病毒病原高通量快速排查檢測方法

專利名稱：：病毒病原高通量快速排查檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種病毒病原的排査檢測方法，具體涉及一種豬疫病病毒的高通量快速排查檢測方法。技術背景寡核苷酸芯片(OligonucleotideMcro呵s)，是將事先設計并合艦的十幾至幾十個鵬的寡核苷酸探ftM:點樣儀有規律地排列固定于支持物上，然后與熒光fgi己的耙序列按i^酉ax寸原理在一定條件下雜交，經洗滌后iM:激光共聚焦熒光檢測系統對芯片進行掃描，ffil計穀/!M行繊比較和分析，一次i微就可對多種基因進行'鵬、準確、豬細小病謝PV)、豬圓環病斷CV)、豬瘟病寧CSFV)是引發豬患病的常見病原，且常呈混合感染出現。豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬藍耳病毒是危害豬呼吸系統、神會L系統、生殖系統常見的四類高發性病毒性病疫原。目前，現有技術中對這幾種鄉病毒的分析檢測多采用病原分離和常規的免ML清學檢測以及聚^l^i反應(PCR)法。病原分離不僅費時、操作復雜。免麵清^t測法，雖然操作較為簡單，但主要是敏感tt&特異性相對較低。現有PCR分析檢觀啲方法先根據待檢測病毒設計引物，xf待測樣本進行擴增，然后進行檢測。由于是采用電泳的方法直驗行檢測，因此每次只能檢測一種病原，多種病原需要進行多次檢測，費時、操作鋭，特異性相對較低，假附性率較高。現有技術中樣本處麟用直接標己的方法，標己效割氏，導致檢測靈鵬低。步驟是(1)弓嫩的設計合成先設計引物，然后合成引物，同日射示記上熒光物質，形淑示記有熒光物質的引物。(2)生成單鏈DNA產物擴增產物，形成帶有熒光物質單鏈DNA產物。
發明內容本發明的目的在于掛共一種病原高通量^I排査檢測方法，其解決了
背景技術：
中豬疫病病毒檢測方法費時、費力，敏感'隨特異性較低，檢測結果不準確的技術問題。本發明的技術解決方案是一種病毒病原高通量i^I排查檢測方法，M^L處在于，該方法的實現步驟包括:(1)制備芯片探針設計，芯片點制，得寡核苷酸芯片；(2)待測樣本處理(2.1)引物的設計合成得到與待檢測病原對應的引物；(2.2)生鵬鏈DNA產物用與待檢測病原對應的引物對待觀蹄本進行同步不對稱PCR擴增，生成與寡核苷酸探針特異性互補的單鏈DNA產物；(2.3)標記熒光物質在單鏈DNA產物上標己熒光物質，形^fi己上熒光物質的單鏈DNA產物；(3)雜交將標己上熒光物質的單鏈DNA產物與寡核苷酸芯片雜交，清洗芯片；(4)檢測分析用熒光掃描儀掃描，得到病毒檢測分析結果。上述制備芯片的步驟可包括(1)探針的設計根據病毒基因組保守序列設計牛寺異性強的寡核苷酸探針；(2)芯片點制先進行片基表面斷布處理，然后^按照設計的陣列固定在片基上，制備成寡核苷酸芯片，進行芯片點樣后處理，得寡核苷酸芯片。上述標記熒光物質的步驟可以是(1)單鏈樣本的間接熒光^H己iiai不Xd^PCRj參入的氨基烯丙基和熒光^Tcy3或cy5上的琥珀酰亞胺基團進^i接，使不X^妳CR單鏈產物連接上熒光iH己^;(2)fei己產物的純化將熒光t射己產物用AmershamG"25柱進fi^化，除去^^H己的游離熒光分子，得純化后的熒光標記的樣本，置于-2crc避光保存，備雜交用。上述熒光掃描儀以采用GenePix4000B掃描儀為宜。上述弓嫩設計合成中弓嫩的選出方案可以是弓嫩長度15—30個，引tJMS組鵬隨機分布，0+€含量在45-55%，弓卿自身不形成二級結構，引物之間班補序列，引物序列是被檢病毒降異的，引物3'端^tt與樹B)NA酉B寸，引物3'彩I堿基以選T、C或者G。上述探針設計方案可以是Tm值為85。C土5。C，GC含量為50X-60%，重復的單一哲,i^續《6個，探針M的二級結構酉W訴jtt長度《6bp，合^的引物和寡核苷針用滅菌7條解，弓嫩終濃度為20pmol/ul，徽終濃度為25pmol/pl;或合鵬的寡核苷酸探針用無菌水溶解至濃度為50iiM/L，同2Xspottingbuffer1:i混合使其點樣終濃度調整為25"M/L。