生長于木糖的非重組酵母屬菌株的制作方法

專利名稱：生長于木糖的非重組酵母屬菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及生產非重組酵母屬(Saccharomyces)菌株、酵母屬菌株和其應用的方法。
背景技術：
在本說明書中引用的所有參考文獻，包括任何專利或專利申請在此通過引用并入本文。并無承認任何參考文獻構成現有技術。對參考文獻的討論僅陳述作者的主張，并且本申請人保留質疑所引用文件的準確性和相關性的權利。應該很清楚的理解，盡管大量現有技術的出版物在本文中被引用，但這類參考文獻并不等同于承認任何的這些文件在澳大利亞或任何其它國家構成了本領域常規知識的一部分。
酵母菌的一類最重要的經濟群體是酵母屬(Saccharomyces)，它的菌株應用在釀造、烘培、制酒、蒸餾和各種其它依賴酵母的工業中。酵母屬的菌種是如Kurtzman(2003)FEMS Yeast Research 3417-432中通過系統發生學的方法所鑒定的，其中包括釀酒酵母(S.cerevisiae)，奇異酵母(S.paradoxus)，S.mikatae，S.cariocanus，S.kudriavzevii，巴氏酵母(S.pastorianus)和貝酵母(S.bayanus)。
酵母屬菌是用于轉化糖比如葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖為生物質，和用于發酵這些糖為乙醇的最有效微生物之一。因此，酵母屬菌，尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是在工業生產中應用最廣泛的微生物之一。例如，在啤酒釀造、蒸餾和酒工業中，酵母被用來將糖比如葡萄糖、果糖、蔗糖和/或麥芽糖發酵成乙醇。在燃料乙醇工業中，選擇釀酒酵母菌株的快速轉化高濃度的糖比如葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖的能力來產生高量的乙醇。在烘培工業中，發酵面包主要利用了釀酒酵母菌株從糖比如葡萄糖、果糖、蔗糖和/或麥芽糖產生二氧化碳的能力。釀酒酵母的其它應用包括酵母提取物和其它調味料和香料、酶原料比如轉化酶、各種生物化學物質、中間產物、蛋白質、氨基酸、核糖核酸和核苷酸輔因子以及維生素的生產。
在每年的工業生產中培養了幾百萬噸的酵母。因此，就酵母生物質的經濟化生產用于工業目的以及由酵母代謝經濟化生產副產物而言，酵母在豐富的可再生碳源上生長的能力很重要。尤其是酵母在其它工業生產的廢棄副產物上的生長能力具有環境和經濟的價值。因此，例如，經常通過使酵母在作為糖生產工藝中廢棄產物的糖蜜上，或在得自淀粉水解工業的富含葡萄糖和麥芽糖的糖漿上生長來生產面包酵母生物質。

發明內容
本發明提供產生能夠以期望的生長速率(比如每48小時至少一代)利用木糖作為唯一碳源生長的酵母菌株的方法、和以所述生長速率在木糖上生長的酵母菌株，及其用途。
木糖是一種可從植物生物質獲得的天然存在、豐富的并可再生的糖實例，在以前認為酵母不能利用木糖。見例如，Barnett et al.‘YeastsCharacteristics and Identification’2ndedition(1990)，CambridgeUniversity Press，其中描述了釀酒酵母種的酵母不能利用作為唯一碳源的木糖生長。木糖代表一種用于培養酵母和用來從酵母制造產品(包括乙醇)的主要的潛在資源。木糖作為酵母糖源的用途將提供巨大的經濟上和環境上的益處。例如，從富含木糖的材料生產燃料乙醇將是可再生能源的一種主要來源。
在第一方面，本發明提供了一種生產酵母屬菌株的方法，該菌株能夠使用木糖作為唯一碳源以期望的生長速率生長，其包括(a)提供酵母屬的遺傳多樣性非重組酵母細胞群體；(b)在允許酵母細胞間DNA組合的條件下培養酵母細胞；(c)對酵母細胞篩選或選擇具有增加的生長速率利用木糖作為唯一碳源生長的酵母細胞；(d)分離一種或多種具有期望的生長速率的酵母細胞。
典型的是，在允許成對酵母細胞間進行DNA組合的條件下培養酵母細胞。
典型的是，期望的生長速率是相對于沒有施用本方法的酵母屬菌株的酵母細胞的生長速率而言增加的生長速率。例如，酵母屬菌株比如菌株NL67。更典型的是，期望的生長速率是每48小時至少一代，更典型的是每24小時至少一代。
典型的是，通過在含木糖培養基中或上培養酵母細胞、對酵母細胞進行篩選或選擇，以尋求具有期望生長速率的酵母細胞。典型的是，含木糖培養基是含木糖培養物培養基。該培養物培養基可以包含木糖作為唯一碳源，或木糖可以是多碳源中的一種。典型的是，在含木糖培養基中木糖是唯一的碳源。典型的是，含木糖培養物培養基是木糖基本礦物培養基。酵母細胞通常在含木糖培養基上或中培養充分的時間以允許具有期望生長速率的酵母細胞利用木糖作為碳源生長。
在一個實施方案中，被篩選或選擇的酵母細胞形成遺傳多樣性非重組酵母細胞群體，并重復步驟(b)和(c)直至獲得具有期望生長速率的酵母細胞。
在一個實施方案中，在步驟(c)之前實施步驟(b)。在另一個實施方案中，在步驟(b)之前實施步驟(c)。在又一個實施方案中，同時實施步驟(b)和(c)。
在第二方面，本發明提供一種在培養中產生能夠利用木糖作為唯一碳源并以期望生長速率生長的酵母屬菌株的方法，其包括(a)提供酵母屬的遺傳多樣性非重組酵母細胞群體；(b)在允許酵母細胞間DNA組合的條件下培養酵母細胞；(c)通過在含木糖培養基上或中培養酵母細胞來篩選或選擇酵母細胞；(d)用經篩選或選擇的形成酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體的細胞重復步驟(b)和(c)，直至一種或多種酵母細胞已獲得利用木糖作為唯一碳源并以期望的生長速率生長的能力。
典型的是，該方法還包括步驟(e)，即分離一種或多種具有期望生長速率的酵母細胞。在一個實施方案中，被分離的一種或多種酵母細胞是酵母屬的一種菌株。在另一個實施方案中，被分離的一種或多種酵母細胞是遺傳多樣性酵母細胞群體。
在一個實施方案中，在步驟(c)中選擇酵母細胞。可以在步驟(c)中通過在含木糖培養基上或中對酵母細胞培養足夠的時間以允許能在作為唯一碳源的木糖上生長的酵母細胞利用木糖作為碳源生長、然后收集生長的酵母細胞來選擇酵母細胞。可以在步驟(c)中通過在含木糖培養基上或中培養酵母細胞足夠的時間以允許具有增加的生長速率利用木糖作為唯一碳源的酵母細胞利用作為碳源的木糖進行生長來選擇酵母細胞，然后收集生長的酵母細胞。
在另一個實施方案中，酵母細胞在步驟(c)中被篩選。可以在步驟(c)中通過在含木糖培養基上或中培養酵母細胞足夠的時間以允許具有增加的生長速率并利用木糖作為唯一碳源的酵母細胞利用作為碳源的木糖進行生長來篩選酵母細胞，然后收集具有增加的生長速率并利用木糖作為碳源的酵母細胞。
也可以預見到，可以在重復步驟(b)和(c)的部分中選擇酵母細胞，并在重復步驟(b)和(c)的部分中篩選酵母細胞。
可以重復步驟(b)和(c)任意次，該次數足以獲得能夠以期望的生長速率生長并利用木糖作為唯一碳源生長的酵母菌株。本領域的技術人員應該理解的是，重復步驟(b)和(c)的次數將取決于所應用的培養基、起始酵母菌株、培養條件等。在一個實施方案中，步驟(b)和(c)被重復至少一次，典型的是至少2次，更典型的是至少5次，甚至更典型的是至少10次，仍然更典型的是至少20次，優選至少30次。
酵母細胞可以在含木糖的固體培養基上或液體培養基中進行篩選或選擇。在一個實施方案中，細胞在含木糖固體培養基上進行篩選或選擇。在另一個實施方案中，細胞在含木糖液體培養基中進行篩選或選擇。在又一個實施方案中，細胞在含木糖固體培養基上進行篩選或選擇，然后在含木糖液體培養基中進行篩選或選擇。例如，可以通過使用含木糖固體培養基多次重復步驟(b)和(c)篩選或選擇酵母細胞，然后使用含木糖液體培養基多次重復步驟(b)和(c)實施篩選或選擇。
含木糖固體培養基可以是任何含有木糖作為碳源的固體培養基，其對能利用木糖作為唯一碳源的菌株提供選擇優勢。例如，含木糖固體培養基可以是復合固體培養基，其中木糖是多種碳源中的一種，或者含木糖固體培養基可以是固體基本培養基，其中木糖是唯一的碳源。典型的是，含木糖固體培養基是包含木糖作為唯一碳源的固體基本培養基。
含木糖液體培養基可以是含有木糖作為碳源的任何液體培養基。例如，含木糖液體培養基可以是復合液體培養基，其中木糖是多種碳源中的一種，或者含木糖液體培養基可以是液體基本培養基，其中木糖是唯一的碳源。典型的是，含木糖液體培養基是含有木糖作為唯一碳源的液體基本培養基。典型的是，液體基本培養基是含木糖作為唯一碳源的基本礦物培養基。
期望的生長速率通常是每48小時至少一代。期望的生長速率可以大于每24小時一代。期望的生長速率可以大于每12小時一代。期望的生長速率可以大于每10小時一代。期望的生長速率可以大于每8小時一代。期望的生長速率可以大于每4小時一代。期望的生長速率可以大于每2小時一代。
所生產的酵母屬菌株可以是自酵母屬中任一種的菌株，其能夠以期望的生長速率利用木糖作為唯一碳源生長。本領域的技術人員應該理解的是，所生產的菌株將取決于形成酵母屬非重組酵母細胞的遺傳多樣性群體的菌種。合適的酵母菌種的實例包括釀酒酵母，奇異酵母(S.paradoxus)，S.mikatae，S.cariocanus，S.kudriavzevii，巴氏酵母(S.pastorianus)和貝酵母(S.bayanus)。通常該菌株屬于釀酒酵母種。典型的是，該菌株能夠與同一種酵母接合。典型的是，該菌株能夠與釀酒酵母接合。
只要DNA的組合不是通過重組的方法，則酵母可以在允許酵母細胞間DNA組合的任何條件下培養。酵母細胞可以在允許酵母細胞間DNA組合的條件下進行培養，例如通過接合或胞導作用、或其它任何除重組方法之外的其它任何本領域已知用于酵母細胞間DNA組合的方法。在一個實施方案中，酵母細胞在允許酵母細胞接合的條件下進行培養。典型的是，酵母的接合包括促使酵母形成孢子、使孢子萌發和使萌發的孢子接合。用于酵母接合的方法對本領域的技術人員是已知的，并描述于，例如，Fowell(1969)“Sporulation and hybridization of yeast”in，theYeasts(AH Rose and JS Harrison，eds.)，Academic Press；EuropeanPatent EP 0 511 108 B；Attfield and Bell(2003)“Genetics and classicalgenectic manipulations of industrial yeasts”in，Topics in CurrentGenetics，Vol 2.Functional Genetics of Industrial Yeasts(J.H.de Winde，ed.)，Springer-Verlag Berlin Heidelberg或其組合。
