB Terminator終止子組成的片段，然后與經過BamHI/SphI雙酶切的質粒pKK223_3_ThrA’ BC連接即得； 其中，所述Tac啟動子、rrnB TlTerminator終止子位于片段兩端,SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子位于Tac啟動子、rrnB Terminator終止子之間，rrnB Terminator終止子位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB TlTerminator終止子之間。
4.一種大腸桿菌，其保藏編號為CGMCC No:6689，由重組質粒pKR-E轉化大腸桿菌W3110獲得。
5.一種大腸桿菌，其保藏編號為CGMCC No:6690,由重組質粒pKTR-E轉化大腸桿菌W3110獲得。
6.保藏編號為CGMCCNo:6689的大腸桿菌在L-蘇氨酸發酵中的應用。
7.保藏編號為CGMCCNo:6690的大腸桿菌在L-蘇氨酸發酵中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子，以及由質粒pKK223-3在其SmaⅠ和HindIⅡ酶切位點間插入所述DNA分子獲得的重組質粒pKR-E和由質粒pKK223-3-ThrA’BC在其BamHI和SphI酶切位點間插入由Tac啟動子、所述DNA分子、rrnB T1 Terminator和rrnB Terminator終止子組成的片段獲得的重組質粒pKTR-E。將本發明所述重組質粒轉入W3110大腸桿菌中獲得兩株具有高L-蘇氨酸耐受活性的菌種，能夠應用于L-蘇氨酸的發酵中。
文檔編號C12N15/70GK103103201SQ20131001162
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月11日 優先權日2013年1月11日
發明者李巖, 宮衛波, 王秋巖, 胡炎華, 胡征宇 申請人:新疆梅花氨基酸有限責任公司