一種雪蓮細胞系的制作方法

專利名稱：：一種雪蓮細胞系的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種雪蓮細胞系，本發明還涉及該細胞系的制備方法及其培養物的大規模生產方法。
背景技術：
：雪蓮是高山地區的民間藥用植物，用于散寒除濕、活血通經、抗炎鎮痛等，民間多用于風濕性關節炎、婦女小腹冷痛、閉經，胎衣不下、麻痹不透、肺寒咳嗽、陽痿、高山不適應癥等癥的治療。近年來，雪蓮作為民族藥在抗炎鎮痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌細胞增生方面的作用倍受關注。但我國雪蓮主要分布在4000m以上的高原寒帶地區，如新疆、甘肅、四川、云南和西藏。這些地區氣候多變，冷熱無常，最高月平均氣溫3-l(TC，最低月平均氣溫則在零下十幾度到幾十度，生長環境十分惡劣，只有耐寒的苔草屬、蒿草屬以及少數高山多年生草本植物與之伴生，一般在此環境下的雪蓮植物大多為多年生，生長緩慢，人工栽培困難，長期以來掠奪性釆挖已使雪蓮資源嚴重匱乏，已使得雪蓮成為瀕危物種，自然資源難以滿足臨床日益增長的需要。因此應用細胞培養的方法進行雪蓮的開發即可以滿足臨床對雪蓮藥物的需求，也可以保護自然資源，維護生態環境。申請號為00123739.X和00123740.3的中國專利分別公開了兩種水母雪蓮高產細胞系，黃酮含量分別占到細胞干重的6.9%和6.23%。但還沒有有關進一步提高黃酮含量的報道。另外，雪蓮細胞系在放大過程中不穩定，當放大培養到一定規模后有效成分的含量會降低，目前還沒有解決上述問題的有效手段。
發明內容本發明的第一個目的在于提供一種高產黃酮的雪蓮細胞系。本發明以新疆雪蓮(其種胚、根、莖、葉，或者由種子萌發的無菌苗)作為外植體，誘導愈傷組織，并進行反復繼代培養，得到四種新疆雪蓮細胞系白色系、黃色系、綠色系和紫紅色系；對4種細胞系分別進行繼代培養，通過對其生長速度、總黃酮化合物含量的檢測，確定紫紅色細胞系為長勢較好，總黃酮化合物含量最高的細胞系。從分離的細胞系中選擇顏色鮮艷呈紫紅色、結構致密、團粒狀的培養物，即為本發明細胞系。本發明進一步對獲得的紫紅色細胞系進行繼代培養和篩選，綜合考察有效成分的含量以及生長特征，最終獲得了可以無限傳代培養的穩定高產雪蓮細胞系Sau-l,該細胞系已于2008年5月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京巿朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)，保藏號為CGMMCCNo.2506，分類命名為天山雪蓮(Smmwraz'wvo/wcrafe)(新疆雪蓮即為天山雪蓮)。該雪蓮細胞系具有以下特征生長旺盛、顏色鮮艷、呈紫紅色，結構致密、呈團粒狀，質地均勻、略偏硬，黃酮化合物含量為培養物干重的8-12%，培養周期10-14天。具體地說，可通過如下方法制備得到上述細胞系(1)新疆雪蓮無菌苗的培育取天然新疆雪蓮的種子，已通過中國科學院研究所標本館(國家植物標本館)鑒定，先用75%酒精浸泡10-30s，然后用1%氯化汞溶液消毒8-12min,再用無菌水反復沖洗4-5次，最后放在無菌濾紙上吸干種子表面水分，用無菌鑷子接種在1/2MS(配方見附表1)中添加0.5-3mg/LGA(赤霉素)、10-30g/L蔗糖、0.6g/L瓊脂的固體培養基上，22-27。C光照培養，約IO天種子即可萌發長出無菌苗。(2)愈傷組織的誘導和培養取無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽做外植體，在無菌條件下，用無菌手術剪刀和無菌鑷子將無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽切成2-5mm長的小段，接種在MS(配方見附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-芐基嘌呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L瓊脂及30g/L蔗糖的固體培養基上，22-27。C暗培養，7-10天誘導出愈傷組織。(3)愈傷組織的繼代篩選本發明通過對雪蓮愈傷組織的誘導和培養得到了四種新疆雪蓮細胞系白色系、黃色系、綠色系和紫紅色系；對4種細胞系分別進行了繼代培養，通過對其生長速度、總黃酮化合物含量的檢測，確定紫紅色細胞系為長勢較好，總黃酮化合物含量最高的細胞系。