遺傳多樣性非重組酵母細胞群體可以是來自任何來源的天然酵母屬分離物、酵母屬的自發突變分離物、或其可以通過使一種或多種酵母屬菌株暴露于誘變劑而獲得。遺傳多樣性非重組酵母細胞群體可以是來自單一物種的菌株，或可以是來自多個種的菌株。適合作為非重組酵母細胞遺傳多樣性群體使用的種包括釀酒酵母，奇異酵母(S.paradoxus)，S.mikatae，S.cariocanus，S.kudriavzevii，巴氏酵母(S.pastorianus)和貝酵母(S.bayanus)。菌株通常是屬于釀酒酵母的菌株。典型的是，該菌株能夠與酵母屬的同一種接合。典型的是，該菌株能夠與釀酒酵母接合。
本領域技術人員應該理解的是，除了遺傳歧化非重組酵母細胞群體之外，酵母細胞也可以作為分離的群體包括在步驟(b)和(c)中。
在第三方面，本發明提供一種產生利用木糖作為生長唯一碳源具有增加的生長速率的酵母屬菌株衍生物的方法，其包括(a)以酵母屬遺傳多樣性酵母細胞群體的一部分提供該菌株的酵母細胞；(b)在允許該群體的酵母細胞間DNA組合的條件下培養酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體；(c)對酵母細胞篩選或選擇在木糖上具有增加的生長速率的菌株衍生物；(d)分離一種或多種菌株衍生物，其相對于利用木糖作為生長唯一碳源的菌株的生長速率而言利用木糖作為生長唯一碳源具有增加的生長速率。
通常通過在含木糖培養基上或中培育酵母細胞來進行酵母細胞的篩選或選擇。
在一個實施方案中，在步驟(c)中選擇酵母細胞。可以通過在含木糖培養基上或中培養酵母細胞足夠的時間以允許能夠在作為唯一碳源的木糖上生長的酵母細胞利用木糖作為碳源生長的方法，從而在步驟(c)中選擇酵母細胞。可以通過在含木糖培養基上或中培養酵母細胞足夠的時間以允許具有增加生長速率并利用木糖作為唯一碳源的酵母細胞利用木糖作為碳源生長的方法而在步驟(c)中選擇酵母細胞。
在另一個實施方案中，在步驟(c)中篩選酵母細胞。可以通過在含木糖培養基上或中培養酵母細胞足夠的時間以允許利用木糖作為唯一碳源具有增加的生長速率的酵母細胞利用木糖作為碳源生長，然后收集利用木糖作為碳源生長最快的酵母細胞，從而在步驟(c)中篩選酵母細胞。
通常可以重復步驟(b)和(c)，由此衍生物形成遺傳多樣性酵母屬菌株群的至少部分，直至一種或多種衍生物在作為生長唯一碳源的木糖上已經獲得增加的生長速率。
在過去，為解決釀酒酵母不能利用木糖的問題，其他人已經使用重組DNA的方法引入從能夠利用木糖作為碳源的酵母中獲得的基因以賦予酵母利用木糖的能力(例如，Sonderegger and Sauer(2003)Appliedand Environmental Microbiology 691990-1998)。在這些方法中，有關木糖利用的基因已經從能夠利用木糖生長的有機體中被克隆，并且接下來被引入釀酒酵母。例如，已經將來自Piromyces spp.的真菌木糖異構酶整合到釀酒酵母的基因組中以產生在作為唯一碳源的木糖上緩慢生長的菌株(Kuyper et al.2003)。也已經將來自具柄畢赤酵母(Pichia stipitis)的木糖還原酶克隆到釀酒酵母中，產生能夠利用木糖作為唯一碳源生長的酵母(Wahlbom et al.2003)。
非重組釀酒酵母“被普遍的認為是安全的”(GRAS)，如果重組技術被用來開發利用木糖的釀酒酵母，那么它們就喪失了GRAS的地位。因此，使用含有來自其它屬或種的基因、或通過重組DNA方法獲得的釀酒酵母菌株在工業上或經濟上不一定有好處、合乎期望或合適。實際上，通過重組DNA方法獲得的菌株沒有工業上的益處，并且在利用這類菌株的方面有社會的、或環境-政治的或其它的障礙。
使用重組DNA技術會降低在人的食品等等中應用酵母的機會和理想性，然而非重組菌株可以有利的用于人的食品等等。使用非重組酵母同時用于乙醇和人食品的能力提供了改善基于酵母工藝的經濟效益的機會。例如，有可能利用非重組酵母來轉化木糖成為乙醇和酵母生物質。乙醇可以用于燃料和其它應用，而所生成的酵母可用于其它有價值的應用，比如提取物或其它副產物的生產。
本發明人已經發現，當酵母屬非重組野生型菌株在包含木糖作為唯一碳源的培養基上進行培養時，能檢測到其在木糖上非常緩慢的生長。這與明確指出酵母不能在木糖上生長的現有技術是矛盾的。本發明人相信，酵母在木糖上的生長是如此慢以致于在以前并沒有被檢測到。正如在本文中描述的，本發明人已經發現當用野生型釀酒酵母接種含有木糖作為唯一碳源的基本礦物培養基時，其在30℃下培養2個月后，通過顯微鏡檢查集落，可檢測到生長。盡管能檢測到的生長允許應用非重組策略來獲得具有改善生長速率的酵母，但是所觀察到的極慢生長速率沒有工業利用價值。
本發明人已經擴展了對于酵母屬菌能夠在作為唯一碳源的木糖上非常緩慢生長這一發現，用于開發能夠在作為唯一碳源的木糖上比沒有應用本發明方法的酵母屬菌株以高得多的速率生長的酵母屬菌株。在本發明的發現之前，沒有想到有可能通過在含木糖作為唯一碳源的培養基中或上培養酵母屬酵母細胞而對能夠在木糖上生長的酵母細胞進行任何選擇和富集作用，因為人們相信木糖被看作不能被酵母屬菌利用的碳源，所以酵母在培養基中將不會生長。然而，通過使用他們的發現和選擇策略和方法的組合，比如酵母屬遺傳多樣性菌株群體、合適的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的接合，本發明人已經發現，能夠生成可以在含木糖作為唯一碳源的固體培養上和/或液體培養基中比沒有應用本發明方法的那些酵母屬菌株以更高的速率生長的酵母屬菌株。此外，本發明人已經發現，通過應用選擇策略和方法，比如酵母屬遺傳多樣性菌株的接合，可以產生利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的酵母屬菌株，并且在一些有益的實施方案中，其生長速率可以大于每4小時一代。因此，通過使用非重組方法，本發明人已經能夠生成可以在含木糖作為唯一碳源的液體培養基中和固體培養基上以具有工業利用價值的速率生長的酵母屬菌株。
在第四方面，本發明人提供一種按本發明第一到第三方面的方法產生的酵母屬菌株。
在第五方面，本發明人提供一種分離的酵母屬菌株，其能夠利用木糖作為生長的唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長，其中所述菌株(i)當在Test T1具體說明的條件下生長時，產生增加5倍的生物質；和(ii)當在Test T2具體說明的條件下生長時，產生至少10mg干重的生物質，并且所述菌株是按照第一到第三方面的方法生產的。
在第六方面，本發明提供一種分離的酵母屬菌株，其能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長，其中(i)當在Test T1中具體說明的條件下生長時，菌株產生增加10倍的生物質；和(ii)當在Test T2中具體說明的條件下生長時，菌株產生至少50mg干重的生物質；和(iii)在Test T3中具體說明的條件下，檢測到至少0.1g/l的乙醇；和(iv)在Test T4中具體說明的條件下，于30℃，每mg蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；和(v)在Test T5中具體說明的條件下，于30℃，每mg蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；和其中所述菌株是按第一到第三方面的方法生產的。
在第七方面，本發明提供一種分離的酵母屬菌株，其能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長，其中(i)當在Test T1中具體說明的條件下生長時，菌株產生增加至少5倍的生物質；和(ii)當在Test T2中具體說明的條件下生長時，菌株產生至少40mg干重的生物質；和(iii)在Test T4中具體說明的條件下，于30℃，每mg蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；和(iv)在Test T5中具體說明的條件下，于30℃，每mg蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；和(v)在Test T7中具體說明的條件下，菌株產生增加至少5倍的生物質；和(vi)在Test T8中具體說明的條件下，檢測到濃度至少為0.04g/l的乙醇；并且其中所述菌株是按第一到第三方面的方法生產的。
在第四到第七方面的一個實施方案中，在Test T9中具體說明的條件下，在4個月期間所述菌株產生至少0.2g/L的乙醇。
在第八方面，本發明提供一種分離的酵母屬菌株，其能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的速率生長，其中所述菌株利用作為唯一碳源的木糖的能力是通過非重組方法獲得的。
菌株的生長速率可以是每48小時至少一代的任意速率。生長速率可以是每36小時至少一代。生長速率可以大于每24小時一代。生長速率可以大于每12小時一代。生長速率可以大于每10小時一代。生長速率可以大于每8小時一代。生長速率可以大于每6小時一代。生長速率可以大于每4小時一代。生長速率可以大于每2小時一代。生長速率可以大于每80分鐘一代。
在一個實施方案中，菌株能夠使用木糖作為唯一碳源以菌株利用葡萄糖作為唯一碳源生長時基本相同的生長速率生長。
在一個實施方案中，菌株在木糖基本礦物培養基上具有每48小時至少一代的生長速率。
在一個實施方案中，當在Test T1中具體說明的條件下生長時，菌株產生增加2倍的生物質。典型的是，當在Test T1中具體說明的條件下生長時，菌株產生增加至少5倍的生物質。合適的是，當在Test T1中具體說明的條件下生長時，菌株產生增加至少10倍的生物質。
在一個實施方案中，當在Test T2中具體說明的條件下生長時，菌株產生每50ml培養物至少0.01g干重的生物質。
在多個實施方案中(i)在Test T4中具體說明的條件下，菌株表達一種具有至少1單位木糖還原酶活性的非重組酶；(ii)在Test T5中具體說明的條件下，菌株表達具有至少1單位木糖醇脫氫酶活性的非重組酶；(iii)菌株在Test T4中具體說明的條件下表達具有至少1單位木糖還原酶活性的非重組酶，在Test T5中具體說明的條件下，所述菌株表達具有至少1單位木糖醇脫氫酶活性的非重組酶。
在第九方面，本發明提供一種分離的酵母屬菌株，其能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長，并且能夠表達具有選自木糖還原酶和木糖醇脫氫酶之中的活性的非重組酶，其中當通過test T4確定時木糖還原酶活性是至少1單位，當在test T5中具體說明的條件下確定時，木糖醇脫氫酶活性是至少1單位。