戰單鏈樣本的間接熒光標己的步驟可以是:取分裝千燥的cy染料，力口5ul的DMSO室溫避光孵育l小時；用30ul0.1MPH9.3Na2C03充分溶解純化后的不X^敘CRss-DNA，然后立即轉移至孵育好的cy熒光染料中，吹吸混勻，室溫避光反應l小時，每隔10分,襯顯和震蕩1^H中；加入10ul4Mf剄安，使P勁安終濃度為1M，室溫靜置15併中。上述將標己上熒光物質的單,節NA產物與寡核苷酸芯片雜交的步驟可以是將熒光標記的樣本與1X以1:9的體積比混合，95'C變性3^^中，使二級莖環結構解f連；取混合樣品至芯片表面，置于雜交盒內6(TC雜交；所述的雜交液為50%甲翻安、5XSSC、0.1%SDS以及lX鮭魚精DNA。上述制備芯片包括片基處理，步驟可以是用APTES溶^樹Gokisea魅烷化玻片進行處理，離心甩干，經掃描后，選取背景均一且背景值較低的氨基化片基，室溫千燥，保存以備用。上述芯片清洗的步驟可以是取出芯片，立即^A清洗液I中清洗2次，每次10y刀H中再轉入4'C保存的清洗液II中清洗10^H中，最后常溫下將芯片離心甩干。清洗液I可采用6XSSC以及Triton-X102，清洗液II可采用0.1XSSC以及Triton-X102。本發明具有以下tt:點1.本發明應用寡核苷酸(Oligo)芯片，可對多種豬疫病病毒進行并行化的高通量、快速排査檢測。2.操作簡便，省時3.敏感性及特異性高，檢測結果穩定，準確性好。4.由于可對多種基因進行快速、準確、高效的檢測，實用性強。圖1為本發明實施例芯片設計示意圖。圖2為本發明實施例芯片陣列設計示意圖。圖3為本發明引物特異性驗證結果圖。圖4為本發明不對稱PCR反應擴增產物的PAGE膠驗證結果圖。圖5為本發明引物特異性跑膠驗i正結果圖。圖6為本發明芯片掃描結果圖。具體實施方式本發明采用的病毒病原高通量快速排査檢測方法，實現步驟如下l.制備芯片.本發明制備芯片中的探針設計及芯片點帝購可采用公知技術。(1.1)探針的設計根據病毒基因組保守序列設m寺異性強的60bp寡核苷酸探針。(1.2)芯片點制先進行片基表制斷布處理，然后^^B十按照設計的陣列固定在片基上，制備成寡核苷酸芯片，進行芯片點樣后處理，即得寡核苷酸芯片。2.待測樣本處理本發明樣本處理釆用間接^H己的方法，*斜己效率高，使檢測靈提高，而且成本低。(2.1)引物的設計合成得到與待檢測病原對應的引物。(2.2)生鵬鏈DNA產物用與待檢測病原對應的引物對待觀財羊本進行同步不對稱PCR擴增，生成大量可與寡核苷酸探針特異性互補的單鏈DNA產物。(2.3)禾fi己熒光物質在單鏈DNA產物上牛斜己熒光物質，形j^^H己上熒光物質的單鏈DNA產物。(2.3.1)單鏈樣本的間接熒光標己iW不對禾敘CR^參入的ES化脫氧尿嘧啶核苷酸(aa-dUTP)和熒光物質cy3^cy5上的琥珀酉tt胺基團進fi^接，使不對禾敘CR單鏈產物連接上熒光標記分子。具體方法取分裝^P燥的cy染料，力Q5ul的DMSO室顯避光孵育l小時；用25"10.lMNa2C03(PH9.3)充分溶解純化后的不對稱PCRss-DNA，然后立即轉移至孵育好的cy熒光染料中，吹吸混勻，室溫避光反應l小時，每隔10分鍬顯和震蕩l分鐘；加入10ul4MP勁安，使羥胺終濃度為1M，室溫靜置15^H中。(2.3.2)t射己產物的純化將Jl^熒光^i己產物用Amei3ham025柱進fi^屯化，除去未標己的游離熒光分子，得純化后的熒光iH己的樣本，置于-2(TC避光保存，備雜娜。將牛莉己上熒光物質的單鏈DNA產物與寡核苷酸芯片進行雜交，清洗芯片。具體方法如下(3.1)雜交將熒光豐射己的樣本與lX以l:9的體積比混合，95。C變性3min，使可能存在的二級莖環結構解鏈。取混合樣品至芯片表面，置于雜交盒內6(TC雜交。雜交液可采用50%甲,安、5XSSC、0.1Q/oSDS以及l。/Q鮭魚fSDNA。