選取紫紅色細胞系為原始細胞系，用目測法從固體培養基中挑選顏色較深、色彩鮮亮的紫紅色愈傷組織在在MS(配方見附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-節基喋呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L瓊脂及30g/L蔗糖的固體培養基上繼續繼代培養。為更好的優化種子、純化細胞系，繼代時接種塊大小控制在3mm以下。如此反復，對所選擇細胞系逐步馴化，本發明經過近IOO代篩選獲得了可以無限傳代培養的穩定高產雪蓮細胞系Sau-l。本發明的第二個目的在于提供上述雪蓮細胞系的繼代培養方法，其所用培養基為MS培養基(配方見附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-節基喋呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L瓊脂及30g/L蔗糖，pH值5.2-5.8,接種塊為4-6mm,培養條件溫度22-27。C,光照10-12小時，培養時間1520天。繼代時選擇生長旺盛、顏色鮮艷、呈紫紅色，結構致密、呈團粒狀，質地均勻、略偏硬為特征的培養物繼代。此外還對培養物的黃酮、綠原酸、異綠原酸以及紫丁香皂甙含量進行考察，選擇綜合性狀好的培養物繼代。本發明的第三個目的在于提供一種大規模生產上述細胞系培養物的方法。本發明方法將液體搖床培養與固體培養相結合，包括如下步驟l)采用液體搖床培養的方法制種；2)將步驟1)得到的種子用于固體培養；3)選擇步驟2)培養物中生長旺盛、顏色鮮艷、紫紅色特征的培養物留種，用于步驟l)的搖床培養，其余收獲，得培養物。具體地說，可采用如下方法進行大規模生產用高產雪蓮細胞系Sau-l做種子，于裝有150mL液體培養基的500mL培養瓶中懸浮培養，液體培養基為MS培養基(配方見附表1)添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-節基喋呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)及30g/L蔗糖，pH值5.2-5.8,接種量3-6%(W/V,g.fW/ml)，培養條件溫度為22-27"C，搖床轉速100-120rpm，培養時間8-10天，光照10-12小時、20001ax。從液體培養基中挑選生長旺盛、顏色鮮艷、呈紫紅色，分散性好、顆粒均勻、無污染的細胞團作生產用種，將其轉移到固體培養基上培養，注意剔出顏色發暗、發白的細胞團，接種的細胞團大小為4-6mm，固體培養基為MS培養基(配方見附表1)添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-節基P票呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L瓊脂及30g/L蔗糖，pH值5.2-5.8;培養條件溫度22畫27。C，光照10-12小時、20001ax,培養時間15-20天。在利用生產用種進行大規模生產的同時，根據生產量大小，可以從中選擇生長旺盛、顏色鮮艷、呈紫紅色，結構致密、呈團粒狀，質地均勻、略偏硬為特征的愈傷組織留種，再進行液體搖床培養制種，選種量一般不超過總生產量的15%,其余收集并低溫真空干燥即得雪蓮細胞培養物干品，如此反復。此外上述方法中液體培養和固體培養可同期進行，這樣可以將生產周期縮短為15~20天。在生產過程中還可以對培養物的黃酮、綠原酸、異綠原酸以及紫丁香皂甙的含量進行考察，選擇綜合性狀好的培養物留種。本發明細胞系具有高含量的有效成分，可用于制備食品、保健食品以及藥品。本發明細胞系可用于雪蓮細胞培養物的大規模生產，不僅滿足了臨床需求，而且保護了國家珍稀植物野生雪蓮。本發明的優點主要體現(1)本發明提供的細胞系黃酮含量高，雪蓮總黃酮含量占培養物干重的8-12%，高效液相指紋圖譜顯示，培養物中所含成分與野生雪蓮基本相同。(2)生長旺盛，培養周期短，15-20天。(3)穩定性高，可無限傳代。(4)通過本發明方法可進行大規模生產，與野生型相比生產周期大大縮短，并且所生產的培養物質量穩定產量高。(5)本發明方法不占耕地，不破壞雪蓮野生資源，保護了生態環境，解決了新疆雪蓮資源短缺的問題。圖1本發明細胞質譜分析HPLC譜圖。