菌株能夠表達具有木糖還原酶活性的非重組酶和具有木糖醇脫氫酶活性的非重組酶。在一個實施方案中，菌株除了能表達一種或多種具有選自木糖還原酶和木糖醇脫氫酶之中的活性的非重組酶，還能夠表達一種具有木酮糖激酶活性的非重組酶。典型的是，當通過test T6確定時，木酮糖激酶活性是至少5單位。
典型的是，第九方面的菌株具有利用木糖作為唯一碳源每48小時至少一代的生長速率。
在一個實施方案中，當在Test T1中具體說明的條件下生長時，菌株產生至少增加2倍的生物質。典型的是，當在Test T1中具體說明的條件下生長時，菌株產生至少增加5倍的生物質。更典型的是，當在testT1中具體說明的條件下生長時，菌株產生至少增加5倍的生物質。
在test T2中具體說明的條件下菌株可以產生至少10mg干重的生物質。在test T2中具體說明的條件下菌株可以產生至少30mg干重的生物質。在test T2中具體說明的條件下菌株可以產生至少40mg干重的生物質。典型的是，在test T2中具體說明的條件下菌株可以產生至少50mg干重的生物質。
當在Test T2中具體說明的條件下生長時，菌株每50ml培養物可以產生至少0.01g干重的生物質。
酵母屬菌株能夠進一步利用木糖醇作為唯一碳源生長。典型的是，菌株利用木糖醇作為唯一碳源的能力是通過非重組方法獲得的。
在一個實施方案中，當在Test T7中具體說明的條件下生長時，菌株產生增加至少5倍的生物質。
酵母屬菌株可以是能夠利用木糖作為唯一碳源進行好氧或厭氧生長。典型的是，生長是需氧生長。然而，酵母屬菌株也可以利用木糖作為唯一碳源以厭氧或微需氧方式生長。
酵母屬菌株可以使能夠在厭氧條件下在葡萄糖上生長。
酵母屬菌株可以進一步地能夠利用木糖產生一種或多種基于碳的化合物(carbon-based compound)。合適的基于碳的化合物實例包括醇、木糖醇、有機酸比如乙酸、甘油、二氧化碳或其它酵母成分、代謝物和副產物包括酵母提取物、蛋白質、肽、氨基酸、RNA、核苷酸、葡聚糖，等等。通常醇是乙醇。
當在木糖上生長時菌株可以產生乙醇。菌株可以利用木糖產生乙醇，但不在木糖上生長。菌株可以從木糖產生乙醇。典型的是，菌株發酵木糖產生乙醇。
在Test T3中具體說明的條件下菌株可以產生濃度至少為0.1g/L的乙醇。
在Test T8中具體說明的條件下菌株可以產生濃度至少為0.4g/L的乙醇。
在Test T9中具體說明的條件下，菌株可以在4個月期間產生至少0.2g/L的乙醇。
當菌株以至少5×108細胞/ml的細胞密度接種到含木糖基本礦物培養基中時，菌株可以產生至少0.5g/L的乙醇。含木糖基本礦物培養基可以含有葡萄糖。典型的是，菌株在接種培養基5小時內產生0.5g/L的乙醇。
在一個實施方案中，在Test T3中具體說明的條件下菌株發酵木糖產生每升培養物至少0.05克的乙醇。
菌株可以在固體培養基上、和/或液體培養基中利用木糖作為唯一碳源。在一個實施方案中，菌株能夠在含木糖作為唯一碳源的液體培養基中生長。液體培養基可以是含木糖作為唯一碳源的液體礦物培養基。
酵母屬菌株可以是酵母屬任一種的菌株。合適的酵母種的實例包括釀酒酵母，奇異酵母，S.mikatae，S.cariocanus，S.kudriavzevii，巴氏酵母和貝酵母。通常所述種是釀酒酵母。通常該菌株將能夠與酵母屬的相同種接合。典型地，該菌株將能夠與釀酒酵母接合。典型地，該菌株是釀酒酵母。
在第八或第九方面的一個實施方案中，酵母屬菌株是重組體。
在第十方面中，本發明提供了一種分離的非重組酵母屬菌株，其在Test T1中具體說明的條件下產生增加至少2倍的生物質。
在一個實施方案中，生物質增加了至少5倍，通常是至少10倍。
在第十一方面中，本發明提供了一種分離的非重組酵母屬菌株，其具有以下的特征(a)在test T1中具體說明的條件下菌株的生物質增加至少5倍；(b)在test T2中具體說明的條件下產生至少10mg干重的生物質。
在第十二方面中，本發明提供一種分離的非重組酵母屬菌株，其具有以下特征(a)在test T1中具體說明的條件下菌株的生物質增加至少10倍；(b)在test T2中具體說明的條件下產生至少50mg干重的生物質；(c)在Test T3中具體說明的條件下檢測到至少0.1g/L濃度的乙醇；(d)在Test T4中具體說明的條件下，于30℃，每mg的蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；和(e)在Test T5中具體說明的條件下，于30℃，每mg的蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H。
在第十三方面，本發明提供一種分離的非重組酵母屬菌株，其具有以下特征(a)在test T1中具體說明的條件下菌株的生物質增加至少5倍；(b)在test T2中具體說明的條件下產生至少40mg干重的生物質；(c)在Test T7中具體說明的條件下菌株的生物質增加至少5倍；(d)在test T8中具體說明的條件下檢測到至少0.04g/L濃度的乙醇；(e)在Test T4中具體說明的條件下，于30℃，每mg的蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；和(f)在Test T5中具體說明的條件下，于30℃，每mg的蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H。
能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的合適酵母屬菌株的實例是按國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約保存在澳大利亞政府分析實驗室，1 Suakin Street，Pymble，NSW 2073，澳大利亞的那些菌株，保存號為NM04/41257，NM04/41258，NM05/45177(ISO 10)和NM05/45178(ISO 7)。保存號NM04/41257和NM04/41258的菌株是保存于2004年5月12日。保存號NM05/45177和NM05/45178的菌株是保存于2005年5月16日。
酵母屬菌株可以按照本文中所給出的任何方法獲得，其中利用木糖作為唯一碳源生長的能力是通過非重組的方法獲得的。用來獲得菌株的方法包括組合、自然選擇、接合方式、誘變、或其它為本領域技術人員已知的以及在例如Attfield和Bell(2003)“Genetics and classical geneticmanipulations of industrial yeasts”in，Topics in Current Genetics，Vol 2.Functional Genetics of Industrial Yeasts(J.H.de Winde，ed.)，Springer-Verlag Berlin Heidelberg中討論和提及的所謂常規遺傳方法，或其組合。
利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的速率生長的能力通常是通過酵母屬菌株間的接合和篩選或選擇利用木糖作為唯一碳源時具有增加的生長速率的方法獲得的。
例如，可以通過在有性相容的酵母屬菌株間實施稀少或定向或群體接合、接下來選擇能利用木糖作為唯一碳源的菌株而獲得所述菌株。所述菌株可以得自一種或多種天然出現的酵母屬分離物、自發突變的分離物、或可以使一種或多種酵母屬菌株暴露于誘變劑并隨后用于接合和選擇策略來篩選或選擇能夠利用木糖作為唯一碳源的突變株而獲得的。所獲得的菌株可以按本文中給出的任一選擇方法進行選擇。
在第十四方面中，本發明提供第四到第十三方面的菌株的衍生物。
用于產生酵母菌株衍生物的方法在本領域是眾所周知的，包括與其它酵母菌株間的接合、細胞融合、誘變、和/或重組方法。
在第十五方面中，本發明提供第四到第十五方面的酵母屬菌株、或第十四方面的衍生物在生產酵母生物質中的用途。酵母生物質可以在例如焙烤工業中被用于生物質產品。
在第十六方面中，本發明提供第四到第十三方面的酵母屬菌株、或第十四方面的衍生物在從木糖生產乙醇中的應用。
在第十七方面中，本發明提供一種用于生產乙醇的方法，其包括在允許菌株發酵木糖產生乙醇的條件下用含木糖培養基培育第四到第十三方面的酵母屬菌株、或第十四方面的衍生物。
在第十八方面中，本發明提供一種使木糖轉化成生物質的方法，其包括在允許菌株利用木糖作為唯一碳源生長的條件下用含木糖培養基培養第四到第十三方面的酵母屬菌株、或第十四方面的衍生物。
在第十九方面中，本發明提供一種生產酵母生物質的方法，其包括使酵母屬菌株在含木糖培養基上或中生長，其中利用木糖作為碳源生長產生至少部分酵母生物質。
在第二十方面中，本發明提供一種從酵母屬菌株生產化合物的方法，其包括在允許產生所述化合物的條件下在含木糖培養基上或中培養酵母屬菌株，其中通過菌株利用作為碳源的木糖生產所述化合物。
在一個實施方案中，通過菌株在利用木糖作為碳源的生長期間生產所述化合物。
在一個實施方案中，所述方法還包括收集所述化合物的步驟。
化合物可以是酵母屬菌株能夠產生的任何化合物。合適化合物的實例包括乙醇、CO2、酶、重組酶、重組蛋白、酵母副產物、維生素、核苷酸、核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、脂、酵母蛋白、木糖醇。
本領域技術人員應該理解的是，酵母細胞的生長將產生生物質，因此引起生長的任何方法將導致生物質的產生。因此，例如，從在含木糖培養基上的生產中生產乙醇將額外產生生物質。在一個實施方案中，化合物被包含在酵母細胞內的生物質中，可以使用本領域眾所周知的從酵母細胞提取化合物的方法從酵母細胞中收集所述化合物。
在第二十一方面，本發明提供一種按第十八方面方法生產的化合物。


圖1是顯示釀酒酵母菌株群體的平均倍增時間對在應用本發明方法之后的時間的圖。
發明的詳細說明除非另外指明，本發明的實施應用常規微生物學和經典的遺傳學方法。這些技術對本領域的技術人員是已知的，在文獻中有充分的解釋。參見，例如，Sherman et al.“Methods in Yeast Genetics”(1981)Cold SpringHarbor Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；EuropeanPatent number EP 0 511 108 B。
同樣應該理解的是，本文中應用的術語僅用于說明具體實施方案的目的，并無意限制本發明的范圍，其僅由所附的權利要求限定。必須說明的是，正如在本文中和所附權利要求中所用的，“一種(個)”和“這種(個)”這些代詞包括其復數形式，除非在上下文中另外清楚的指明。因此，例如，提及的“一種(個)細胞”包括多種(個)該細胞。除非另外的定義，所有在本文中使用的技術和科學術語具有與發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同意思。雖然與本文中描述相似或相當的任何材料和方法可以被用來實施或檢測本發明，但在本文中描述了優選的材料和方法。
