專利名稱：鑒定黨參品種的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、基因組學、生物技術以及中藥鑒定領域。
背景技術：
根據中國藥典(2000年版)黨參為桔梗科植物黨參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.，川黨參Codonopsis tangshen Oliv.和素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen的干燥根。其性味甘平、無毒，有補中益氣，健脾益肺功效。主治脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內熱消渴等癥，是我國傳統的補益藥。但在市場上也常見到管花黨參Codonopsis tubelosa Kom.，新疆黨參Codonopsis clematidea(Schyenk)C.B.Cl.，灰毛黨參Codonopsiscanescens Nannf.和球花黨參Codonopsis subglobosa W.W.Sm作為黨參代用品及同科植物金錢豹Campanumoea javanica Blume ssp.japonica(Makino)Hong和桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.作為偽品被出售。在香港，黨參通常是以商品名板黨、防黨和紋黨出售。但來源、規格不同，價格差別很大，以劣充優常見。另外，一種外表涂有紅色物質的黨參首次被發現在香港市場上，商家用其為止泄目的。為安全用藥，我們通過5S rDNA基因測序技術及配合形態學、組織學、HPLC-UV、以及X-Ray衍射技術，對藥材本身及外表物質進行了深入、詳細研究。結果發現，這種紅色黨參其植物來源為素花黨參。由于地理環境，種植方法，生長狀況及加工工藝等方面的變化對黨參藥材自身的品質、藥物中間體及中成藥的質量帶來了很大影響。黨參藥材傳統的鑒別方法主要以形態、顯微為主。化學方面至今沒有人發現一個可以用來作為鑒定標記的化合物。據現有資料顯示，黨參目前多采用對照藥材作為對照進行鑒定，至今未得到適當的對照品。
如何快速、準確鑒定黨參來源及各種規格、真偽和品質，從黨參產品中探測目標黨參成份的存在，對黨參市場實行切實有效的質量監控和品質評價是中藥現代化的重要課題之一。開發分子技術監控中藥質量雖然剛剛起步，但已展示出它的廣闊應用前景。在大多數真核生物中，核糖體5S rDNA基因是串聯重復的多拷貝基因，它們獨立存在，并不與主體RNA(18S-5.8S-28S rDNA)相連，在生物體內含量豐富，廣泛分布，被稱為生物體內的活化石。在高等植物中，5S rDNA基因的每個重復單位由轉錄區和轉錄間隔區(Non transcribed spacer，NTS)組成，轉錄區高度保守，而轉錄間隔區有較大變異，這種高度保守性與變異性的統一，使得5S rDNA基因序列成為研究真核生物中多拷貝基因的分子形成和演化的有用標記。本發明正是利用5S rDNA序列的差異鑒定黨參品種或辨別其真偽。為有效控制原料來源及生產過程中的不穩定因素，從基因組學著手，以鑒定黨參品種藥材的來源、真偽、優劣及更好地控制中成藥的產品質量，從而為制藥行業提供科學合理的指導，提高藥品的安全有效性。
發明內容
A提供黨參藥材的5S rDNA序列。
B利用5S rDNA序列鑒定石斛的品種及辨別真偽的方法。
為達到本發明的目的，發明人從全國不同省份收集了25份樣品，包括7個市場常見黨參品種、3個商品黨參、3個特別商品黨參和2個偽品品種。所有樣品均經過專家鑒定。所測得的25個樣品的5SrDNA序列如下A.黨參7個種共計17個樣品
(1)黨參 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號CMED-0038-04)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCCGTCAACTCCC CTCCTCTTTA TTCTTTGTAC TATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAACCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACGCTGAGTAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(2)黨參 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號CMED-0038-05)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCCGTCAAGTCCC CTCCTCTTTA TTGTTTGTAC TATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCACAC GCGCCCAAAACCGAGCAAAA TGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACGCTGAGTAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(3)黨參 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號CMED-0038-08)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATCCACCCGTCAACTCCC CTCCTCTTTA TTCTTGGTAC TATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTAT GACTGCTGAC GCGCCCAAAAGCGAGCAAAA CGTGCTTTTC GCGCTCTTAA TTATTGTACGGTGAGCAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(4)黨參 Codonopsis pilsula(Franch.)Nannf.樣品(編號CMED-0038-12)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCAG GGAAGTGCTG GTATGCACCGGTCAAGTCCC CTCCTCTTTA TTCTTTGTAA CATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAACCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTGT TTAATGCGCG
CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(5)素花黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-0093-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT ACTCAGCGTA CATTAAGAAACCATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCGTGAGCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA GAGATAGTACAAAAGAATAA AGAGGAGGGA AGTTGACGGG(6)素花黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-0093-03)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCAGCCCCCTTTTGC TCTTTTTTTT AATCAGCGTA CATTAACAAACCATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT ACGCGCGTCAGCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA CACATAGTACAAAAGAATAA AGAGGTGGGA AGTTGACGGG(7)素花黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-0093-04)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTT TACTCAGCCT ACTTTAAGAAACCATATAAA AGAAAGAAAA TCCTCGGTTT TGGGCGCGTGAGCAGTCAA AACGACCTTC TCGCGCTCTT TAGAGATAGTTCAAAAGAAT AAAGAGGAGG GAAGTTGACG GG(8)素花黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-0093-05)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TATTTTTTTT ACTCTGCCTA CATTAAGAAACGATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGAGTCA
GCAGTCAAAA GGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATTGTACAAAAGAATAA AGCGGAGGGA AGTTGACGGG(9)川黨參 Codonopsis tanghshen Oliv.樣品(編號CMED-0101-01)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTCAACTCCCCCCCCTTTTG CTGTTTTGTT TTACTCAGCG TACATTAAGAAACCATATAA ACTGCTCACG CGCTCAAAAC CGGGCATTTTCTTTCTCATA AACGACCTTC TAGTACGCTC TTTAGAGATAGTACAAAAGA ATAAAGAGGA GGGAAGTTGA CGGG(10)川黨參 Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號CMED-0101-02)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAACCCCTC GTCAAGTCCCCCCCCTTTTG GTGTTTTGTT TTACTCACCG TACATTAAGAAACCTTATAA AGTGCTCACG CGGTCAAAAC CGGCCATTTTCTTTCTCAAA AACGACCTTC TAGTACGGGC TTTAGAGATACTACAAAAGA ATAAAGAGCA GGGAAGTTGA CGGG(11)川黨參 Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號CMED-0101-05)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGGCCCCCTG GCAAGTCCTC GTCAAGTCCCCCCCCTTTTG GTGTTTTGTT TTTCTCAGCG TACGTTAAGAAACCATATAA AGGGCTCACG CGGTCAAAAC CGGGCGTTTTCTTTCTAATA AACTGCCTTC TAGTAGGCTC TTTAGACATAGTAGAAAAGA ATAAAGAGCA GGGAAGTTGA CGGG(12)管花黨參 Codonopsis tubelosa Kom.樣品(編號CMED-0102-01)5S rDNA序列CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCGA GCATTTTTCTTTCTTTTATA CTGGTTTCTT AATGTACGGT GAGTAAAAAA
ACAGCAAAAG GGGGGGTGCA ACACGAGGTT CCCAGGGGGTCACCCATCCT AATACTACTC TCGCCCTCAT TTGAGTTCGTACAAAACGAC CATATGGGAG AGGAGTTGAC GGG(13)管花黨參 Codonopsis tubelosa Kom.樣品(編號CMED-0102-02)5S rDNA序列CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCTA GCATGTTTCTTTCTTTTATA CTGTTTTCTT ACTGTACGGT GACTAAAAAAACAGCTAAAG GGGGGGTGCT ACACGAGGTC GCCAGGGGGACACGCATCCT AATACGACTC TCTCCCTCAT TTTAGTTCGTACAAAACTAC AAAAAGGGAG AGAAGTTGAC GGG(14)新疆黨參 Codonopsis clematidea(Schyenk)C.B.Cl.樣品(編號CMED-0109-01)5S rDNA序列CTAGGATGGT CGACCATATG GGAAAGCTTC GCGTTTTTCTCCCTTTTTGA GTTTTTTTTA GTGTCACCTA AATAAGGAAACCATTAAAAG AAAGAAACTA CACGAGGTTT TGGGGCCGTTATCCGCTCAC AAACTATTCT GGCATTCGTT TGGGATAGCATAAAAGACTA AAGCCGGGGG GAGTTGACGG G(15)灰毛黨參 Codonopsis canescens Nannf.樣品(編號CMED-0110-01)5S rDNA序列CTAGGACGCG GGAATTCGAG AAGAGTGCTG GTATGATCGCACCCGCTGTT TTTTTTCCTC TTTATTCTTT TGTACTATCTCTAAAGAGCG CGAGAAGGTC CGGTTTTGAC TTCTCACGCGCCCAAAACAA AACGAGCTTT TTGCCTTTCG TTTGAGACGGTATAAAAGTA CGCTGAGGAG GGGAGTTGAC GGG(16)球花黨參 Codonopsis subglobosa W.W.Sm樣品(編號CMED-0107-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTATGCACCC
GTTAACCCCC CCTTTTTTTG TTTTTTTTAC TATCTCTACGTTAAGAAAAT GCTCGGTTTG ACTGCTCATG GGCGCGTGAGCAGTCAAAAC GACCTTCTCG CGCTCTTTAG AGATATGTACAAAAGAATAA AGAGGAGGGG AGTTGACGGG(17)球花黨參 Codonopsis subglobosa W.W.Sm樣品(編號CMED-0107-02)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGTCCCCCTG GGAAGACCTC GTATGCACCCCCTAACCCCC CCTTTTTTTG TTTTTTTTAC TATCGCAACGTTAAGAAAAT GCTTCCTTTG ACTGCTGATG GGCGCGTCAGCAATCAAAAC GTCCTTCTCG CGCACTTTAG AGATATGGACAAAAGAATAA AGAGGACGGG TGTTGACGGGB.商品黨參3個樣品(18)板黨 Radix Codonopsis樣品(編號CMED-DS-8-DFH)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTTTTA GTCAACTATGCCCGCTTTTG CTGTTTTGTT TTCCTCAGCG TTCTTTAAGAATCCATAAAG ACTGCTCACG GGCTCAAAAC CGGGCATTTTCTTTCCCAAA ACCGAGCTTC TAGTTCGCTC TTTAGAGATAGTACAAAAGA ATAAAGAGGA GGGAAGTTGA CGGG(19)防黨Radix Codonopsis樣品(編號CMED-DS-9-YH)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAATCTTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT ACTAAACGGA CATTAAGAAGCGAATAAAAG AAAGAAAATG CTCGGTTTTG AGCGCGAGAGCAGTCAAAAA GAACTTCTCG CGGTTGTTTG AGATAGTATAAAAGAATAAA GAGGAGGGAA GTTGACGGG(20)紋黨 Radix Codonopsis樣品(編號CMED-DS-10-YRS)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGACTCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT ACTCACCGTA CATTAAGAAACCATATAAAA GAAAGAAAAA TGCTCGGTTT TGGGGCCGTGAGCAGTCAAA ACGACCTTCT GGCGCTCGTT TGAGATAGTACAAAAGAATA AAGAGGAGGG GAGTTGACGG GC.特別商品紅黨參3個樣品(21)紅黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-DS-7-XH)5S rDNA序列CTAGGATGGA TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCCTTTTG GTGTTTTTTT TACTCTGCGT ACATTAAGAAACGATATAAA AGAAAGAAAA TGCTGGGTTT TGGGCGCGTGAGCAGTCAGA ACGACCTTGT CGCGCTCTTT AGAGATAGTACAAAAGAATA AAGAGGAGGG GAGTTGACGG G(22)紅黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-DS-11-WYT)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCGTC GTGTTGCACCCCCCCTTTTG CTGTTTTTTT TACTGAGCGT ACATTAAGAAACCATGTAAA AGAAAGAAAA TGCTCGGTTT TGGGCCCGTGAGCAGTCAAA ACGACGTTCT CGCGCTCTTT GAGATAGTACAAAAGAATAA AGAGGAGGGG AGTTGACGGG(23)紅黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-DS-12-YRS)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTACACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT GCTCAGCGTA CATTAAGAAATCATGTAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCCTGAGCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATAGTAC
AAAAGAATAA AGAGGAGGGG AGTTGACGGGD.黨參偽品金錢豹和桔梗2個種(24)金錢豹 Campanumoea javanica Blume ssp.japonica(Makino)Hong樣品(編號CMED-0108-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG AGACACCCTG GTAAATCTTC GTGTTGCAATTCCCCTTTTG CTGTTTTTTT TACTAAACGG AGGTCTAGAAGCGAATAAAA GAAAGAAAGA ATAACCATTT TTGAGGCTGAGGTAAGGTCT GAAGAACTTC TGAAGGTTGT TTGAGGCCGTATAAAAATGT TCGAACAAGG GGAGTTGACG GG(25)桔梗 Platycodon grandiflorum (Jacq.)A.DC.樣品(編號CMED-0111-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCTCCTG GGAAGGCCTC CTGTTGCACCCCCCATTTTT TTTATTTAAT TTTTGATTTA TTTATGTTATCGGTAGGTCG TTTTTTTTGT AGCTGTTGGA ATCATATTGCGTTTTGTGAG TGCGTTTATC CGTAATAATA GGGAGCGTAACGGTAAGGTT TCGGGTGTCG GGTCCGTAAC GGTTGAAACGGGGAATCGTA ATGAGGGAAA ACGGTGGAAT TTCGGTTAAAATGGTAAAAG GATGTTGAAT AAAATGCAAT TTATGGTGAGAGTATATGGG
具體實施例方式上述25樣品的5S rDNA序列的測定方法包括下列步驟(1)收集植物樣品，進行品種鑒定工作；(2)從步驟(1)選出的植物中提取DNA；(3)以步驟(2)提取的DNA為模板，以寡核苷酸作為聚合酶鏈式反應(PCR)的引物，擴增5S rDNA區段，所用的引物分別采自植物5SrDNA兩端的保守區段；
(4)應用克隆測序技術對步驟(3)中所獲得的PCR產物進行測序。
每一個樣品至少重復測序3次并樣品的序列也在互聯網頁National Center for Biotechnology Information(NCBI)和EuropeanMolecular Biology Laboratory(EMBL)與其它植物序列作比較和驗證以保證本發明的25個序列準確。