具體實施例方式下面結合實施例進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。實施例l新疆雪蓮紫紅色細胞系的獲得取天然新疆雪蓮的種子，先用75%酒精浸泡10-30s，然后用1%氯化汞溶液消毒8-12min，再用無菌水反復沖洗4-5次，最后放在無菌濾紙上吸干種子表面水分，用無菌鑷子接種在1/2MS(配方見附表l)中添加2.5mg/LGA(赤霉素)、30g/L蔗糖、0.6g/L瓊脂的固體培養基上，25。C光照培養，約IO天種子即可萌發長出無菌苗。取無菌苗胚芽做外植體，在無菌條件下，用無菌手術剪刀和無菌鑷子將無菌苗胚芽切成2-5mm長的小段，接種在MS(配方見附表1)中添加0.4mg/L6-BA(6-節基喋呤)、3mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L瓊脂及30g/L蔗糖的固體培養基上，25。C暗培養，8天誘導出愈傷組織。本發明通過對雪蓮愈傷組織的誘導和培養得到了四種新疆雪蓮細胞系白色系、黃色系、綠色系和紫紅色系；對4種細胞系分別進行了繼代培養，通過對其生長速度、總黃酮化合物含量的檢測，確定紫紅色細胞系為長勢較好，總黃酮化合物含量最高的細胞系。用無菌苗的根、莖、葉以及子葉也均能獲得上述紫紅色細胞系，優選釆用莖。選取紫紅色細胞系為原始細胞系，用目測法從固體培養基中挑選顏色較深、色彩鮮亮的紫紅色愈傷組織在MS(配方見附表1)中添加0.5mg/L6-BA(6-節基嘌呤)、4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L瓊脂及30g/L蔗糖的固體培養基上繼續繼代培養。培養條件為25°C,光照10-12小時、20001ax。為更好的優化種子、純化細胞系，繼代時接種塊大小控制在3mm以下。如此反復，對所選擇細胞系逐步馴化，本發明經過近IOO代篩選獲得了可以無限傳代培養的穩定高產雪蓮細胞系Sau-l,該細胞系生長旺盛、顏色鮮艷、呈紫紅色，結構致密、呈團粒狀，質地均一、容易分離；其高效液相指紋圖譜(圖1，鑒定結果見表l)與野生雪蓮基本吻合，并且綠原酸、異綠原酸的含量均高于野生雪蓮；雪蓮總黃酮含量為細胞干重的8-12%。表HPLC鑒定結果表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例2液固交替生產方法1、液體搖床培養制種1.1選種選取培養10-14天，長勢較好，顏色鮮艷，呈紫紅色，顆粒均勻，質地均一，容易分離的本發明細胞系Sau-l培養物作種子。1.2培養基配制采用500ml培養瓶，每瓶裝120-150ml培養液，培養液成分為MS(配方見附表l)中添加0.4mg/L6-BA(6-節基嘌呤)、3mg/LNAA(萘乙酸)及30g/L蔗糖，pH值為5.5;高溫滅菌121°C,20min。1.3接種無菌條件下，將培養物用鑷子夾碎后接種到裝有120-150ml培養液的500ml培養瓶中，接種量5。/。(W/V,g.fW/ml)。1.4搖床培養培養條件培養溫度為25。C，搖床轉速110rpm，培養時間9d,光照llh、20001ax。培養過程中，多觀察，發現染菌立即挑出。2、固體培養2.1液態種子的選取用顯微鏡觀察檢測，選取顏色鮮艷、呈紫紅色、長勢較好、分散性好、顆粒均勻無污染的培養物作生產用種。2.2培養基MS(配方見附表l)中添加0.3mg/L6-BA(6-芐基嘌呤)、3mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L瓊脂及30g/L蔗糖的固體培養基。2.3接種無菌條件下，將培養瓶中的培養液濾除，將培養物轉移到墊有無菌濾紙的無菌培養皿中，挑取生長旺盛、顏色鮮艷、呈紫紅色，分散性好、顆粒均勻、無污染的細胞團轉接至固態培養基上，接種塊大小為4國6mm。2.4固體培養培養溫度25°C，光照llh、20001ax;培養周期15天。3培養物的收集及循環生產3.1留種大規模生產的同時，可以從中選擇生長旺盛、顏色鮮艷、呈紫紅色，結構致密、呈團粒狀，質地均勻、略偏硬為特征的愈傷組織留種，用于步驟l的液體搖床培養，選種量以不超過總生產量的15%為宜。3.2培養物的收集收集剩余培養物，低溫真空干燥，即可。根據需要，可以將干燥的培養物磨成粗粉或細粉，或者用來提取黃酮及其他活性成分。經測定，用此方法進行的大規模生產成本較低，培養物生長速率快，產量可達20-25g干重/月/升培養基；干品培養物中總黃酮含量高，達培養物干重的8-12%,并且培養物質量穩定。