所有在本文中所提及的出版物是引用來說明和公開出版物中報導的并且可以在本發明中使用的方案和試劑。本文中沒有任何內容應被解釋為承認本發明沒有權利因在先發明而早于這樣的公開內容。
木糖是一種便宜的糖，其能夠從可再生的資源中獲得，并且能夠大量的獲得。木糖代表半纖維素植物生物質的顯著部分。植物生物質包括農業殘余物、紙類廢物、木屑，等等，并且是可再生的，可以以低成本大量獲得。木糖主要以聚合物形式存在于半纖維素植物生物質中，該聚合物已知為木聚糖和半纖維素。或者通過化學手段比如酸水解或者通過使用酶比如木聚糖酶的酶方法，能夠很容易的將木糖多聚物降解為單體糖。例如在制紙工業中，木糖是廢物流中主要的糖之一，其促成生物需氧量(BOD)并由此使廢水的處理在環境上較困難。對于從硬木產生的每千克紙張，通常產生100克的糖，其中35克是木糖。因為它的豐富，木糖代表了一種主要的潛在碳源，可用于生產酵母生物質和酵母代謝副產物比如乙醇。
在一個方面中，提供了一種酵母屬菌株，其能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長。本發明人已經發現，有可能不需要使用重組DNA技術而獲得利用木糖作為唯一碳源相對快速生長的酵母屬菌株。這是一個沒有預料到的結果，因為在以前相信酵母屬菌株不能在作為唯一碳源的木糖上生長。直到本發明之前，能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的酵母屬菌株只能通過向酵母屬菌株引入從能夠在木糖上生長的其它有機體克隆的木糖利用基因來獲得。可選擇的是，非天然出現的克隆酵母基因啟動子和克隆酵母DNA序列的組合已經通過重組方法產生并且被引入酵母屬菌株。因此，在本發明之前，獲得能夠利用木糖作為唯一碳源的酵母屬菌株還沒有可能，除非已經自其它能夠在木糖上生長的有機體克隆了木糖利用基因并且以及導入了酵母菌株中，或者已將強酵母基因啟動子可操作連接了其它酵母DNA序列并使用重組DNA方法引入酵母屬菌株之中。
在本發明之前，沒有自酵母屬的非重組酵母能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長。美國專利No.4,511,656中公開了酵母菌株ATCC No.20618，它是一種非重組酵母突變體，當其在含木糖培養基中培養時能夠產生乙醇。然而，ATCC No.20618不是來自酵母屬。由ATCC No.20618所產生的集落的形態與由酵母屬菌株產生的集落的形態并不一致。ATCC No.20618不形成孢子，不與釀酒酵母的標準菌株接合，對ATCC No.20618的ITS區和組蛋白H3-H4基因間區測序表明其不屬于酵母屬，而是與熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)緊密相關。因此，ATCCNo.20618與Kurtzman(2003)FEMS Yeast Research 4233-245和本文中所定義的酵母屬在系統發生關系上相距較遠。熱帶假絲酵母眾所周知可以利用木糖。此外，在美國專利No.4,511,656中公開的突變體僅顯示出當其在生長培養基中提供有生長營養物比如酵母提取物、麥芽提取物和蛋白胨時產生乙醇。這些生長營養物提供了可替代木糖的可發酵碳源。因此，美國專利No.4,511,656沒有公開能夠靠作為唯一碳源的木糖生長、或將發酵的酵母屬菌株。
此外，美國專利No.4,511,656教導了在木糖上而非木糖醇上形成集落的能夠產生乙醇的酵母被選擇出來了。并不希望受限于理論，本發明人相信，與美國專利No.4,511,656中的教導相反，預計在木糖利用中作為中間產物的木糖醇的代謝對在木糖上的生長和從木糖產生乙醇是有益的。
本發明人已經發現，與現有技術的教導相反，不但酵母屬菌株可以在作為唯一碳源的木糖上非常緩慢的生長，而且利用木糖作為唯一碳源的酵母屬菌株的生長速率可以在無需引入克隆的木糖利用基因時增加。
在一個方面中，提供了一種分離的酵母屬菌株，其能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的速率生長。如在本文中所用的，酵母菌株是在Kurtzman(2003)FEMS Yeast Research vol.4 pp.233-245中所定義的酵母屬的菌株。
正如在本文中應用的，短語“能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的速率生長”表示所述菌株能夠利用作為唯一碳源的木糖產生能量和合成菌株生長所必需的分子，以獲得每48小時至少一代的生長速率。術語“一代”對于本領域的技術人員是非常清楚的，其表示細胞分裂的一個周期。優選地，該菌株能夠在木糖是唯一碳源的固體和液體培養基中生長。本領域的技術人員應該理解的是，能夠利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的菌株將能夠在基本礦物固體培養基上和/或液體培養基中生長，其中木糖是唯一碳源。一個合適的液體培養基的實例是市售的不合氨基酸的DIFCO Laboratories Yeast Nitrogen Base，其中含有培育酵母必需的所有基本無機鹽和維生素，但碳水化合物或氨基酸源除外，而在培養基中添加有0.01％到50％間的木糖，典型的是1％-10％的木糖，適宜的是5％的木糖。通常固體培養基是加入膠凝劑比如瓊脂而被固化的液體培養基。本領域技術人員也應該理解的是，能夠利用木糖作為唯一碳源生長的菌株也可以在許多其它糖上生長。菌株利用作為唯一碳源的木糖的能力是通過非重組方法獲得的。正如在本文中所用的，短語“非重組方法”表示不應用重組DNA技術使酵母屬菌株獲得利用木糖的能力的任何方法。換句話說，沒有應用重組方法將賦予菌株以利用木糖進行生長的能力的基因引入菌株中。正如在本文中所用的，“重組方法”是應用重組DNA技術將一種或多種基因引入有機體的方法。正如在本文中所用的，重組DNA技術表示其中在體外操作遺傳信息的技術，比如當從有機體中分離和克隆基因時。因此，非重組方法是不涉及遺傳信息體外操作的方法。非重組菌株是沒有引入重組核酸的菌株。
非重組方法可以包括例如誘變、經典的接合、胞導(cytoduction)、細胞融合比如原生質體融合，和其組合。非重組方法可以包括在允許酵母細胞間體內DNA組合的條件下培養酵母屬遺傳多樣性酵母細胞群體，和篩選或選擇利用木糖作為唯一碳源具有增加的生長速率的酵母細胞，通常是通過在含木糖培養基中或上培育酵母細胞的遺傳多樣性群體足夠的時間來選擇利用木糖作為唯一碳源時具有增加的生長速率的酵母細胞而進行的。
本領域的技術人員應該理解的是，賦予酵母屬菌株以利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的能力的遺傳信息是從酵母屬獲得的。換句話說，對于以每48小時至少一代的速率生長所必需的所有遺傳信息是從酵母屬基因庫中獲得的。典型的是，賦予酵母屬菌株利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的能力的遺傳信息是從非重組酵母屬菌株的遺傳多樣性群體中獲得的。正如上面討論的，在本發明之前，認為酵母屬的基因庫不含有能夠賦予利用木糖作為唯一碳源進行生長的能力的遺傳信息。
在另一個方面中，提供了分離的酵母屬菌株，其具有在作為唯一碳源的木糖上以每48小時至少一代的生長速率生長的能力，并且其能夠表達具有選自由木糖還原酶和木糖醇脫氫酶組成之組中的活性的非重組酶。如針對木糖還原酶的Test T4和針對木糖醇脫氫酶的Test T5所確定的，所述酶具有至少一個單位的活性。Test T4和T5如本文中定義。在一個實施方案中，木糖還原酶活性為至少1.5單位，合適的是至少3單位。在一個實施方案中，木糖醇脫氫酶活性為至少5單位，合適的是至少8單位。
本發明也提供用于產生酵母屬菌株的方法，所述菌株能夠利用木糖作為唯一碳源以期望的生長速率生長。“期望的生長速率”可以是比應用本發明方法之前的酵母屬酵母細胞的生長速率更大的任意生長速率。期望的生長速率將比在作為唯一碳源的木糖上釀酒酵母菌株NL67的生長速率更大。期望的生長速率可以是每48小時至少一代，合適的是大于每24小時一代，合適的是大于每12小時一代，典型的是大于每10小時一代，更典型的是大于每8小時一代，并且可以與在葡萄糖上的酵母生長速率同樣高，其大約是每80分鐘一代。
所述方法包括提供一種酵母屬遺傳多樣性酵母細胞群體。正如在本文中所用的，短語“遺傳多樣性非重組酵母細胞”表示具有獨特基因型的至少兩種非重組酵母細胞。遺傳多樣性非重組酵母細胞可以是從野生、從酒中、蒸餾和啤酒發酵、從烘培應用中、或從任何其它的酵母來源獲得的不同酵母屬菌株的酵母細胞混合物。酵母屬非重組酵母細胞的遺傳多樣性群體可以是得自形成孢子產生遺傳多樣性后代的一個單菌株。酵母屬非重組酵母細胞的遺傳多樣性群體可以包括酵母屬菌株的一種或多種酵母細胞，其已經被暴露于物理或化學誘變劑，比如例如紫外光、X-射線或γ射線、或甲磺酸乙酯、亞硝基胍、絲裂霉素C、博來霉素、或任何其它能夠引起DNA堿基序列改變的試劑。因此，遺傳多樣性非重組酵母細胞在其范圍內包括已經通過誘變產生的菌株的酵母細胞。酵母誘變、尤其是釀酒酵母誘變的方法對本領域的技術人員是已知的，并被描述于，例如，Sherman et al.“Methods in Yeast Genetics”(1981)Cold Spring Harbor LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，New York。酵母屬非重組酵母細胞的遺傳多樣性群體也可以包括具有自發形成的突變的酵母細胞。酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體可以都屬于相同的種，或者可以是酵母屬的不同種。典型的是，不同的種之間能夠互相接合。例如，遺傳多樣性非重組酵母細胞群體可以包含釀酒酵母的不同菌株，或獲得自上述來源的任何其它酵母屬種。合適酵母屬的種的實例包括釀酒酵母，奇異酵母，S.mikatae，S.cariocanus，S.kudriavzevii，巴氏酵母和貝酵母。典型的是，酵母屬遺傳多樣性酵母細胞群體是相同的種。典型的是，所述種是釀酒酵母。