上述所測得的同一品種的樣品之間在DNA水平的平均差異為6.2％至9.9％，所述的黨參種間5S rDNA序列的差異為26％至60％。而黨參與大花金錢豹的5S rDNA序列的差異為37％至57％。黨參與桔梗的5S rDNA序列的差異為63％至72％。
本發明利用黨參類植物內5S rDNA序列的差異進行種內和種間的比較，借此鑒定不同的黨參品種并辨別其真偽。所采用的方法包括下列步驟1.從植物樣品中提取DNA；2.以步驟1提取的DNA為模板，以寡核苷酸作為聚合酶鏈式反應(PCR)引物，擴增5S rDNA區段，所用的引物分別采自植物5S rDNA兩端的保守區段；3.應用克隆測序技術對步驟2所獲得的PCR產物進行測序；4.將步驟3測得的DNA序列與上述的18個黨參及大花金錢豹的5S rDNA序列比較以鑒定所測植物的黨參品種及辨別真偽。
詳細描述所述方法(1)DNA的提取植物的DNA提取方法與Draper和Scott(Draper and Scott，1988)所述大致相同，簡述如下將干燥的植物材料用70％乙醇的蒸餾水溶液沖洗，然后，與液氮混合并研磨成粉末。將所得的粉末樣品與6倍體積的CTAB提取緩沖液混勻，在56℃水浴中保溫30分鐘后，加入等量的氯仿-異戊醇(24∶1)混合液抽提，離心，取上清液。向殘余物中加入0.1體積的10％CTAB溶液，室溫放置10分鐘后再用氯仿-異戊醇萃取一次，離心，取上清液并與前次的上清液混合。向所得上清液中加入等量的CTAB沉淀緩沖液產生沉淀，室溫放置1小時后以13000g離心15分鐘。將DNA沉淀物用乙醇純化后溶解于TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)中備用。
(2)PCR擴增反應5S rDNA區段的DNA由PCR擴增反應獲得。反應所用的引物為5S2F和5S2R5S2F序列為5’GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA5S2R序列為5’TTA GTG CTG GTA TGA TCG CA反應溶液包括10ng植物DNA，1XTag緩沖溶液(10mMTris-HCl，pH8.3，0.001％明膠)，0.2mM dNTPs，1μM引物，以及1個單位的Taq DNA多聚酶。反應條件為于94℃預處理5分鐘，然后進行35個循環，循環條件是94℃，1分鐘，60℃，1分鐘，72℃，2分鐘；最后72℃，10分鐘。
(3)克隆測序技術將步驟(2)得到的PCR產物用DNA純化試劑盒GENCLEAN IIIKit(Bio 101，USA)進行純化。取出1μl(約50ng)純化的PCR片段，用克隆試劑盒TA cloning Kit(pGEM-T Easy Vector Systems，Promega，USA)將該PCR片段克隆到載體上。經轉化細胞培養后，用質粒純化試劑盒Rapid Plasmid Miniprep System(Marligen Bioscience，Germany)純化質粒。測序通過反應試劑盒ABI Prism BigDye Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems，USA)和遺傳分析儀Genetic analyzer(ABI Prism 3100，Applied Biosystems，USA)進行。最后使用序列分析軟件Sequencing Analysis version 3.0(Perkin Elmer，USA)和DNAsis version 7.00(Hitachi，Japan)分析和確定樣品的DNA序列。
(4)DNA序列比較將序列以Fasta格式儲存，然后使用序列分析軟件BioEdit version7.0.1(Isis Pharmaceuticals，USA)進行排序及計算差異百分比，結果再輸入Excel 2002(Microsoft Corporation，USA)作統計分析。
(5)被測植物樣品的鑒定將所測樣品的5S rDNA序列與本發明公開的所有黨參品種的DNA標準按上述方法進行逐一比較。如發現該植物樣品的序列與某黨參5S rDNA序列樣準相匹配，也就是說，其序列差異小于9.9％，即可證實被測植物樣品與黨參，且與樣準(黨參)為同一品種。相反，如被測植物的5S rDNA序列與任何一個黨參標準DNA序列均不相匹配，則說明該被測植物品種不是黨參。
若想進一步了解該被測植物品是何種偽品或代用品，則可將其序列與本發明公開的幾種偽品和代用品的序列進行比較，如發現匹配，即說明該被測樣品是屬于何種偽品或代用品。
因此，采用本發明提供的黨參的5S rDNA的DNA序列及鑒定方法，通過其5S rDNA的DNA序列的比較，使得對中藥黨參的鑒定更加方便和可靠。
序列表<210>SEQ ID NO1<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 1<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE1CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCC GTCAACTCCC CTCCTCTTTA60TTCTTTGTAC TATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAA120CCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACG CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO2<211>LENGTH211<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 2<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE2CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCC GTCAAGTCCC CTCCTCTTTA60TTGTTTGTAC TATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCACAC GCGCCCAAAA120CCGAGCAAAA TGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACG CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO3<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 3<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE3CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATCCACCC GTCAACTCCC CTCCTCTTTA60TTCTTGGTAC TATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTAT GACTGCTGAC GCGCCCAAAA120GCGAGCAAAA CGTGCTTTTC GCGCTCTTAA TTATTGTACG GTGAGCAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO4<211>LENGTH210<212>TYpEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 4<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer
<400>SEQUENCE4CTAGGATGGG TGACCCCCAG GGAAGTGCTG GTATGCACCG GTCAAGTCCC CTCCTCTTTA60TTCTTTGTAA CATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAA120CCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTGT TTAATGCGCG CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQID NO5<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 5<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE5CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTCAGCGTA CATTAAGAAA CCATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCGTGA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA GAGATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGA180AGTTGACGG G190<210>SEQ ID NO6<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 6<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE6CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCAGC CCCCTTTTGC TCTTTTTTTT60AATCAGCGTA CATTAACAAA CCATATAAA GAAAGAAAT GCTCGGTTTT ACGCGCGTCA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA CACATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGTGGGA180AGTTGACGGG190<210>SEQID NO7<211>LENGTH209<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 7<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE7CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTCAGCCTA CTTTAAGAAA CCATATAAAA GAAAGAAAAT CCTCGGTTTT GGGCGCGTGA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA GAGATAGTTC AAAAGAATAA AGAGGAGGGA
180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO8<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 8<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE8CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TATTTTTTTT60ACTCTGCCTA CATTAAGAAA CGATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGAGTCA120GCAGTCAAAA GGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATTGTAC AAAAGAATAA AGCGGAGGGA180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO9<211>LENGTH213<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tangshen Oliv.9<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE9CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTCAACTCCC CCCCCTTTTG CTGTTTTGTT60TTACTCAGCG TACATTAAGA AACCATATAA ACTGCTCACG CGCTCAAAAC CGGGCATTTT120CTTTCTCATA AACGACCTTC TAGTACGCTC TTTAGAGATA GTACAAAAGA ATAAAGAGGA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQID NO10<211>LENGTH213<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tangshen Oliv.10<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE10CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAACCCCTC GTCAAGTCCC CCCCCTTTTG GTGTTTTGTT60TTACTCACCG TACATTAAGA AACCTTATAA AGTGCTCACG CGGTCAAAAC CGGCCATTTT120CTTTCTCAAA AACGACCTTC TAGTACGGGC TTTAGAGATA CTACAAAAGA ATAAAGAGCA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQID NO11<211>LENGTH213