以上給出了本發明較佳的實施方式，本領域技術人員很容易想到釆用類似的方法對本發明的條件進行替換，例如將繼代培養所用的激素替換成類似功能的激素，將所用的培養基替換成類似功能的培養基，將培養條件作修改，然而，這些改動沒有改變本發明的實質,因而均屬于本發明的范圍之內。_附表1培養基配方_成分名稱分子式分子量~~MS(mg/L)1/2MS(mg/L)KN0310U11900950NH4N0380.041650825KH2P04136.0917085MgS04.7H20246.47370185CaCl2.2H20147.02440220KI166.010.830.83H3B0361.836.26.2MnS04.4H20223.0122.322.3ZnS04.7H20287.548.68.6氫鉀銨二鎂鉤鉀錳鋅酸酸酸酸化化酸酸酸硝硝磷硫氯砩硼硫硫<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求1、一種新疆雪蓮紫紅色細胞系，其通過如下方法制備獲得采用新疆雪蓮的種胚或由種子萌發的無菌苗為外植體，經誘導愈傷組織并進行反復繼代培養，從分離的細胞系中選擇顏色鮮艷呈紫紅色、結構致密、團粒狀的培養物，即得。2、如權利要求1所述的細胞系，其為天山雪蓮(5"aMMwefl/"vo/wcrafe)Sau-l保藏號為CGMCCNo.2506。3、由權利要求l或2所述細胞系獲得的培養物。4、權利要求1或2所述細胞系的繼代培養方法，其特征在于，所用培養基為含有0.1-0.5mg/L6-BA和l-5mg/LNAA的MS培養基，培養溫度為2227°C,1520天繼代一次。5、如權利要求4所述的繼代培養方法，其特征在于，繼代時選擇生長旺盛、顏色鮮艷呈紫紅色、結構致密、團粒狀結構明顯的培養物繼代。6、如權利要求5所述的繼代培養方法，其特征在于，繼代時還包括對培養物中黃酮、綠原酸、異綠原酸以及紫丁香皂甙含量進行考察，選擇綜合性狀好的培養物繼代。7、權利要求3所述培養物的大規模生產方法，其步驟包括1)將權利要求1或2所述細胞系釆用液體搖床培養的方法制種；2)將步驟l)得到的種子用于固體培養；3)選擇步驟2)培養物中生長旺盛、顏色鮮艷、紫紅色特征的培養物留種，用于步驟l)的搖床培養，其余收獲，得培養物。8、如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟l)液體搖床培養所用培養基為添加0.1-0.5mg/L6-BA和l-5mg/LNAA的MS液體培養基，接種量3-6%，培養條件pH值為5.2-5.8，培養溫度為22-27°C，搖床轉速100畫120rpm，培養8-10天，光照每天10-12小時、20001ax。9、如權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟2)固體培養選擇顏色鮮艷、呈紫紅色、長勢良好、分散性好、顆粒均勻、無污染的培養物作種子進行固態培養生產，接種到含0.1-0.5mg/L6-BA和l-5mg/LNAA的MS固體培養基上，，接種塊為4-6mm,培養條件溫度22-27。C，光照每天10-12小時，培養15~20天。10、如權利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，還包括對培養物的黃酮、綠原酸、異綠原酸以及紫丁香皂甙含量進行考察，選擇綜合性狀好的培養物留種。11、權利要求1或2所述細胞系在制備食品、保健食品、保健品和藥品中的應用。12、權利要求3所述培養物在制備食品、保健食品、保健品和藥品中的應用。全文摘要本發明提供了一種穩定、高產黃酮的新疆雪蓮紫細胞系Sau-1CGMCCNo.2506，黃酮化合物含量可達培養物干重的8-12％，是野生天然雪蓮的7-10倍。本發明還提供了一種該細胞系的培養技術及大規模快速生產該細胞系培養物的方法，該方法采用液-固培養相結合，通過液體培養制種，固體培養得到培養物，從中選擇綜合性狀好的留種用于液體培養，如此反復。該方法可用于大規模生產，與野生型相比生產周期大大縮短，并且質量穩定，產量高。此外，該方法不占耕地，不破壞雪蓮野生資源，保護了生態環境，解決了新疆雪蓮資源短缺的問題。文檔編號C12N5/04GK101338298SQ20081013423公開日2009年1月7日申請日期2008年7月23日優先權日2008年6月10日發明者劉漢石申請人:大連普瑞康生物技術有限公司