能夠被用來提供遺傳多樣性非重組酵母細胞群體的起始接種物的酵母實例包括可以從眾所周知的培養物保藏單位獲得的酵母屬菌株，比如美國典型培養物保藏中心(ATCC)，例如，ATCC 4111，ATCC 26603，ATCC38559，國立酵母菌保藏中心(NCYC)例如釀酒酵母NCYC 995，NCYC996，真菌菌種保藏中心(the Central Bureau voor Schimmel Cultures)(CRBS)例如釀酒酵母CBS 745.95，CBS 755.95，或從商業可獲得的由任何公司出售的用于傳統制造比如烘培、釀造、酒、蒸餾等等的酵母中分離的菌株。
酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體在允許酵母細胞間DNA組合的條件下進行培養。酵母細胞間的DNA組合可以是任何適用于在至少兩個酵母細胞間DNA組合的方法，條件是該方法不是重組方法。用于酵母細胞DNA組合的合適方法的實例包括接合和胞導。正如本文中所用的，術語“接合”表示在至少兩個酵母細胞間DNA交換和重組的方法，其包括經典的遺傳接合方法、定向接合、群體接合(mass mating)、稀少接合(rare mating)、細胞融合，等等。例如，經典遺傳雜交或細胞融合可以被用來產生種內或種間雜交體。
在一個實施方案中，酵母細胞在允許酵母細胞間接合的條件下進行培養。典型的是，酵母細胞在允許通過使酵母細胞形成孢子、然后使產孢子的酵母接合而進行接合的條件下進行培養。例如，酵母細胞的接合可以通過(a)使酵母細胞形成孢子；(b)使已形成孢子的酵母細胞萌發；(c)使已形成孢子的酵母細胞的相容接合型雜交。典型的是，酵母細胞的接合是通過
(a)合并遺傳多樣性非重組酵母細胞群體；(b)使合并的細胞形成孢子并使孢子萌發而獲得單倍體細胞；(c)使單倍體細胞的相容接合型雜交以產生雜交酵母細胞。
形成孢子、獲得單倍體和單倍體的雜交以產生雜交酵母細胞的方法在本領域中是已知的，并被描述于例如“The Yeasts”，第1期(A.H.Rose和J.S.Harrison編)，1969，Academic Press，第7章，“Sporulation andHybridisation of Yeast”(R.R.Fowell著)；EP 0 511 108 B。典型的是，接合是群體接合。群體接合涉及以允許在相容接合型間發生接合的方式一起培養至少兩個、通常是幾百萬個不同的酵母細胞。群體接合方法被描述于，例如，Higgins et al.(2001)，Applied and Environmental Microbiology vol.67，pp.4346-4348；Lindegren(1943)，Journal of Bacteriology vol.46 pp.405-419。
在另一個實施方案中，酵母在允許細胞融合的條件下進行培養。使用細胞融合技術產生種內或種間雜交的方法被描述于，例如，Morgan(1983)Experientia suppl.46155-166；Spencer et al.(1990)，Yeast Technology，Spencer JFT and Spencer DM(eds.)，Springer Verlag New York。胞導方法被描述于，例如，Inge-Vechtomov et al.(1986)Genetika 222625-2636；Johnston(1990)n，Yeast Technology，Spencer JFT and Spencer DM(Eds.)，Springer Verlag New York；Polaina et al.(1993)Current Genetics 24369-372。
篩選或選擇酵母細胞中利用木糖作為唯一碳源生長時具有增加的生長速率的酵母細胞。篩選或選擇酵母細胞以富集或鑒別利用木糖作為唯一碳源時具有增加的生長速率的酵母細胞。酵母細胞的篩選或選擇通常是通過在含木糖的培養基上或中培育酵母細胞而進行的。篩選或選擇那些具有改善的利用木糖作為唯一碳源生長的能力的酵母細胞。改善的能力通常將是利用木糖作為唯一碳源的生長速率向所需生長速率的增加。生長速率的增加是相對于在允許酵母細胞間DNA組合的條件下培養所述酵母細胞之前該酵母細胞生長速率的增加。在一個實施方案中，酵母細胞被選擇。術語“被選擇”或“選擇”表示一種方法，其中具有改善的利用木糖作為唯一碳源以期望的生長速率生長的能力的酵母細胞在群體中被富集。酵母細胞的選擇可以通過在含木糖培養基上或中培育酵母細胞足夠的時間以允許酵母細胞能夠在作為唯一碳源的木糖上利用木糖作為碳源生長，并由此收集生長的酵母細胞而進行。本發明人已經發現，通過培育酵母細胞足夠的時間以允許甚至生長緩慢的酵母利用木糖作為碳源生長，并由此收集生長的酵母細胞，包括緩慢生長的酵母細胞，更快生長的酵母細胞將占所收集的酵母細胞中的更大部分，因此在所收集的酵母細胞中被富集，但是因為也包含緩慢生長的酵母細胞，故酵母細胞群體的遺傳多樣性基本上被維持。例如，通過在含木糖作為唯一碳源的固體基本培養基上平板接種接合的酵母細胞，能夠更快利用木糖作為唯一碳源的細胞將產生更大的集落，因而所述的那些細胞將被選擇出來并且期望的基因型在群體中得到富集。然而，通過也收集更小的克隆，群體的遺傳多樣性將在步驟(b)和(c)的下一重復中基本上被維持。因此，通過在含木糖培養基上培育酵母細胞足夠的時間以允許酵母細胞利用木糖作為碳源生長，有可能不僅選擇那些在木糖上具有增加的生長速率的酵母細胞，而且也維持用于步驟(b)和(c)重復循環群體的遺傳多樣性。可以通過減少酵母細胞在含木糖培養基上的培養時間使得只有在預選定的時間期間內利用木糖作為碳源生長的酵母細胞被選擇出來，由此實施增強的選擇。此型酵母細胞可以通過在含木糖培養基上或中培育酵母細胞足夠時間以允許利用木糖作為唯一碳源具有增加的生長速率的酵母細胞利用木糖作為碳源生長、并由此收集生長的酵母細胞而選擇出來。使用此方法，更大的選擇壓力被施加到酵母細胞上，以使其以增加的生長速率生長，但是因為有可能對于部分緩慢生長的酵母細胞而言時間不夠，對于進一步重復的步驟(b)和(c)，一些遺傳多樣性可能會丟失。
在另一個實施方案中，酵母細胞被篩選。正如在本文中所用的，術語“被篩選”或“篩選”表示一種方法，其中首先鑒別出具有改善的利用木糖作為生長唯一碳源以期望的生長速率生長的能力的酵母細胞，隨后分離出來。可以通過在含木糖培養基上或中培養酵母細胞足夠的時間以允許具有利用木糖作為唯一碳源以增加的生長速率生長的酵母細胞利用木糖作為碳源進行生長，并由此收集利用木糖作為碳源生長更快的酵母細胞，從而篩選酵母細胞。例如，具有改善的利用木糖作為唯一碳源生長的能力的酵母細胞可以在富含木糖培養基中被鑒定出來，因為與所述酵母細胞相比生長更快、因而形成更大集落的那些細胞沒有改善的利用木糖作為唯一碳源進行生長的能力。因此，在平板上顯現的更大集落將優先于更小集落而被分離，由此分離出具有改善的利用木糖作為生長唯一碳源以期望的生長速率進行生長的能力的酵母細胞。
正如上面所討論的，典型的是通過在含木糖培養基上或中培養酵母細胞來篩選或選擇酵母細胞。“含木糖培養基”可以是含有木糖、并且對利用木糖作為唯一碳源生長時比其它菌株更有效或更快進行生長的能力的那些酵母細胞提供選擇優勢的任何培養基。正如在本文中所用的，“選擇優勢”是細胞或菌株因為一些特性而比其它的細胞或菌株經歷更大量細胞分裂的能力，在此情況中是有效利用木糖生長的能力。因此，提供選擇優勢給菌株的培養基將允許該菌株在該培養基中比所述培養基未向其提供選擇優勢的其它菌株更快地生長。本領域技術人員應該理解的是，酵母可以在包括至少一種碳源、氮源、磷源、硫源、微量元素和維生素的多種培養基上生長。含木糖培養基可以是基本培養基或復合培養基。在一個實施方案中，含木糖培養基是基本培養基。合適的基本培養基可以包括，例如，加有濃度為0.1％-50％，典型的是2％-15％，更典型的是5％木糖的DIFCO YeastNitrogen Base Formulae(見Difco使用手冊“Dehydrated culture media andreagents for microbiology”10thEdition，Difco Labs 1984”)。在另一個實施方案中，含木糖培養基可以是復合培養基。在復合培養基中木糖的濃度可以為0.1％-50％，典型的是2％-30％，更典型的是2％-15％。在一個實施方案中，復合培養基可以是完全豐富培養基。完全豐富培養基的實例其中包含0.5％-2％、優選0.5％的酵母提取物，0.5％-2％、優選1％的蛋白胨和濃度為0.5％-50％、典型的是2％-15％，更典型的是5％的木糖的培養基。在另一個實施方案中，復合培養基選自由糖蜜、淀粉水解產物、纖維素性或半纖維素性生物質水解產物(比如甘蔗渣、秸稈、木紙漿、稻草、廢紙，等等)和其組合組成的組，并可選地添加木糖，和/或營養物。本領域的技術人員應該理解的是，固體培養基可以是通常添加有1％-10％瓊脂、更通常為1％-5％瓊脂，仍然更通常的是1％-2％瓊脂的任何上述培養基。
可以通過在固體和/或液體培養基上培養細胞來篩選或選擇酵母細胞。在一個實施方案中，通過在固體培養基上培養細胞來篩選或選擇酵母細胞。在另一個實施方案中，通過在液體培養基中培養酵母細胞來篩選或選擇酵母細胞。在一個優選實施方案中，通過首先在固體培養基上，隨后在液體培養基上培養酵母細胞來篩選或選擇酵母細胞。例如，該方法可以包括(a)提供酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體；(b)在允許酵母細胞接合的條件下培養酵母細胞；(c)通過在含木糖培養基上培養酵母細胞來篩選或選擇酵母細胞；(d)用被篩選或選擇的形成酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體的細胞重復步驟(b)和(c)，直至一種或多種酵母細胞已經獲得以期望的生長速率利用木糖作為生長唯一碳源進行生長的能力。
典型的是，重復步驟(b)和(c)，直至一種或多種酵母細胞已經獲得了足夠允許細胞方便的在含木糖作為唯一碳源的液體培養基中生長的對于木糖的生長速率。例如，通常在重復步驟(b)和(c)至少兩次后將獲得在含2％-5％w/v木糖的固體基本礦物培養基上這樣的生長速率，在該生長速率下，所述菌株可以被轉移到含2％-5％w/v木糖作為唯一碳源的液體基本礦物培養基中進行生長。更典型的是重復步驟(b)和(c)至少5次。甚至更典型的是重復步驟(b)和(c)至少10次。本領域的技術人員應該理解的是，通過在液體培養基中的培養來選擇或篩選酵母細胞的時間將依賴群體而變化并且能很容易的通過在每次步驟(b)和(c)的重復中在液體培養基中培養小部分群體來確定。由此，該方法可以包括(a)提供酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體；(b)在允許酵母細胞接合的條件下培養酵母細胞；(c)通過在含木糖的液體培養基中培養酵母細胞來篩選或選擇酵母細胞；(d)用被篩選或選擇的形成酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體的細胞重復步驟(b)和(c)，直至一種或多種酵母細胞已經獲得以期望生長速率利用木糖作為生長唯一碳源進行生長的能力。