<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tangshen Oiv.11<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE11CTAGGATGGG TGGCCCCCTG GCAAGTCCTC GTCAAGTCCC CCCCCTTTTG GTGTTTTGTT60TTTCTCAGCG TACGTTAAGA AACCATATAA AGGGCTCACG CGGTCAAAAC CGGGCGTTTT120CTTTCTAATA AACTGCCTTC TAGTAGGCTC TTTAGACATA GTAGAAAAGA ATAAAGAGCA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQID NO12<211>LENGTH212<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tubelosa Kom.12<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE12CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCGA GCATTTTTCT TTCTTTTATA CTGGTTTCTT60AATGTACGGT GAGTAAAAAA ACAGCAAAAG GGGGGGTGCA ACACGAGGTT CCCAGGGGGT120CACCCATCCT AATACTACTC TCGCCCTCAT TTGAGTTCGT ACAAAACGAC CATATGGGAG180AGGAGTTGAC GGG193<210>SEQ ID NO13<211>LENGTH212<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tubelosa Kom.13<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE13CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCTA GCATGTTTCT TTCTTTTATA CTGTTTTCTT60ACTGTACGGT GACTAAAAAA ACAGCTAAAG GGGGGGTGCT ACACGAGGTC GCCAGGGGGA120CACGCATCCT AATACGACTC TCTCCCTCAT TTTAGTTCGT ACAAAACTAC AAAAAGGGAG180AGAAGTTGAC GGG193<210>SEQID NO14<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis clematidea (Schyenk) C.B.Cl.14<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE14CTAGGATGGT CGACCATATG GGAAAGCTTC GCGTTTTTCT CCCTTTTTGA GTTTTTTTTA60
GTGTCACCTA AATAAGGAAA CCATTAAAAG AAAGAAACTA CACGAGGTTT TGGGGCCGTT120ATCCGCTCAC AAACTATTCT GGCATTCGTT TGGGATAGCA TAAAAGACTA AAGCCGGGGG180GAGTTGACGG G191<210>SEQID NO15<211>LENGTH212<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis canescens Nannf.15<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE15CTAGGACGCG GGAATTCGAG AAGAGTGCTG GTATGATCGC ACCCGCTGTT TTTTTTCCTC60TTTATTCTTT TGTACTATCT CTAAAGAGCG CGAGAAGGTC CGGTTTTGAC TTCTCACGCG120CCCAAAACAA AACGAGCTTT TTGCCTTTCG TTTGAGACGG TATAAAAGTA CGCTGAGGAG180GGGAGTTGAC GGG193<210>SEQID NO16<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis subglobosa W.W.Sm 16<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE16CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTATGCACCC GTTAACCCCC CCTTTTTTTG60TTTTTTTTAC TATCTCTACG TTAAGAAAAT GCTCGGTTTG ACTGCTCATG GGCGCGTGAG120CAGTCAAAAC GACCTTCTCG CGCTCTTTAG AGATATGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGG180AGTTGACGGG190<210>SEQID NO17<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis subglobosa W.W.Sm 17<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE17CTAGGATGGG TGTCCCCCTG GGAAGACCTC GTATGCACCC CCTAACCCCC CCTTTTTTTG60TTTTTTTTAC TATCGCAACG TTAAGAAAAT GCTTCCTTTG ACTGCTGATG GGCGCGTCAG120CAATCAAAAC GTCCTTCTCG CGCACTTTAG AGATATGGAC AAAAGAATAA AGAGGACGGG180TGTTGACGGG190
<210>SEQID NO18<211>LENGTH213<212>TYPEDNA<213>ORGANISMRadix Codonopsis 18<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE18CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTTTTA GTCAACTATG CCCGCTTTTG CTGTTTTGTT60TTCCTCAGCG TTCTTTAAGA ATCCATAAAG ACTGCTCACG GGCTCAAAAC CGGGCATTTT120CTTTCCCAAA ACCGAGCTTC TAGTTCGCTC TTTAGAGATA GTACAAAAGA ATAAAGAGGA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQ ID NO19<211>LENGTH207<212>TYPEDNA<213>ORGANISMRadix Codonopsis 19<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE19CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAATCTTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTAAACGGA CATTAAGAAG CGAATAAAAG AAAGAAAATG CTCGGTTTTG AGCGCGAGAG120CAGTCAAAAA GAACTTCTCG CGGTTGTTTG AGATAGTATA AAAGAATAAA GAGGAGGGAA180GTTGACGGG189<210>SEQID NO20<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMRadix Codonopsis 20<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE20CTAGGATGGG TGACTCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTCACCGTA CATTAAGAAA CCATATAAAA GAAAGAAAAA TGCTCGGTTT TGGGGCCGTG120AGCAGTCAAA ACGACCTTCT GGCGCTCGTT TGAGATAGTA CAAAAGAATA AAGAGGAGGG180GAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO21<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 21<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE21
