專利名稱：含不飽和脂肪酸油脂的制作方法
本申請是同名中國專利申請第03158798.4號的分案申請，原案申請日1997年8月27日提交日2003年9月24日。
本發明涉及利用屬于被孢霉(Mortierella)屬被孢霉(Mortierella)亞屬微生物制造含不飽和脂肪酸油脂的方法，該油脂中24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇(24，25-Methylenecholest-5-en-3β-ol)含有率少。
人們知道被孢霉屬被孢霉亞屬微生物可以作為生產花生四烯酸、二高(Dihomo)-γ-亞麻酸、二十碳五烯酸等不飽和脂肪酸的微生物，利用這種微生物已經開發出通過發酵法高效制造花生四烯酸、二高-γ-亞麻酸、二十碳五烯酸的方法〔特開昭63-44891、特開昭63-12290、特開昭63-14696、特開平5-91887、特開昭63-14697〕。利用對屬于被孢霉屬被孢霉亞屬微生物實施變異處理獲得的Δ12不飽和活性低下或缺失的變異株制造蜜得酸(mead酸，5，8，11-二十碳三烯酸)的方法人們也已經了解了(特開平5-91888)。
另外，二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、蜜得酸等不飽和脂肪酸是具有很強且多種生理活性的前列腺素、凝血烷、前列環素、白三烯等分子的前體物質，添加了這些前體物質地食品以及動物飼料正受到人們的關注。
例如，花生四烯酸雖然是具有使子宮收縮或松弛作用、擴張血管、降低血壓作用等生理活性的前列腺素、凝血烷、前列環素、白三烯等分子的前體物質，但近年來，作為嬰兒發育的必需成分，花生四烯酸與二十二碳六烯酸(以下也稱之DHA)一起研究進展很快。
據Lanting(《柳葉刀》LANCET，Vol.344.1319-1322(1994))等人報道，對出生后3周以上母乳哺育的嬰兒和用嬰兒奶粉喂養的嬰兒進行跟蹤調查，直到9歲為止，從行為方面研究腦神經的小的障礙發生率，發現用嬰兒奶粉喂養的嬰兒的腦障礙發生率是母乳哺育的嬰兒的2倍。人們推測這一驚人的結果可能是由于母乳中存在而嬰兒奶粉中幾乎不存在的DHA或花生四烯酸等高度不飽和脂肪酸與腦的發育有關系。除此之外，高度不飽和脂肪酸與新生兒的腦以及網膜的發育有關系的結果陸續有報道。
然而，雖說是含這些不飽和脂肪酸的油脂安全性很高，但由于有微生物產生的問題，所以并沒有充分滲透于社會，而且據《脂類》LIPIDS、Vol.27、No.6、481-483(1992)報道，高山被孢霉Mortierella alpina 1S-4株中還產生直到現在還未發現天然存在的24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇。因此人們期待著可安全地用于食品和動物飼料的、來自被孢霉屬被孢霉亞屬微生物的含不飽和脂肪酸油脂的開發。
本發明目的在于提供能夠安心用于食品或動物飼料的，而且能夠經濟且穩定供給不飽和脂肪酸的微生物油。
本發明人等為了解決上述課題，探索高效制造24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇含量少，而含不飽和脂肪酸油脂的方法，詳細地研究了各種培養基成分與甾醇組成的關系，結果發現在被孢霉屬被孢霉亞屬微生物的培養中，通過使用從大豆得到的氮源，可以得到24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇組成比小的油脂。由此完成了本發明。
就是說，本發明是有關含不飽和脂肪酸油脂的制造方法的發明，發明涉及在含有從大豆獲得的氮源的培養基中培養被孢霉屬被孢霉亞屬微生物，以及從該培養物中提取含不飽和脂肪酸油脂等過程。
本發明中所謂的不飽和脂肪酸是指碳數在16以上，且含有一個以上雙鍵的脂肪酸，而一般將碳數在18以上且含有2個以上雙鍵的脂肪酸稱之高度不飽和脂肪酸，例如γ-亞麻酸、二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、蜜得酸等。
本發明中所謂的被孢霉屬被孢霉亞屬微生物是指長孢被孢霉Mortierella elongata、微小被孢霉Mortierella exigua、喜濕被孢霉Mortierella hygrophila、高山被孢霉Mortierella alpina等微生物，具體講是指長孢被孢霉Mortierella elongata IFO8570、微小被孢霉Mortierella exigua IFO8571、喜濕被孢霉Mortierella hygrophilaIFO5941、高山被孢霉Mortierella alpina IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等菌株。