酵母細胞通常被培養在含木糖培養基上或中足夠的時間以允許能夠利用木糖作為唯一碳源的酵母細胞生長。正如上面所討論的，時間的長度將至少是允許利用木糖作為唯一碳源時具有增加的生長速率的酵母細胞進行生長的一段足夠的時間長度。典型的是，該時間長度將是允許利用木糖作為唯一碳源沒有增加的生長速率的酵母細胞生長的一段足夠的時間長度。換句話說，時間長度將足夠允許基本所有的酵母細胞在木糖上生長。時間長度可以依賴于遺傳多樣性非重組酵母細胞群體而變化，并且也將依賴于所用培養基的類型和已經實施步驟(b)和(c)的重復或周期次數而變化。當每個周期被重復時，可以想象的是時間將變短，因為在每次步驟(b)和(c)的重復中所述方法將篩選或選擇利用木糖生長更快群體，而無論是使用固體還是液體培養基。本領域技術人員也應理解的是，即使在含不同于木糖的糖的復合培養基中，可以想象的是一些或所有不同于木糖的糖將通過生長最終被耗盡，并且木糖的存在將因此最終對在木糖作為唯一碳源上生長更快的那些菌株賦予選擇優勢。
酵母細胞可以在含木糖的液體培養基中培養足夠的時間以允許最有效利用木糖作為唯一碳源生長的酵母細胞比在木糖上低效生長的那些酵母細胞生長的更快。通常該時間量是足夠允許甚至利用木糖作為唯一碳源沒有增加的生長速率的那些酵母細胞進行生長。正如上面所討論的，更快生長的細胞的量將更大并由此對其選擇。因此，含木糖液體培養基的應用提供了一種便捷的方式來選擇與余下的酵母細胞群體相比能夠利用木糖以更快速率生長的那些酵母細胞。在含木糖液體培養基中的生長期通常隨每個周期而減少，因為被篩選或選擇的酵母細胞變得更有效的利用木糖。在含木糖的液體培養基中培養細胞而篩選或選擇酵母細胞之后，通常從液體培養基中回收細胞并且不對細胞作進一步的分開或分離就進行接合。因此，被篩選或選擇的酵母細胞作為集合被典型的接合。接合方法與在含木糖固體培養基上的篩選和選擇之后的方法是相同的。
應該理解的是，酵母細胞可以在任何選擇或篩選群體中利用木糖的酵母菌株的條件下在含木糖培養基中或上進行培養。例如，群體可以如下進行培養(a)在木糖基本培養基中或上，在好氧、微好氧、厭氧條件下；(b)在木糖豐富培養基中或上在好氧條件、微好氧、厭氧條件下。
除了木糖之外，上面的培養基還可以包括其它碳源(例如糖，比如葡萄糖、半乳糖、多元醇比如木糖醇、丙三醇、有機酸和它們的鹽比如醋酸和醋酸鹽等)。例如，酵母細胞可以被暴露于壓力比如亞-或超-最適的pH、高-或低-滲透壓、來自鹽的離子壓力、來自添加乙醇或其它醇的醇壓力、來自其它有機抑制劑的壓力比如糠醛和它們的衍生物、亞-或超-最適溫度、木糖的存在或缺乏并且隨后選擇或篩選它們由壓力恢復并且同時利用木糖作為唯一碳源的能力。預期不同選擇條件的組合能夠應用于群體。
應該理解的是，可以在分離酵母細胞或重復步驟(b)前重復步驟(c)任意次。例如，在含木糖液體培養基中被選擇群體可以在新鮮培養基中進行持續的亞培養，以進一步篩選或選擇具有期望生長速率的酵母細胞。
本領域技術人員也應理解的是步驟(b)和(c)可以被重復任意次以篩選或選擇非重組酵母細胞，其在作為唯一碳源的木糖上的生長速率隨著每次周期的重復而漸進的增加。因此這個過程被重復所需的次數，以獲得呈現利用木糖作為唯一碳源時期望的生長速率的菌株。
由此，該方法典型的包括分離一種或多種具有期望生長速率的酵母細胞的步驟。本領域技術人員應理解的是，該方法通常產生具有期望生長速率的酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體。因此，在一個實施方案中，該方法可以被用來產生能夠利用木糖作為唯一碳源以期望的生長速率生長的酵母屬菌株群體。此群體可以不用分開單獨的菌株就被分離。例如，這可以通過簡單的合并由此方法產生的酵母屬菌株群體來實現。
在另一個實施方案中，可以分離能利用木糖作為唯一碳源生長的單獨的酵母屬菌株。這可以通過使用標準的微生物學技術實現，比如提供合適的集落、在瓊脂平板上對酵母劃線用于單集落分離、或用于純培養物分離的任意其它的方法。這類方法被描述于Cruickshank et al.(1975)“Medical Microbiology”，12thedition，第2卷The practice of medicalmicrobiology，Churchill Livingstone出版。
同樣也提供的是產生利用木糖作為生長唯一碳源具有增加的生長速率的酵母屬菌株衍生物的方法。通常用于產生衍生物的酵母屬菌株具有期望的特性。該方法包括以酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體部分形式提供該菌株的步驟(a)。換句話說，菌株的酵母細胞構成群體的一部分。遺傳多樣性群體的酵母細胞可以是得自上述任何來源。在步驟(b)中，將遺傳多樣性酵母細胞群體的酵母細胞在上述任何允許群體的酵母細胞接合的條件下進行培養。在步驟(c)中，篩選或選擇酵母細胞的具有增加的生長速率的衍生物。增加的生長速率是衍生物的生長速率相對于該菌株生長速率的增加。典型的是，通過在上述的含木糖培養基中或上培養酵母細胞來篩選或選擇酵母細胞。含木糖培養基另外可含有選擇或篩選衍生菌株的因子。例如，菌株可以包含可選擇標記比如抗生素抗性標記或允許將菌株的衍生物與遺傳多樣性酵母細胞群體的其它酵母細胞區分開的其它類型標記。這允許同時篩選或選擇利用木糖作為唯一碳源具有增加的生長并攜帶有可選擇標記的酵母細胞。這允許將衍生物與遺傳多樣性群體的余下部分區分開。合適的可選擇標記包括，例如，ADE2、HIS3、LEU2、URA3、LYS2、MET15、TRP1、URA4、亞硫酸鹽抗性或對氟-DL-苯丙氨酸抗性(Cebollero and Gonzalez(2004)Applied and Environmental Microbiology，Vol 707018-7028)。用于篩選和選擇利用木糖生長的方法按上面所提到的方法。步驟(b)和(c)可以被重復任意次直至獲得具有增加的生長速率的衍生物。一旦生長速率已經增加，就分離衍生物。分離方法按上面提到的方法。
也包括在本發明范圍內的是由本發明方法產生的酵母屬菌株。酵母屬菌株可以是由Kurtzman(2003)FEMS Yeast Research 3417-432按系統發生關系定義的酵母屬的任意種，包括釀酒酵母，奇異酵母，S.mikatae，S.cariocanus，S.kudriavzevii，巴氏酵母和貝酵母。用于釀酒酵母菌株和非釀酒酵母菌株間接合的方法在例如Johnston JR and Oberman H(1979)Yeast Genetics in Industry，Bull MJ(ed.)Progress in IndustrialMicrobiology，Elsevier，Amsterdam vol 15，pp.151-205；Pretorius IS(2000)Tailoring wine yeast for the new milleniumnovel approaches to the ancientart of wine making.Yeast 16675-729；P.V.Attfield and P.J.L.Bell(2003)Genetics and classical genetic manipulations of industrial yeasts，in Topicsin Current Genetics Vol.2，J.H.de Winde(ed)Functional Genetics ofIndustrial Yeasts，Springer-Verlag Berlin Heidelberg中有討論。
本領域技術人員應理解的是，一旦獲得能利用木糖作為唯一碳源以期望生長速率生長的酵母屬菌株，則可以使用本領域已知產生菌株的方法，例如經典的遺傳雜交方法、誘變方法、重組方法、或任何產生酵母屬菌株的其它方法由該菌株衍生菌株。
能利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的菌株可以與酵母屬其它菌株接合，優選與釀酒酵母的其它菌株接合。例如，可以想象到的是上面的方法可以產生酵母屬的多種菌株，其能利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長。因此，可以將能利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的第一菌株與能利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的第二菌株接合。例如，可以實施這類接合以獲得甚至具有更進一步增強的或改善的利用作為唯一碳源的木糖能力的酵母屬菌株。例如，可以想象到的是，可以接合能利用木糖作為唯一碳源快速生長的酵母屬不同菌株，以獲得能在木糖上更快生長，或當利用木糖作為碳源時更有效生產產物比如乙醇或二氧化碳的接合菌株。
能利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的酵母屬菌株可以與較差利用木糖作為唯一碳源的酵母屬菌株接合。例如，可以實施這類接合以將改善的利用木糖作為唯一碳源的能力轉移到酵母屬菌株內，該菌株具有一種或多種期望的在具有改善的利用木糖作為唯一碳源的能力的菌株中不存在的特性。例如，較差的利用木糖作為唯一碳源生長的釀酒酵母菌株可以具有用于烘培工業的期望特征，將這種菌株與能利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的菌株接合可以是有益處的，從而開發能在木糖上快速或有效生長、并隨后用于烘培的面包酵母，。相似的，可以將能用于其它工業目的比如蒸餾、制酒、酵母提取物、酶、異源蛋白或任何其它目的的酵母與具有改善的利用木糖作為唯一碳源的能力的菌株接合，以便在木糖培養基上生產生物質或酵母副產物，。
通過使經非重組方法獲得了利用木糖作為唯一碳源以以每48小時至少一代的生長速率生長的能力的酵母屬菌株、例如釀酒酵母菌株與已經通過重組方法將一種或多種木糖利用基因引入其中的重組菌株接合，可以預見到能夠獲得在木糖利用方面具有甚至進一步的改善的菌株。本領域技術人員應理解的是，經重組方法引入的木糖利用基因可以經非重組方法簡單的補充已經存在于菌株中的那些基因。
本領域技術人員也應理解的是，盡管通過非重組方法獲得利用木糖的能力，重組DNA技術可以被用來補充菌株利用木糖作為唯一碳源的能力。例如，可以將來自其它來源的一種或多種木糖利用基因引入菌株以補充對木糖的利用。例如，可以如Kuyper et al.所述將來自Piromyces sp.的木糖異構酶整合到基因組中以補充木糖利用。可以按Wahlbom et al.(2003)的描述將來自樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的木糖還原酶(XYL 1)，或木糖醇脫氫酶(XYL2)克隆到酵母中以補充該菌株利用木糖的能力。然而，本領域的技術人員應理解的是，通過重組方法加入木糖利用的序列僅是為補充菌株現有的利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的能力。