CTAGGATGGA TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCCTTTTG GTGTTTTTTT60TACTCTGCGT ACATTAAGAA ACGATATAAA AGAAAGAAAA TGCTGGGTTT TGGGCGCGTG120AGCAGTCAGA ACGACCTTGT CGCGCTCTTT AGAGATAGTA CAAAAGAATA AAGAGGAGGG180GAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO22<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 22<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE22CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCGTC GTGTTGCACC CCCCCTTTTG CTGTTTTTTT60TACTGAGCGT ACATTAAGAA ACCATGTAAA AGAAAGAAAA TGCTCGGTTT TGGGCCCGTG120AGCAGTCAAA ACGACGTTCT CGCGCTCTTT GAGATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGG180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO23<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 23<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE23CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTACACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60GCTCAGCGTA CATTAAGAAA TCATGTAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCCTGA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGG180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO24<211>LENGTH211<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCampanumoea javanica Blume ssp. japonica (Makino) Hong 24<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE24CTAGGATGGG AGACACCCTG GTAAATCTTC GTGTTGCAAT TCCCCTTTTG CTGTTTTTTT60TACTAAACGG AGGTCTAGAA GCGAATAAAA GAAAGAAAGA ATAACCATTT TTGAGGCTGA120GGTAAGGTCT GAAGAACTTC TGAAGGTTGT TTGAGGCCGT ATAAAAATGT TCGAACAAGG180
GGAGTTGACG GG192<210>SEQ ID NO25<211>LENGTH319<212>TYPEDNA<213>ORGANISMPlatycodon grandiflorum (Jacq.) A.DC.25<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE25CTAGGATGGG TGACCTCCTG GGAAGGCCTC CTGTTGCACC CCCCATTTTT TTTATTTAAT60TTTTGATTTA TTTATGTTAT CGGTAGGTCG TTTTTTTTGT AGCTGTTGGA ATCATATTGC120GTTTTGTGAG TGCGTTTATC CGTAATAATA GGGAGCGTAA CGGTAAGGTT TCGGGTGTCG180GGTCCGTAAC GGTTGAAACG GGGAATCGTA ATGAGGGAAA ACGGTGGAAT TTCGGTTAAA240ATGGTAAAAG GATGTTGAAT AAAATGCAAT TTATGGTGAG AGTATATGGG290
權利要求
1.一種鑒定黨參品種的方法，其特征在于，應用一種或多種選自樣準組的DNA序列作為樣準，對待鑒定樣品的5S rDNA進行比較，從而獲得該樣品與樣準之序列差異百分比，所用樣準組包括以下DNA序列(1)黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號CMED-0038-04)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.1所示；(2)黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號CMED-0038-05)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.2所示；(3)黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號CMED-0038-08)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.3所示；(4)黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號CMED-0038-12)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.4所示；(5)素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-0093-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.5所示；(6)素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-0093-03)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.6所示；(7)素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-0093-04)