(3.2)芯片清洗取出芯片，立即臥清洗激中清^2次，每次10粥中；再轉入4t:保存的清洗^n中清洗io力H中，最后常溫下將芯片離心甩干。清洗鄉可采用6xssc以及Triton-X102，清洗銜I可采用O.1XSSC以及Triton-X102。用lnePix4000B熒光掃描儀掃描，分析芯片熒光信號，貝U得到豬病毒檢測結果。目前，Genepix4000B熒光掃描儀帶有Genepixpro3.0微陣列分析軟件，芯片掃描完成，3.雜交:即可得到芯片熒光信號檢測分析結果。實施例實現歩驟如下(1)引物的設計方案弓胸長度一般以15—30個堿基為宜。正向、反向兩條引物鏈之間的距離/頓中。因為片斷過短會影響結果判定，過長則擴增特異性陶氐。引物石組成應隨機分布，G+C含量在45-55%為宜。引物自身不形成二級結構，弓胸之間沒有互補序列。引物序列必須是被檢病毒待異的。引物3'織ja與模feDNA要酉瀏，引物3'末端堿基以選T、C或者G為宜，一般不i^A。(2)探針的設計方案Tm值在85。C左右，上下波動范圍為5。C。GC含量為50。/o-6(F。。重復的單一石鵬連續不超過6個。探針^H^慰急定的二級結構酉瀏石鵬長度少刊bp。豬細小病毒(PPV)、豬圓環病毒(PCV)、豬瘟病毒(CSFV)探針，合成后的引物和探針用滅菌水溶解，弓l物終濃度為20pmol/"l，探針終濃度為25pmol/ul。豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖和呼吸綜合癥這四種病毒的探針，均未經ttf可1it布，質，級為PAGE級。合成好的寡核苷酸探針用無菌水溶解至濃度為50"M/L，同2Xspottingbufferl:l混合使其點樣終濃度調整為25uM/L。豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖和呼吸綜合癥這四種病毒的弓l物序列位置、序列及特點如下表所述PorcinevirusesgeneGenebankIDPrimerPositionPCRproduct5'(ACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3'431FPRVgDAF08670264服217bpPi.:5'"GTCCACGCCCCGCTrGAAGCKTPk5'-AAGTGCAAAGCCAGAAGA-3'1392FSIVnpAF397198141bpP卜:5'-TACTCCTCTGCATTGTCTCC-3'1513RP!:5'《ACCACCTCACCCAGACT墨3'I96FPRRSVnpAY035959128bpPk5'(GGCAGCATAAACTCAAC-3'324RPh:5'"CCTTACCTGGGTCCCGAATG-3'273FFMDVVP1X00871263bpP卜:5'《CCGAGTGGCTTTGATGO-3'535R表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖和呼吸纟^^癥寡核苷酸^l十編號、序列組其特點如下表所述<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表4(3)制備芯片片基處理用APTES溶，稱寸Goldseal碌烷化玻片進行處理，離心甩干，經掃描后，選取背景均一且背景值較低的氨基化片基室溫千燥，保存以備用。具體可參照ESJ七芯片片基制備的標準化操作方案。豬細小病毒(PPV)、豬圓環病毒(PCV)、豬瘟病毒(CSFV)芯片設計為6X4的陣列，見圖l，每個探針橫向重復打印2個點。陣列中的PC位點為熒光標己探針，起禾標位置的作用，B位點為空白對照點樣緩沖液，SCl和SC2為病毒檢測的陽t鈔卜對照，起監視體系的作用，其中SCl為DNA病毒的附ft^卜對照探針，SC2為RNA病毒的陽性外對照探針，V1-V3分別代表所檢觀啲病毒基因，其中深色位點表示正鏈的寡核苷針，淺色位點標負鏈的寡核苷酸探針，正、負鏈探針可互為陰性、陽性對照。豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖和呼吸綜合癥這四種病毒共設計8^60mer01igo陽性和附性檢測探針以及陽性質控、陰性指控探針各l條，另外加上空白對照，將芯片設計成6X6的陣列。陣列設計方案見圖2。(4)單鏈DNA片段的制備普ffiPCR擴增的反應體系為25tU，含有5"110XPCRbuffer,2ul2.5腿ol/LdNTP，2ul模板，20umol/L的上、下游引物別.625lU，0.5y1TaqDNA聚合酶(3M/ul)，力口dd恥至終體積25ul。PCR反應^(牛95°C5力H中；95°C30秒，51°C30秒，72°C30秒，30個循環；72°C5^H中。收數CR產物經l.5%的瓊月識凝膠電泳觀察結果。經普MPCR實驗5li正，所設計引物的特異性良好，引物特異性驗i正結果見圖3。其中，M泳道表示DNAMarkerDL2000，1、2泳道^PPV的NS基因片段，3、4泳道表示PPV的W基因片段。從電泳結果可知擴增產物大小正確，無非特異性條帶，所用的種特異性引物間沒有交叉擴增的現象，證實了這些弓l物的特異性良好。(5)驗證不對稱PCR單鏈產物經艦上述引物特異性驗證后，通過不對稱PCR前珠制備ss-DNA，在不X^爾PCR體系中摻入aa-dUTP，以備下一頻行間接熒光l射己。25u1不X^爾PCR反應體系為:Virus模板2ti1、10Xreactionbuffer2.5u1、MgC12solution2.5u1、dNTP每種、濃度為2.5mM(dATP0.5ii1、dGTP0.5u1、dCTP0.5u1、dTTP0.3u1、aa-dUTP0.2Ul，其中，dTTP和aa-dUTP的比例固定為3:2)、Primer:P卜/P卜.(20uM)0.625ul、P卜/P卜(0.2yM)0.625ul比例為100:1、TagDNApolymerse(3M/L)0.5ul、無菌水補至25wl。不對稱PCR反應條件同每種病毒各自擴增割牛，不同的是循環數增加至40個循環。圖4為不X訴爾PCR擴增結果。其中，M泳道表示DNAMarkerDL2000;l泳道表示上下游引物摩爾比為IOO:1的不X^爾PCR產物；2泳道表示上下游弓嫩摩爾比為50:1的不對-^PCR產物；3泳道表示普31PCR產物。經12%聚丙烯凝膠電泳分離后，不對稱PCR產物中出現2條分子量較接近的條帶，雙llDNA產物與同時電泳的普iiPCR產物^量大小一致，略有滯后的條帶是單鏈擴增產物，即單IIDNA產物。圖5為引物特異性跑膠^i正結果圖。其中，M泳道表示DNAMarkerDL2000，1、2泳道表示PPVNS1基因片斷，3、4泳道表示PPVVP2基因片斷。圖6為樣品與芯片雜交后用Genepix4000B掃描儀掃描的結果圖。從雜交結果可看出所有病毒基因的陽性寡核苷酸探針都離寺異性地與相應樣品雜交，能檢領倒較強的熒光信號，而空白對照和陰性對照基本不能檢測到熒光信號。權利要求1.一種病毒病原高通量快速排查檢測方法，其特征在于，該方法的實現步驟包括(1)制備芯片探針設計，芯片點制，得寡核苷酸芯片；(2)待測樣本處理(2.1)引物的設計合成得到與待檢測病原對應的引物；(2.2)生成單鏈DNA產物用與待檢測病原對應的引物對待測樣本進行同步不對稱PCR擴增，生成與寡核苷酸探針特異性互補的單鏈DNA產物；(2.3)標記熒光物質在單鏈DNA產物上標記熒光物質，形成標記上熒光物質的單鏈DNA產物；(3)雜交將標記上熒光物質的單鏈DNA產物與寡核苷酸芯片雜交，清洗芯片；(4)檢測分析用熒光掃描儀掃描，得到病毒檢測分析結果。2.根據權利要求1所述的病毒病原高通量決速排査檢測方法，其特征在于，所述制備芯片的步驟包括(1)探針的設計根據病毒基因組保守序列設i討寺異性強的寡核苷^^針；(2)芯片點制先進行片基表畫針布處理，然后纟十按照設計的陣列固定在片基上，制備成寡核苷酸芯片，進行芯片點樣后處理，得寡核苷酸芯片。3.