這些菌株中的任一種都可以從大阪市財團法人發酵研究所(IFO)、以及美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)和真菌菌種保藏中心[Centraalbure au voor Schimmelculturees(CBS)]無限制地得到。也可以使用本發明人從土壤中分離的菌株Mortierellaelongata SAM0219(微工研菌寄第8703號)。這些屬于模式菌種的菌株或從自然界中分離的菌株可以直接使用，也可以使用與進行過一次以上增殖和/或分離后得到的原來菌株性質不同的自然變異菌株。
本發明使用的微生物包括按照在使用同樣的培養基培養時，與原來的野生株產量相比，油脂中不飽和脂肪酸含量多，或總油脂量多，或者是不飽和脂肪酸含量和總油脂量都多的意圖設計的屬于Mortierella屬Mortierella亞屬的微生物(野生株)的變異株或重組株。
本發明使用的微生物也包括按照能有效利用費用優越的培養基，生產出與相應野生株等量的不飽和脂肪酸的意圖設計的菌株。例如，作為Δ12不飽和活性缺失的變異株的Mortierella alpina SAM1861(微工研條寄第3590號、FERM BP-3590)或作為Δ5不飽和活性缺失的變異株的Mortierella alpina SAM1860(微工研條寄第3589號、FERM BP-3589)。
上述屬于MortiereHa屬Mortierella亞屬的微生物可以用它的孢子、菌絲、或預培養得到的前培養液接種于液體培養基或固體培養基上培養。作為碳源可以使用常用的葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露糖醇、檸檬酸、玉米淀粉等中的任一種，優選的碳源是葡萄糖、麥芽糖、果糖、玉米淀粉、甘油、檸檬酸。
而在本發明中，通過使用從大豆得到的營養源作為氮源，可以使油脂中的24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇組成比變小。
本發明中使用的從大豆得到的氮源中的氮含量希望占在除去水分之后重量的2％以上，優選的是占3％以上，更優選的是占5％以上。而作為從大豆得到的氮源可以使用脫脂大豆或是對脫脂大豆進行熱處理、酸處理、堿處理、酶處理、以及通過包括熱處理、酸處理、堿處理、酶處理、化學修飾等化學的和/或物理的處理在內的變性和/或再生；利用水和/或有機溶劑除去一部分成分；通過過濾和/或離心分離除去一部分成分；實施冷凍；粉碎；干燥；篩分等加工的、或者是對未脫脂大豆實施同樣加工后的產品，可以單獨使用或組合使用上述加工的產品。一般常用的是大豆、脫脂大豆、豆餅、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆乳、黃豆粉等大豆制品。特別是對脫脂大豆實施熱變性的制品，更理想的是對脫脂大豆實施熱變性后又除去乙醇可溶性成分的制品。
除此之外，根據需要，在對甾醇組成沒有很大影響的范圍內，可以配合使用其它的氮源，例如可以使用蛋白胨、酵母提取液、麥芽提取液、肉提取液、酪蛋白氨基酸、玉米浸漬液、尿素等有機氮源，以及硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨等無機氮源的一種或數種。
另外，根據需要也可以使用微量的營養源，例如可以使用磷酸鉀、磷酸二氫鉀等磷酸鹽、硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅、氯化鎂、氯化鈣等無機鹽類以及維生素等。
同時在本發明中，通過在培養基中添加作為目的不飽和脂肪酸的基質進行培養，也可以促進該不飽和脂肪酸的積蓄。作為不飽和脂肪酸的基質，如十六碳烷或十八碳烷那樣的碳氫化合物；象油酸或亞麻酸那樣的脂肪酸或它們的鹽，例如它們的鈉鹽或鉀鹽，或脂肪酸酯，例如乙酯、甘油脂肪酸酯、山梨聚糖脂肪酸酯；或者是象橄欖油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油那樣的油脂類，這些物質可以單獨或組合使用。基質的總添加量為培養基重量的0.001～10％、優選的是0.5～10％。而即使使用這些基質作為唯一的碳源進行培養也可以。