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.7所示；(8)素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-0093-05)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.8所示；(9)川黨參Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號CMED-0101-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.9所示；(10)川黨參Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號CMED-0101-02)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.10所示；(11)川黨參Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號CMED-0101-05)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.11所示；(12)管花黨參Codonopsis tubelosa Kom.樣品(編號CMED-0102-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.12所示；(13)管花黨參Codonopsis tubelosa Kom.樣品(編號CMED-0102-02)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.13所示；(14)新疆黨參Codonopsis clematidea(Schyenk)C.B.C1.樣品(編號CMED-0109-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.14所示；(15)灰毛黨參Codonopsis canescens Nannf.樣品(編號CMED-0110-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.15所示；(16)球花黨參Codonopsis subglobosa W.W.Sm樣品(編號CMED-0107-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.16所示；(17)球花黨參Codonopsis subglobosa W.W.Sm樣品(編號CMED-0107-02)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.17所示；(18)板黨Radix Codonopsis樣品(編號CMED-DS-8-DFH)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.18所示；(19)防黨Radix Codonopsis樣品(編號CMED-DS-9-YH)之5SrDNA序列，該序列如SEQ ID NO.19所示；(20)紋黨Radix Codonopsis樣品(編號CMED-DS-10-YRS)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.20所示；(21)紅黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-DS-7-XH)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.21所示；(22)紅黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-DS-11-WYT)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.22所示；(23)紅黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號CMED-DS-12-YRS)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.23所示；(24)金錢豹Campanumoea javanica Blume ssp.japonica(Makino)Hong樣品(編號CMED-0108-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.24所示；和(25)桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.樣品(編號CMED-0111-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.25所示。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，進一步包括一個判斷步驟，該判斷步驟是根據一個差異域值(threshold)，當樣品與樣準之間序列差異百分比小于該域值，則可初步判斷該樣品與樣準是同一品種。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述差異域值在8％至12％之間。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述差異域值為9.9％。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括以下具體步驟(a)從待鑒定樣品中提取DNA；(b)以上述DNA為模板，并以適當的寡核苷酸為引物，應用聚合酶鏈式反應擴增5S rDNA區段；(c)對上述擴增的5S rDNA區段進行序列測定；(d)將上述所測樣品序列與一種或多種選自樣準組的DNA序列進行比較，并計算其之間的差異百分比；和(e)根據上述差異百分比判斷該被鑒定樣品是否和所比樣準是同一樣品。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物為5S2F，其序列為5’GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA和5S2R，其序列為5’TTA GTG CTG GTA TGA TCG CA。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(e)的判斷是根據一個差異域值實現的，當樣品與樣準之間序列差異百分比小于該域值，則可初步判斷該樣品與樣準是同一品種。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述差異域值在8％至12％之間。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述差異域值為9.9％。
全文摘要
本發明公開了黨參的5S rDNA序列及利用該序列區分黨參、素花黨參、川黨參、管花黨參、新疆黨參、灰毛黨參、球花黨參品種及偽品金錢豹和桔梗。
文檔編號C12Q1/68GK1982469SQ20051002287
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月13日 優先權日2005年12月13日
發明者邵鵬柱, 徐宏喜, 畢培曦, 張艷波 申請人:香港賽馬會中藥研究院有限公司