根據權利要求1或2戶腿的病毒病原高通量決速排査檢測方法，其特征在于，所述標記熒光物質的步驟是(1)單鏈樣本的間接熒光標己通過不X訴^PCRJf入的MS烯丙基和熒光分子cy3或cy5上的琥珀M胺基團進fi^接，使不對稱PCR單鏈產物連接上熒光^H己分子；(2)fH己產物的純化將熒光^H己產物用AmershamG"25柱進行純化，除去未liH己的游離熒光分子，得純化后的熒光標記的樣本，置于-2(TC避光保存，備雜交用。4.根據權利要求3戶;M的病毒病原高通量決速排査檢測方法，其特征在于，戶;M的熒光掃描儀為GenePix4000B掃描儀。5.根據權利要求4戶腿的病毒病原高通量決速排查檢測方法，期寺征在于，戶脫的引物設計合成中弓嫩的選出方案是引物長度15—30個，引物鵬鄉M^隨機分布，G+C含量在45-55%,引物自身不形成二級結構，引物之間無互補序列，引物序列是被檢病毒特異的，引物3'端IK與模feDNAE^，引物3'^石Jtt以選T、C或者G。6.根據權利要求5戶腿的病毒病原高通量快速排查檢測方法，^#征在于，戶脫的探針設計方案是Tm值為85。C土5。C，00含量為50%~60%，重復的單一^S連續《6個，探針力^的二級結構酉樹M長度《6bp，合^jg的弓i物和寡核苷^^針用滅菌7jC溶解，弓l物終農度為20pmol/ul，探針終濃度為25pmol/iil;或合成后的寡核苷酸^lf用無菌水溶解至濃度為50uM/L，同2Xspottingbuffer1:l混合使其點樣終濃度調整為25uM/L。7.根據權利要求6戶;M的病毒病原高通量決速排查檢測方法，期寺征在于，戶皿單鏈樣本的間接熒光豐射己的步驟是取6嘴千燥的cy染料，力口5ul的DMSO室溫避光孵育l小時；用30tU0.1MPH9.3Na2CO3充分溶解純化后的不對禾敘CRss-DNA，然后立即轉移至孵育好的cy熒光染料中，吹吸混勻，室溫避光反應l小時，每隔105>^溫和震蕩1分沐加入10iil4M羥胺，使夢勁安終濃度為1M，室溫靜置15分鐘。8.根據權利要求6戶，的病毒病原高通量^I排査檢測方法，^#征在于，戶，的將桐H己上熒光物質的單IIDNA產物與寡核苷酸芯片雜交的步驟是將熒光標己的樣本與lX以l:9的體積比混合，95。C變性3分鐘，使二級莖環結構解能取混合樣品至芯片表面，置于雜交盒內60。C雜交；戶誠的雜交液為50%甲醐安、5XSSC、0.1XSDS以及1X旁旌撤NA。9.根據權利要求8戶;M的病毒病原高通量f^l排查檢測方法，其特征在于，所述的制備芯片包括片基處理，步驟是用APTES溶^X寸Goldseal硅烷化玻片進行處理，離心甩十，經掃描后，選取背景均一且背景值較低的氨基化片基室溫千燥，保存以備用。10.根據權利要求9戶，的病毒病原高通量快速排査檢測方法，—欺寺征在于，戶;M芯片清洗的步驟是取出芯片，立g卩mA清洗激中清洗2次，每次10併中；再轉入4。C保存的清洗M中清洗1(K刀H中，最后常溫下將芯片離心甩干。清洗激可采用6XSSC以及Triton-X102，清洗柯如可采用0.1XSSC以及Triton-X102。全文摘要一種病毒病原高通量快速排查檢測方法，其步驟是(1)探針設計、芯片點制得寡核苷酸芯片；(2)引物設計合成，得到與待檢測病原對應的引物；(3)生成單鏈DNA產物用與待檢測病原對應的引物對待測樣本進行同步不對稱PCR擴增，生成與寡核苷酸探針特異性互補的單鏈DNA產物；(4)在單鏈DNA產物上標記熒光物質，形成標記上熒光物質的單鏈DNA產物；(5)將標記上熒光物質的單鏈DNA產物與寡核苷酸芯片雜交，清洗芯片；(6)用熒光掃描儀掃描，得病毒檢測分析結果。本發明解決了
背景技術：
中豬疫病病毒檢測方法費時、費力，敏感性及特異性較低，檢測結果不準確的技術問題。本發明可對多種基因進行快速、準確、高效的檢測。文檔編號C12Q1/70GK101210270SQ20061010539公開日2008年7月2日申請日期2006年12月31日優先權日2006年12月31日發明者錚李,王小強,祁會彩,超陳,高金拽,鶴黃申請人:陜西北美基因股份有限公司