上述的碳源、氮源、無機鹽類、維生素和/或添加物可以添加到培養開始前的培養基和/或培養過程中的培養液中。這些培養基成分可以一次添加，或連續添加，或隨時間分幾次添加。這些培養基成分可以分別單獨添加，或預先混合后添加。這些培養基的成分只要是對菌的生長沒有妨礙，其濃度并沒有特別限制。實用中，一般希望碳源為培養基重量的0.1～30％、優選1～15％，氮源為0.01～10％、優選0.1～5％。
培養溫度為5～40℃、優選20～30℃、也可以在20～30℃培養使菌體增殖后，再于5～20℃繼續培養使菌體生產不飽和脂肪酸。通過這樣的溫度控制可以提高生成脂肪酸中的高度不飽和脂肪酸的產率。將培養基的pH調到4～10、最好是5～8，進行通氣攪拌培養、振蕩培養、或靜置培養。通常培養2～20天、理想的是培養5～20、最好是培養5～15天。
尤其是使用象通氣攪拌培養槽或空氣升液器培養槽那樣的槽，通過液體通氣培養，可以以可能達到商品化收率生產含不飽和脂肪酸的油脂。而這種情況下，從培養開始至少3天內，通過一邊維持葡萄糖濃度在0.3％以上和/或葡萄糖平均濃度0.5％以上、理想的是葡萄糖濃度為0.5％以上和/或葡萄糖平均濃度為0.7％以上、最好是葡萄糖的濃度為0.5～5％和/或葡萄糖平均濃度0.7～3％，一邊進行培養，可以更有效地制造含不飽和脂肪酸的油脂。例如，每1克干菌體制造的花生四烯酸在10mg以上，理想狀況可以達到120mg以上。
這樣一來，菌體內大量積蓄著目的不飽和脂肪酸含量豐富的，而24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇含量少的油脂。
作為目的油脂可以從通過菌體培養制造油脂過程中的培養液或其滅菌的培養液、或是從培養完了時的培養液或其滅菌的培養液、或是從各個過程中收集的培養菌體或其干燥菌體，利用常規方法得到。
從培養菌體通過下面的方法可以提取目的油脂。
培養結束后，通過離心分離和/或過濾等常用的固液分離手段得到菌體。培養菌體最好是積蓄進行、破碎、干燥。干燥可以通過冷凍干燥、風干進行。干燥菌體最好是在氮氣流下用有機溶劑進行萃取。作為有機溶劑可以使用乙醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚等，而通過甲醇和石油醚交互萃取或使用氯仿-甲醇-水溶劑萃取也可以得到良好的結果。
通過在減壓下從萃取物中蒸餾掉有機溶劑，可以得到高濃度的含不飽和脂肪酸油脂。取代上述方法，使用濕菌體也可以進行萃取。這種情況下，使用甲醇、乙醇等對水相溶性的溶劑，或使用與其它溶劑組成的對水相溶性的混合溶劑。其它的工序與上述的一樣。
上述提取過程得到的油脂中，不飽和脂肪酸是以結合為甘油三酯和磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇中的狀態存在的，幾乎是以甘油三酯形式存在的。為了從培養物中提取的含不飽和脂肪酸油脂中分離純化出含不飽和脂肪酸的甘油三酯，利用常規方法，經己烷萃取后進行脫酸、脫色、除臭、去膠處理、或冷卻分離等。
本發明所謂的24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇組成比是利用甾醇組成分析方法按照下面過程求得的。
首先說明甾醇組成分析方法。將原料油脂30～80mg稱量于帶有栓塞的試管內，然后添加甲醇4ml和33％氫氧化鉀水溶液1ml，并加上栓塞。將該試管于80℃邊攪拌邊使其反應一小時，然后放置冷卻，用正己烷萃取脂溶成分。對得到的正己烷萃取液進行水洗，洗至酚酞指示劑對水相不顯色為止，通過減壓濃縮獲得分析樣品。將分析樣品溶解于少量的正己烷中，供下表記載的條件進行氣相色譜分析用。通過與市售的24-脫氫膽固醇標準樣品比較氣相色譜，進行24-脫氫膽固醇峰的鑒定。
在保留時間為24-脫氫膽固醇的0.8～2.0倍期間檢測的成分是甾醇成分，利用常規方法求出保留時間內的所有甾醇成分的氣相色譜峰的面積。各個峰面積相對于該成分總面積的和的比例就作為各成分的組成比。例如24-脫氫膽固醇檢測峰的面積相對于所有甾醇面積的總和的比例就作為24-脫氫膽固醇的組成比。24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇在保留時間為24-脫氫膽固醇保留時間的1.07～1.12倍時被檢測出來。24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇檢測峰的面積相對于所有峰面積的總和的比例就作為24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇的組成比。
使用的柱子ULBON HR-1(內徑0.25mm、長25m)
柱溫280℃
注入口和檢測器溫度300℃