在另一個實施例中，可以將編碼可能影響酵母的木糖利用效率、而非直接作用于木糖、木糖醇或木酮糖的代謝活性的一種或多種基因導入非重組菌株中，并使用重組DNA技術修飾其表達。在一些情況下，可能理想的是增加某些基因的表達，而在另一些情況下，可能理想的是降低或消除某些基因的表達。改變表達的靶基因可以包括那些編碼細胞質、線粒體或其它細胞器代謝活性的基因。這些基因將編碼涉及糖轉運、營養物轉運、糖酵解、發酵終步驟、戊糖磷酸途徑、糖異生、三羧酸途徑、乙醛酸循環、電子傳遞鏈、細胞內氧化還原平衡、發酵和呼吸間的相互作用、氨基酸合成和代謝等的活性。可以通過重組DNA技術修飾的基因的實例包括RPE1，RK11，TAL1和TKL1或任何可能改善酵母利用作為唯一碳源的木糖的能力的其它基因。
本領域技術人員還應該理解的是，可以使用重組方法將一種或多種木糖利用的基因引入菌株中。用于重組酵母生產的方法在本領域是眾所周知的，并且被描述于例如，Guthrie and Fink(1991)“Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology”，Methods in Enzymology Vol 194，Academic Press。可以將感興趣的基因或序列克隆到合適的載體中用于轉化到酵母細胞中。將感興趣的基因或序列克隆到合適的表達載體比如pMA91中(Dobson et al.(1984)EMBO Journal 31115)，其包含用于酵母菌株中表達的適當調節區。其它載體包括附加型、著絲粒型、整合型、修飾型表達載體，它們對本領域的技術人員是已知的(例如見，Guthrie and Fink(1991)“Guide to YeastGenetics and Molecular Biology”，Methods in Enzymology Vol 194，Academic Press)。適合用于在酵母中表達的調節區可以包括，例如，MAL、PGK1、ADH1、GAL1、GAL10、CUP1、GAP、CYC1、PHO5。或者，可以將基因自身的調節區用來在酵母中表達基因。可以將感興趣的基因或序列整合到酵母基因組中，比如整合到核糖體RNA基因座內。為此目的，將合適載體(例如質粒pIRL9)的核糖體序列釋放出來，并適當的克隆到BS+載體中。將感興趣的基因或序列可操作的連接合適的酵母啟動子和終止子區以形成表達盒，隨后將表達盒克隆到所克隆的核糖體序列內。從這種獲得的質粒，可以使用合適的限制酶以單片段形式釋放側翼有核糖體序列的表達盒。可以使用本領域已知的方法(參見例如Guthrie and Fink(1991)“Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology”，Methods in EnzymologyVol 194，Academic Press)，將所釋放的片段與攜帶合適標記用于轉化的自主復制質粒共轉化到酵母內。通過在不選擇該質粒的條件下培養細胞，可以在后期從細胞中去除該質粒。
本發明的酵母屬之種的菌株可以被用于該種的酵母菌株能應用的任何用途。例如，能利用木糖作為唯一碳源的釀酒酵母菌株可以被用于烘培、釀造、生物質的生產、糖發酵和乙醇的生產，或標準酵母屬菌株所應用的任何其它用途。
本發明酵母屬菌株在作為唯一碳源的木糖上生長的能力提供了一種方便的表型，其能夠被用來區分能利用木糖作為唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的酵母屬菌株和那些沒有此特性的菌株，以便“標記”酵母菌株。
在一個方面中，提供了一種標記酵母屬菌株的方法，其包括步驟(a)在允許菌株的DNA組合的條件下將期望的菌株與本發明的菌株一起培養；(b)篩選或選擇期望菌株的衍生物，所述衍生物利用木糖作為生長唯一碳源時具有增加的生長速率；(c)分離期望菌株的衍生物，所述衍生物利用木糖作為生長唯一碳源時具有增加的生長速率。
在一個實施方案中，該方法包括(a)使期望的菌株與第四到第十四方面的酵母屬菌株在允許菌株DNA組合的條件下接合；和(b)通過將接合細胞在含木糖固體培養基上鋪板或通過在含木糖液體培養基中培養或兩者的組合篩選或選擇期望菌株的衍生物，該衍生物能夠以每48小時大于一代的速率利用木糖作為唯一碳源生長；(c)分離期望菌株的衍生物，該衍生物利用木糖作為生長唯一碳源時具有增加的生長速率。
可以通過在含木糖基本培養基上或中培養菌株并確定其生長速率，或比較該生長速率與具有已知生長速率的標準菌株在含木糖的培養基上或中的生長速率來檢測被標記菌株。一種檢測被標記菌株的合適檢驗方法是Test T1，其中一種被標記的菌株在Test T1中顯示出生物質有至少兩倍的增加。
在另一個實施方案中，本發明的酵母屬之種的菌株可以被用來生產化合物比如乙醇、木糖醇、醋酸、其它酵母副產物、酶，等等。用于生產化合物的方法可以包括以下步驟(a)在含木糖培養基中在允許菌株產生該化合物的條件下培養酵母屬菌株；和(b)回收由該菌株產生的所述化合物。
所述化合物可以是酵母屬菌株在利用木糖作為碳源時產生的一種或多種化合物或其混合物。例如，該化合物可以是乙醇、木糖醇、醋酸、二氧化碳、或酵母細胞和其代謝的任何組分、代謝物和副產物。酵母細胞的組分可以包括酶、輔因子、維生素、氨基酸、肽、蛋白質、核苷、核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA、細胞壁組分、葡聚糖、甘露糖蛋白、膜組分、脂質、固醇、貯藏碳水化合物、海藻糖、糖原、有機酸、琥珀酸、醋酸、乳酸、多元醇比如丙三醇、木糖醇。
本領域技術人員應該理解的是由酵母屬之種的菌株產生的化合物類型可能取決于對菌株所施加的生長條件。例如，溫度、好氧或厭氧生長、培養基的pH、氮源、不同于木糖的碳源的存在、培養基中的其它化合物自身或組合可以影響由釀酒酵母菌株產生的化合物的類型。然而，用于產生任何一種或多種化合物的準確條件可以很容易的由本領域的技術人員通過標準的方法確定。
本領域技術人員也應理解的是，本發明的酵母屬菌株能利用糖比如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、麥芽三糖、麥芽糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、木糖、松三糖、α-甲基-葡糖苷、海藻糖和異麥芽糖。本發明的菌株還可以利用非糖類碳源，例如乙醇、乙酸鹽(酯)、甘油、木糖醇。
除了木糖之外，本發明的菌株通常能夠發酵糖類，比如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、麥芽三糖、麥芽糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、木糖、松三糖、α-甲基-葡糖苷、海藻糖或異麥芽糖，從而生產二氧化碳和乙醇。
在含木糖培養基中的木糖可以是能夠被酵母利用的任何形式。例如，木糖可以是純化的，或它可以是粗制的形式，比如得自生物質比如甘蔗、稻草、玉米秸稈、木料產物等的酸水解的半纖維素水解產物。
在生物質和化合物的生產中，被接種的含木糖培養基典型的是在溫度22℃-40℃下培養2小時到4天。
發明人還發現，為了用本發明的菌株從木糖生產乙醇，沒有必要該菌株在木糖上表現實質性的生長。發明人已經發現，用本發明的菌株大量接種含木糖培養基將導致在2小時內，典型的是4小時內，更典型的是5小時內產生乙醇。在此條件下，實質性的生長是檢測不到的。因此，又提供一種生產乙醇的方法，其包括(a)用第一到第八、第十二或第十三方面的菌株接種含木糖培養基，達到密度至少為1×108酵母細胞/ml培養基；(b)培養被接種的培養基足夠的時間以允許乙醇產生；(c)回收乙醇。
含木糖的培養基可以是上述任何含木糖的培養基。
酵母細胞的密度可以是每毫升培養基至少5×108，典型的是至少6×108酵母細胞。
被接種的培養基可以被孵育至少2小時，典型的是至少5小時。
在另一個方面，提供了一種生產乙醇的方法，其包括在含木糖培養基中在足以產生乙醇的條件下培養非重組酵母屬菌株并在其后收集乙醇。
Test T1-T9的定義T1利用木糖作為唯一碳源生長使用標準微生物學技術，將酵母菌株劃線接種到用2％瓊脂固化的葡萄糖酵母提取物細菌蛋白胨培養基上。在30攝氏度培養72小時后，酵母細胞用無菌微生物環從平板取出并接種到50ml液體培養基中達到OD600(600nm處的光密度)為0.1-0.2單位(在T0的OD600)。該液體培養基在250ml的Erlenmeyer燒瓶中的蒸餾水中含有木糖(5％w/v)、Difco YeastNitrogen Base w/o氨基酸(0.67％)。在測量OD600(在T48小時的OD)之前，在30攝氏度搖速220rpm(10cm軌道直徑)下培育培養物48小時。生物質增加的倍數按以下公式確定
T2利用木糖作為唯一碳源的細胞生物質產量用標準微生物學技術將酵母菌株劃線接種到使用2％瓊脂固化的葡萄糖酵母提取物細菌蛋白胨培養基上。在30℃孵育72小時后，酵母細胞用微生物無菌環從平板取出并接種到50ml液體培養基中達到OD600(600nm處的光密度)為0.1-0.2單位(在T0的OD600)。該液體培養基在250ml的Erlenmeyer燒瓶中的蒸餾水中含有木糖(5％w/v)、Difco Yeast NitrogenBase w/o氨基酸(0.67％)。在測量干酵母物質產量之前，在30攝氏度下以搖速220rpm(10cm軌道直徑)孵育培養物72小時。通過將5ml的酵母培養物轉移到預先稱重的玻璃試管(W1)內，接著在22℃下以3000g離心10分鐘，從而測定酵母的干重含量。在不擾動酵母沉淀的條件下去除上清液，使細胞懸浮在5ml的蒸餾水中，然后在22℃下以3000g重新離心10分鐘。將含有酵母細胞的玻璃試管在105℃烘烤24小時并稱重(W2)。通過從W2減去W1并對獲得的值乘以10來計算干酵母物質。各測試實施兩次并計算平均值。
T3利用作為唯一碳源的木糖產生乙醇通過使1標準微生物環的菌株純細胞在30℃以200rpm搖速在250mL Erlenmeyer燒瓶中的50mL蒸餾水中生長16小時來制備酵母接種物，所述蒸餾水中含有2.5g木糖、0.5g酵母提取物、0.5g細菌學上的蛋白胨。七個50mL的培養物被同時培育。通過在22℃以3000g離心5分鐘來收集培養物。去除上清液，并且將細胞沉淀重新懸浮在無菌蒸餾水中并再次離心。棄去上清液，并且將細胞顆粒重新懸浮并匯集在20mL的木糖基本培養基中，該培養基在每升蒸餾水中含有50g木糖、13.4g不含氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base，并添加有0.4mg的CuSO4.5H2O、1mg的ZnSO4.7H2O、2mg的MnSO4.4H2O、1mg的Na2MoO4.2H2O、1mg的Na2B4O7.10H2O、2mg的泛酸鈣、2mg的鹽酸硫胺素、2mg鹽酸吡哆醇、4mg的肌醇、1mg的煙酸和0.4mg的生物素。
