專利名稱：水母雪蓮毛狀根細胞系的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物生物技術領域，尤其涉及一種水母雪蓮毛狀根細胞系。
背景技術：
水母雪蓮是藏藥“恰羔素巴”之正品。主要分布于海拔3900-5600米的高寒冰緣地帶，為青藏高原特有植物品種，是名貴藥用植物，藏醫中用于治療風濕性關節炎、婦科病及高山反應等癥。雪蓮由于其分布區自然條件極為惡劣氣溫低，冷季干旱而漫長，暖季短暫，植物生長季僅90-150天。水母雪蓮一般3-5年才能夠成熟開花，一般高度在30厘米左右，甚至更低。使得水母雪蓮的自然資源極其有限。雪蓮分布的地區植物群落結構簡單，植物的多樣性指數很低，同時由于植物的生物量較低，生態系統一旦破壞將難以恢復。
故為人工栽培水母雪蓮，中國科學院植物研究所的200310121348.8的專利申請中公開了一種水母雪蓮毛狀根培養生產雪蓮多糖類有效成份的方法，該方法是利用發根農桿菌R1601誘導水母雪蓮得到毛狀根，其誘導產生的毛狀根中的多糖含量最高可達毛狀根干重的5-10％，比野生生藥中的0.5％多糖含量高許多。但該方法的培養目的是為了提高水母雪蓮的毛狀根中的多糖含量，而對其中具有藥用的價值的生物堿的含量提高無顯著影響。
農桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，1907年人們發現它是植物致瘤的起因，植物細胞被其侵染后，形成腫瘤。能夠誘發冠癭瘤的稱為根癌農桿菌，誘導毛發狀根的稱為發根農桿菌。受感染的細胞可產生正常細胞所不能產生的生物堿-冠癭堿，被農桿菌利用作為碳源和氮源。
經過持續不斷的基礎研究，直到1974年，發現在根癌和發根農桿菌中分別有一種環型的Ti或Ri質粒，質粒上的一段T-DNA(轉移DNA)包含有生長素基因和細胞分裂素基因，它可以插入植物基因組從而引起細胞特性的變化。由于T-DNA能夠進行高頻率轉移，而且Ti質粒上可插入大到50kb的外源DNA，因此可以利用這種天然的遺傳轉化體系，將外源DNA轉移到植物細胞，并利用植物細胞的全能性，經過細胞或組織培養，由一個轉化細胞再生成完整的轉基因植物。
在迄今發展起來的轉基因技術中，農桿菌介導的遺傳轉化占據主導地位，應用最為廣泛，特別是在雙子葉植物上尤其普遍。近幾年來農桿菌轉化在水稻等谷類作物上取得成功，其應用范圍將進一步擴大。農桿菌介導的優點是轉化頻率高，可轉移較大的DNA片段，所轉移DNA很明確地為T-DNA左右邊界之間的序列，并可直接用不同的植物組織進行基因轉移，不需要原生質體培養再生植株的技術，從而提高轉育周期。
發根農桿菌是一種寄主非常廣泛的土壤細菌，能夠侵染幾乎所有的雙子葉植物和少數的單子葉植物。發根農桿菌的Ri質粒被廣泛的應用于植物基因工程、植物次生代謝產物的生產、植物品種改良和植物的栽培中。其轉化植物產生的毛狀根有如下優點1)毛狀根具有生長迅速，激素自主性，2)可以方便的轉入外源基因，3)Ri質粒轉化的植物的毛狀根分化正常植株的頻率高，倍性穩定，容易建成系列，4)無性系擁有親本特征次級代謝途徑，且次生代謝產物的生產能力高、含量穩定，5)毛狀根來源于一個單細胞，為優良系的篩選提供了極大的方便。
發明內容
本發明的目的在于提供一種水母雪蓮毛狀根細胞系，該細胞系是利用發根農桿菌侵染水母雪蓮并由水母雪蓮外植體上誘導形成毛狀根，從而提高了水母雪蓮毛狀根中的生物堿含量，其含量最高可達毛狀根干重2.1％。
本發明的目的可通過如下措施來實現一種水母雪蓮毛狀根系高原R0405，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市海淀區中關村北一條13號，10080，電話010-62542758)，保藏日期2005年12月05日，保藏號CGMCC No.1557，建議分類命名為Saussurea medusa；該水母雪蓮細胞系具有以下特征此系具有毛狀根的形態，根生長迅速具有多層分枝，能夠在無激素MS培養基上自主生長。生物堿含量高。