載體氣體和表壓 氦氣 1.2kg/cm2
組成氣體及流量 氮氣 70ml/min
檢測器FID
分流比20
本發明的含不飽和脂肪酸油脂中24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇的組成比在35％以下，比較好的在33％以下，最好的在30％以下。和/或該24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇對同樣油脂中存在的24-脫氫膽固醇之比在1.2以下，優選在0.9％以下，更優選在0.6％以下。所謂的24-脫氫膽固醇是與24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇一起存在于通過培養Mortierella屬Mortierella亞屬的微生物得到的油脂中的成分，也存在于母乳中。
作為本發明的含不飽和脂肪酸油脂的一個例子，例如，含花生四烯酸的油脂，其中花生四烯酸占油脂中總脂肪酸重量的20～54％、優選占30～50％，24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇的組成比在35％以下、優選在33％以下、更優選在30％以下，和/或該24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇對同樣油脂中存在的24-脫氫膽固醇之比在1.2以下，優選在0.9％以下，更優選在0.6％以下。
而該含花生四烯酸油脂具有的油脂特性是甘油三酯含量在90％以上、水分在0.1％以下、酸值在0.5以下、過氧化值在5以下、油脂顏色，于羅維邦比色法133.4mm比色杯中黃色在50以下、紅色在10以下，脂肪酸組成、花生四烯酸為20～54％、優選占30～50％、肉豆蔻酸為0.2～0.7％、棕櫚酸為10～16％、硬脂酸為4～10％、油酸為5～15％、亞油酸為5～15％、γ-亞麻酸為1～5％、α-亞麻酸為0.1～2％、二高-γ-亞麻酸為1～6％、二十碳五烯酸為0～1％、二十四碳(烷)酸為2～7％。
該油脂富含以甘油三酯形式存在的花生四烯酸、可能不含有二十碳五烯酸、即使含有由于是極微量，用作食品、特別是用作早產兒用調制奶、嬰兒用調制奶、幼兒用食品、或用作孕產婦用食品的原料都是很理想的。而本發明的含不飽和脂肪酸油脂由于飲食經驗還不知道的24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇含有率少，所以可以安心地用于食品和動物飼料。
以下，通過實施例具體說明本發明。
實施例1
使用Mortierella elongata IFO8570作為花生四烯酸生產菌，將含有葡萄糖2％、食用大豆蛋白(商品名エスザンミ-ト、味之素公司制造)1％、菜籽油0.1％的培養基1400L加入2000L通氣攪拌培養槽中、于溫度28℃、通氣量1.0vvm、攪拌80rpm、槽內壓1.0kg/cm2G的條件下開始通氣攪拌培養。按照流加法維持葡萄糖濃度1.5％、培養7天后、通過過濾回收菌體、提取油脂。而作為比較例子、用1％酵母提取液代替食用大豆蛋白，進行同樣的培養和油脂的提取。
按照前述的程序分析得到的油脂中的甾醇成分，在保留時間9.6分鐘附近檢測出24-脫氫膽固醇、而在保留時間7.2分鐘附近檢測出24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇。結果如表1所示。得到了24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇組成比少的含不飽和脂肪酸油脂。
表1
*油脂中甾醇含量
**花生四烯酸對油脂中總脂肪酸的含有率
實施例2
使用Mortierella alpina CBS754.68作為花生四烯酸生產菌，將含有葡萄糖4％、黃豆面1.3％、酵母提取液0.2％、橄欖油0.1％的培養基600L加入1000L通氣攪拌培養槽中、于溫度24℃、通氣量1.0vvm、攪拌100rpm、槽內壓0.5kg/cm2G的條件下進行5天的通氣攪拌培養。然后通過過濾、干燥回收菌體、通過己烷萃取得到油脂。而作為比較例子、使用葡萄糖4％、酵母提取液1.5％、橄欖油0.1％的培養基，通過同樣的培養得到油脂。另外，實施例、比較例在培養的第二天都流加1％葡萄糖。
按照前述的程序分析得到的油脂中的膽固醇成分，在保留時間10.2分鐘附近檢測出24-脫氫膽固醇、而在保留時間11.2分鐘附近檢測出24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇。結果如表1所示。得到了24，25-甲叉膽甾-5-烯-3
β-醇組成比少的含不飽和脂肪酸油脂。
表2
*油脂中甾醇含量
**花生四烯酸對油脂中總脂肪酸的含有率
實施例3
使用Mortierella alpina ATCC32221、Mortierella alpina ATCC42430作為花生四烯酸生產菌，分別進行培養。將含有葡萄糖4％、脫脂大豆粉1.2％、磷酸氫鉀0.2％、大豆油0.1％的培養基25L加入50L通氣攪拌培養槽中、于溫度28℃、通氣量1.0vvm、攪拌300rpm、槽內壓1.0kg/cm2G的條件下進行5天的通氣攪拌培養。然后通過過濾、干燥回收含有花生四烯酸的菌體、從回收的菌體通過己烷萃取得到油脂。
而作為比較例子、使用葡萄糖4％、啤酒酵母粉末1.2％、磷酸氫鉀0.2％、菜籽油0.1％的培養基，通過同樣的培養得到油脂。另外，實施例、比較例在培養的第二天都流加1％葡萄糖。按照前述的程序分析得到的油脂中的膽固醇組成。表3給出了分析的結果。得到了24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇組成比少的含不飽和脂肪酸油脂。
表3
*油脂中甾醇含量
**花生四烯酸對油脂中總脂肪酸的含有率
實施例4
使用Mortierella alpina CBS754.68作為花生四烯酸生產菌，將含有葡萄糖2％、大豆蛋白1.5％、大豆油0.1％的培養基1400L加入2000L通氣攪拌培養槽中、于溫度24℃、通氣量1.0vvm、攪拌80rpm、槽內壓200kPa的條件下開始通氣攪拌培養。按照流加法維持葡萄糖濃度0.5％、培養7天后、通過過濾回收菌體。將菌體干燥后、用己烷萃取、萃取液進行脫色、除臭、添加0.05％的作為氧化劑的生育酚。分析得到的油脂，其組成如下。
分析結果
油脂顏色(羅維邦比色法133.4mm比色杯)黃色20.1、紅色1.4
脂肪酸組成
實施例5
將實施例4得到的含花生四烯酸油脂和魚油以及植物油適當地混合，得到必需脂肪酸調和油脂。除了該必需脂肪酸調和油脂外，每當調制育兒用奶粉100kg時，準備如下所示的原材料和成分。然后按照常規方法將這些原材料溶解、混合、清洗后、進行滅菌、濃縮、調勻、噴霧干燥之后就得到育兒用調制奶粉。
原材料及成分
權利要求
1.含不飽和脂肪酸油脂，其特征是含有35重量％以下的24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇。
2.權利要求1所述的油脂，含有花生四烯酸，其特征是含有含量在35重量％以下的24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇，而且花生四烯酸的含量是20-54重量％。
3.權利要求1所述的油脂，含有花生四烯酸，其特征是24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇的組成比在35重量％以下，24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇組成比與24-脫氫膽固醇的組成比的比例在1.2以下、而且花生四烯酸的含量是20～54重量％。
4.權利要求2或3記載的含花生四烯酸油脂，其特征是該油脂是從屬于被孢霉屬被孢霉亞屬微生物得到的微生物油。
5.根據權利要求1的含不飽和脂肪酸油脂，其特征是24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇的組成比在35重量％以下，24，25-甲叉膽甾-5-烯-3β-醇與24-脫氫膽固醇含量之比在1.2以下。
6.權利要求1或5記載的含不飽和脂肪酸油脂，其特征是該油脂是從屬于被孢霉屬被孢霉亞屬微生物得到的微生物油。
7.權利要求1或5記載的含不飽和脂肪酸油脂，其特征是上述不飽和脂肪酸是γ-亞麻酸、二高-γ-亞麻酸、二十碳五烯酸、和/或蜜得酸。
8.配有權利要求2～4任一項記載的含花生四烯酸油脂的營養輔助食品。
9.含有權利要求1-7中任一項所述的油脂的早產兒用調和奶、嬰兒用調和奶、幼兒用食品、或孕產婦用食品。
10.含有權利要求1-7中任一項所述的油脂的動物飼料。
全文摘要
含不飽和脂肪酸油脂，其中24，25－甲叉膽甾－5－烯－3β－醇含量少，可以用作營養輔助食品、早產兒用調和奶、嬰兒用調和奶、幼兒用食品、孕產婦用食品、動物飼料等。
文檔編號C12P7/64GK1806644SQ20051002283
公開日2006年7月26日 申請日期1997年8月27日 優先權日1996年8月30日
發明者東山堅一, 秋元健吾, 清水昌 申請人:三得利株式會社