本發明的優點及效果由發根農桿菌A4侵染水母雪蓮子葉獲得的發根系能夠在無激素的培養基上自主生長，而且生長速度快，分枝頻率高。使離體培養條件下生物量在一個培養周期內的積累的達到接種量的5-15倍。毛狀根中的生物堿含量，其含量最高可達毛狀根干重的2.1％。這些優點有利于以后的生物反應器培養。有助于水母雪蓮離體條件下的大規模培養來生產有效次生代謝物具體實施方式
以下將參照具體實施例以詳述本發明。
實施例一一種水母雪蓮毛狀根系的誘導與培養方法，其包括如下步驟(1)取無菌水母雪蓮種子，接種至幼苗培養基進行幼苗培養，獲得無菌幼苗；(2)以所述步驟(1)獲得的無菌幼苗的子葉作為外植體放入預培養基中進行暗培養；(3)將所述步驟(2)中進行預培養的子葉外植體經發根農桿菌A4的介導進行轉化；(4)將所述步驟(3)介導轉化后的子葉外植體再放回所述步驟(2)的預培養基中進行共培養；(5)將所述步驟(4)進行暗培養的子葉外植體放入抑菌培養基中進行抑菌繼代培養，直至在外植體上形成毛狀根；(6)將所述(5)抑菌培養的具有毛狀根的外植體放入毛狀根擴增培養基中進行毛狀根的擴大培養。
所述步驟(1)的幼苗培養是將無菌水母雪蓮種子置于無激素的MS培養基中、20-25℃下培養。。
所述步驟(2)的子葉外植體在預培養基中進行的暗培養是將外植體放入預培養基在20-25℃下培養24-48h；所述的預培養基包括下述含量的組份MS基本培養基、2.0-10mg/L生長素、0.2-1mg/L細胞分裂素。
所述的步驟(3)中的預培養子葉外植體經發根農桿菌的介導轉化是將預培養后的外植體浸入發根農桿菌A4菌液中，浸泡6-12min，以進行介導轉化。
所述的發根農桿菌液是將發根農桿菌A4菌株置入YEP液體培養基中，在25-29℃、180r/min轉速下培養過夜；然后將菌液進行離心分離棄上清液，用無激素MS培養基重懸浮并稀釋到OD＝0.4-0.8，所述OD值為農桿菌菌液在260nm光波下的光吸收值。
所述的步驟(4)中的介導轉化后的子葉外植體的共培養是將介導轉化的外植體放入預培養基中在25-29℃下培養24-48h；所述的預培養基包括下述含量的組份MS基本培養基、2.0-10mg/L生長素、0.2-1mg/L細胞分裂素。
所述的生長素選自2，4-D、NAA、IAA中的一種。
所述的細胞分裂素選自6-BA、KT、ZT中的一種。
所述的步驟(5)將介導轉化的子葉外植體進行暗培養后的外植體再進行抑菌繼代培養是將介導轉化的子葉外植體進行暗培養后的外植體放入抑菌培養基中于20℃±5℃、24-48h黑暗中進行至少五次的繼代抑菌培養，直至將菌除凈。
所述的抑菌培養基包括下述含量的組份無任何激素的MS基本培養基、第一抗菌素400-600mg/L。
所述的第一抗菌素選自頭孢唑啉鈉、頭孢拉啶中的一種。
所述的步驟(6)中將具有毛狀根的外植體放入毛狀根擴增培養基中進行毛狀根的擴大培養是指將抑菌培養的具有毛狀根的外植體放入毛狀根擴增培養基中，20℃±5℃、24-48h黑暗中進行毛狀根擴大培養。
所述的毛狀根擴增培養基包括下述含量的組份MS基本培養基、第二抗菌素400-600mg/L。
所述的第二抗菌素選自羧芐青霉素、羧茚青霉素中的一種。
所述的抑菌培養基和毛狀根擴增培養基中還包括下述含量的組份水解酪蛋白250-350mg/L、肌醇100-300mg/L、Vc 1-3mg/L、檸檬酸2-6mg/L、蔗糖濃度3-8％、瓊酯粉0.2-0.8％。
其更具體的實施方式如下水母雪蓮毛狀根細胞系的制備方法，包括如下步驟(1)將水母雪蓮的種子滅菌，于超凈工作臺上接種到無激素MS培養基中，20℃培養獲得無菌幼苗；(2)取水母雪蓮的無菌幼苗，將無菌幼苗、子葉、葉柄和胚軸剪成1cm左右的小段，轉入預培養基中20℃暗培養2天；所述預培養基包括下述含量的組份MS培養基、2.0mg/L 2，4-D生長素、0.2mg/L細胞分裂素，(3)將預培養2D的水母雪蓮的各種外植體浸入發根農桿菌液中，浸泡8min，將預培養的外植體經發根農桿菌A4菌株的介導進行轉化，然后在無菌濾紙上吸去多余的菌液；(4)介導轉化后的外植體再放回原來的預培養基中，28℃暗培養2天；(5)將暗培養2D后的外植體轉接到附加了500mg/L頭孢唑啉鈉(cef)的MS無激素培養基中，進行抑菌抑菌繼代培養；隔2天轉接一次，5次后，將轉接周期適當延長，直至將菌除凈；(6)將所述(5)抑菌培養的具有毛狀根的外植體放入附加了500mg/L羧芐青霉素(car)的MS無激素培養基上進行毛狀根的擴大培養。
其中，所述的發根農桿菌液的制取如下挑取發根農桿菌的單菌落接種于YEB液體培養基中，28℃、180r/min培養過夜。將菌液于離心管中4000r/min離心10min。棄上清，用無激素MS液體培養基重懸浮并稀釋到OD＝0.6。
其中MS培養基中的各元素的含量如下(mg/L)MgSO4·7H2O 370 CaCl2·2H2O 440KNO31900 NH4NO31650 KH2PO4170FeSO4·7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3 MnSO4.4H2O 11.2ZnSO4·7H2O 4.3 CuSO4.5H2O 0.0125KI 0.42H3BO33.1 Na2MoO4.2H2O 0.125CoCl2.6H2O 0.0125Glycine1 VB6-0.25VB10.05 Nicotinicacid 0.25在外植體預培養、抑菌培養及擴增培養過程中所用培養基中蔗糖濃度為3％-8％范圍內，水解酪蛋白300mg/L，肌醇200mg/L，Vc 2mg/L，檸檬酸4mg/L，PH5.8，瓊脂粉約0.5％。20℃±1℃黑暗中培養。
所述的YEB培養基作為發根農桿菌培養基，其中的各元素的含量如下(mg/L)蛋白胨(peptone) 5000酵母提取物(yeast extract powder) 1000牛肉浸膏(Beef Extract) 5000MgSO4·7H2O 495PH 7.0經過上述的誘導培養步驟后，水母雪蓮的各種外植體在附加抗生素cef的無激素的MS培養基中培養，子葉外植體上愈傷組織然后再在愈傷組織上形成毛狀根，而葉柄和胚軸外植體多直接形成毛狀根。毛狀根生長至1-2cm時，將其切下繼續接在無激素的MS培養基中培養，毛狀根能夠在無激素培養基上自主生長。在培養過程中抗生素cef有利于外植體先形成愈傷組織和毛狀根的分化，但不利于毛狀根的生長和分枝。而在附加了car的MS無激素培養基上毛狀根能夠迅速生長和分枝。
對篩選出的根系進行PCR檢測和農桿堿電泳檢測，以確定T-DNA的插入。
經上述方法誘導培養10-14天后，各外植體均在切口處產生愈傷組織。約3周后開始一些外植體上出現根。之后形成根的外植體和根的數量不斷增多。每塊外植體上根的數量從1到30條不等。以毛狀根的誘導率為標準，選擇出水母雪蓮毛狀根誘導的最適條件以水母雪蓮子葉為外植體，發根農桿菌菌液的濃度為OD＝0.6，毛狀根的誘導率是78.7％。得到的毛狀根具有不同的分枝和生長狀況。在進行毛狀根培養研究的過程中發現在附加了cef的培養基上毛狀根只伸長極少分枝，而且毛狀根隨著生長只有剛伸長的部分保持良好的生長狀態，其余的逐漸褐化。當毛狀根轉接到附加了car的無激素培養基則生長迅速且分枝多。
對毛狀根系進行PCR檢測。根據T-DNA區的ROL基因序列分別設計RolA、RolB、RolC基因的引物，通過擴增得到相應分子量的特異條帶。證明了T-DNA插入水母雪蓮基因組誘導形成毛狀根的可能性。
對毛狀根提取物進行農桿堿電泳檢測，毛狀根樣品中出現水母雪蓮原植物中沒有的斑點。說明農桿菌基因已經整合到植物基因組中并表達。
權利要求
1.一種水母雪蓮毛狀根細胞系R0405，其保藏號為CGMCC No.1557。
全文摘要
本發明涉及一種水母雪蓮毛狀根細胞系R0405，其保藏號CGMCCNo.1557；本發明的水母雪蓮毛狀根細胞系能夠在無激素培養中自主生長，而且毛狀根中的生物堿含量得到提高，可達到干重的2.1％。將有利于離體培養條件下生產目的產物研究，并有助于下一步解決天然雪蓮資源匱乏的問題的研究。
文檔編號C12N5/04GK1966673SQ20051002279
公開日2007年5月23日 申請日期2005年12月30日 優先權日2005年12月30日
發明者王莉, 李毅 申請人:中國科學院西北高原生物研究所