細胞隨后被接種到980mL相同的木糖基本培養基中，該培養基已經被預溫到30℃并通20％氧，其是在2L的Braun Biostat B發酵罐內。在酵母的培養中，每分鐘泵10L的空氣，以1200rpm攪拌并根據需要添加KOH或磷酸將pH維持在pH5。24小時后，取出300mL體積的培養物并換入300ml的新鮮木糖基本培養基，該培養基包含50g的木糖加10g不含氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base和按上述量的微量鹽和維生素。又7小時后，將30g的新鮮木糖添加到培養物中并且將空氣供應降低到4L/min，將攪拌器速度降低到200rpm。再20小時后，通過使用裝備有用于乙醇檢測的YSI膜2786的YSI 2700 Select Biochemistry Analyzer(YSI Inc.YellowSprings，Ohio，USA)對乙醇進行檢測。
T4木糖還原酶的檢測如前所述在葡萄糖、酵母提取物和細菌蛋白胨瓊脂上培養酵母菌株，并接種到250ml搖瓶中的50ml培養基中達到600nm處的光密度為0.1-0.2單位，該培養基含有5％w/v的木糖、0.5％w/v的酵母提取物和1％w/v的細菌蛋白胨(XYP)。將培養物在30攝氏度和180rpm條件下培養，直至它們在600nm的光密度達到3-5單位。如果在培養24小時后細胞沒有達到所需的密度，則仍然收集細胞。通過在4℃下3000×g離心5分鐘來收集細胞。棄去上清液，將細胞沉淀重新懸浮在被冷卻的蒸餾水中并再次離心。棄去上清液，并且重復該過程以去除所有微量的培養基。
細胞被再懸浮在裂解緩沖液中，并且按Eliasson A.，et al.(2000)Applied and Environmental Microbiology，volume 66 pages 3381-3386的描述制備細胞提取物。隨后按照Eliasson A.，et al.(2000)Applied andEnvironmental Microbiology，volume 66 pages 3381-3386中所述并提及的方法對細胞提取物檢測木糖還原酶活性。一個單位的活性被定義為在30℃每毫克蛋白每分鐘還原或氧化1nmol的NAD(P)H。按照Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，and Randall RJ(1951)Journal of BiologicalChemistry 193265-275描述的方法，使用牛血清白蛋白標準對蛋白進行檢測。
T5木糖醇脫氫酶的檢測。將如前所述在葡萄糖、酵母提取物和細菌蛋白胨瓊脂上生長的酵母菌株接種到250ml搖瓶中的50ml培養基中達到600nm處的光密度為0.1-0.2單位，該培養基含有5％w/v的木糖、0.5％w/v的酵母提取物和1％w/v的細菌蛋白胨(XYP)。將培養物在30攝氏度和180rpm條件下培養，直至它們在600nm的光密度達到3-5單位。如果細胞在培養24小時后沒有達到所需的密度，則仍然收集它們。通過在4℃下3000×g離心5分鐘來收集細胞。棄去上清液，將細胞沉淀重新懸浮在被冷卻的蒸餾水中并再次離心。棄去上清液，重復該過程以去除所有微量的培養基。
將細胞再懸浮在裂解緩沖液中，并且按Eliasson A.，et al.(2000)Applied and Environmental Microbiology，volume 66 pages 3381-3386的描述制備細胞提取物。隨后按照Eliasson A.，et al.(2000)Applied andEnvironmental Microbiology，volume 66 pages 3381-3386中描述和提及的方法對細胞提取物檢測木糖醇脫氫酶活性。一個單位的活性被定義為在30℃每毫克蛋白每分鐘還原或氧化1nmol的NAD(P)H。按照Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，and Randall RJ(1951)Journal of BiologicalChemistry 193265-275描述的方法，使用牛血清白蛋白標準對蛋白進行檢測。
T6木酮糖激酶的檢測。將如前所述在葡萄糖、酵母提取物和細菌蛋白胨瓊脂上生長的酵母菌株接種到250ml搖瓶中的50ml培養基中達到600nm處的光密度為0.1-0.2單位，該培養基含有5％w/v的木糖、0.5％w/v的酵母提取物和1％w/v的細菌蛋白胨(XYP)。培養物在30攝氏度和180rpm條件下培養，直至它們在600nm的光密度達到3-5單位。如果在培養24小時后細胞沒有達到所需的密度，則仍然收集它們。通過在4℃下3000×g離心5分鐘來收集細胞。棄去上清液，并且將細胞沉淀重新懸浮在被冷卻的蒸餾水中并再次離心。棄去上清液，并且重復該過程以去除所有微量的培養基。
將細胞再懸浮在裂解緩沖液中，并且按Eliasson A.，et al.(2000)Applied and Environmental Microbiology，volume 66 pages 3381-3386的描述制備細胞提取物。隨后按照Eliasson A.，et al.(2000)Applied andEnvironmental Microbiology，volume 66 pages 3381-3386中描述和提及的方法對細胞提取物檢測木酮糖激酶活性。一個單位的活性被定義為在30℃每毫克蛋白每分鐘還原或氧化1nmol的NAD(P)H。按照Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，and Randall RJ(1951)Journal of BiologicalChemistry 193265-275描述的方法，使用標準牛血清白蛋白對蛋白進行檢測。
T7利用木糖醇作為唯一碳源的生長使用標準微生物學技術，將酵母菌株劃線接種到用2％瓊脂固化的葡萄糖酵母提取物細菌蛋白胨培養基上。在30攝氏度培養72小時后，酵母細胞用微生物無菌環從平板取出并接種到50ml液體培養基中達到OD600(600nm處的光密度)為0.1-0.2單位(在T0的OD600)。該液體培養基在250ml的Erlenmeyer燒瓶中的蒸餾水中含有木糖醇(5％w/v)、Difco YeastNitrogen Base w/o氨基酸(0.67％)。在測量OD600(在T48小時的OD)之前，在30攝氏度搖速220rpm(10cm軌道直徑)下培育培養物48小時。生物質的增加倍數按以下公式確定 T8利用豐富培養基中的木糖產生乙醇使用標準微生物學技術，將酵母菌株劃線接種到用2％瓊脂固化的葡萄糖、酵母提取物、細菌蛋白胨培養基上。在30攝氏度培養96小時后，酵母細胞用微生物無菌環從平板取出并接種到50ml液體培養基中至OD600(600nm處的光密度)為1-2單位(在T0的OD600)的。該液體培養基在250ml的Erlenmeyer燒瓶中的蒸餾水中含有木糖(5％w/v)、酵母提取物(0.5％w/v)和細菌蛋白胨(1％)。培養物在30攝氏度搖速220rpm(10cm軌道直徑)下進行培養。使用裝備有用于乙醇檢測的YSI膜2786的YSI 2700 Select Biochemistry Analyzer(YSI Inc.Yellow Springs，Ohio，USA)，在24小時期間每小時對培養物上清液的樣品進行乙醇檢測。乙醇水平以g/L的形式表示。
T9在木糖基本礦物培養基中在厭氧條件下產生乙醇。
使用標準微生物學技術將酵母菌株劃線接種到用2％瓊脂固化的5％w/v木糖、0.67％w/v無氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base培養基上，該培養基。在30攝氏度培養96小時后，將酵母細胞從平板上取出并直接接種到10mL無菌5％w/v木糖加0.67％w/v無氨基酸的Difco Yeast NitrogenBase中達到600nm處的光學密度為0.1-0.4，所述培養基包含于15mL體積的無菌PP-試管(Cellstar，Greiner bio-one)中。培養基用2mL的無菌礦物油覆蓋以抑制氧的轉移，充分擰緊螺帽并且在30℃無搖動條件下培育試管。用無菌巴氏滴管取出用于乙醇檢測的樣品，但并不擾動經最初接種物的生長形成的細胞沉淀。使用裝備有用于乙醇檢測的YSI膜2786的YSI2700 Select Biochemistry Analyzer(YSI Inc.Yellow Springs，Ohio，USA)對乙醇進行檢測。
本發明現在將參考以下非限制實施例進行詳細的說明。
實施例1酵母能利用木糖作為唯一碳源緩慢生長將面包酵母釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株NL67(Higgins etal.(1999)Applied and Environmental Microbiology 65680-685)接種到含有或不含有作為唯一碳源的木糖的固體基本礦物培養基并在30℃培育兩個月。用光學顯微鏡觀察到微小的集落出現在兩種平板上，但是在含木糖培養基上的集落比沒提供碳源的培養基上出現的集落可檢測地更大。在不含木糖的培養基上細胞已經發展5-6代，而在含木糖培養基上細胞已經發展了9-10代。
實施例2產生包括能在作為唯一碳源的木糖上快速生長的酵母屬多樣性菌株群體通過從大量來源獲得酵母菌株，包括得自野生、酒、蒸餾和啤酒發酵以及烘培應用的菌株，誘導它們形成孢子，并使用群體接合技術產生遺傳多樣性群體，有可能應用選擇壓力來富集能更有力利用木糖作為唯一碳源生長的酵母菌株。通過在木糖基本礦物培養基上涂布遺傳多樣性群體(并同時在不含碳源的相同基本礦物培養基上涂布)并培育兩個月，觀察到集落大小不均一。通過比較含木糖和不含木糖的平板，觀察到與被接受的觀念相反，生長是由于培養基中加入木糖所致，暗示群體內的酵母菌株在木糖上生長的能力存在差別。通過收獲整體木糖上生長群體并促使它們產生孢子，有可能產生新的酵母群體，其中賦予在木糖上更有效生長的能力的遺傳信息得到富集。通過使用大群體尺寸(至少100,000)并匯集細胞，包括沒有最佳生長的那些細胞，在每一代中維持了群體的遺傳多樣性。當接合和選擇循環次數增加時，集落大小的不均一性被保持，但是集落的最終大小增加。
在瓊脂平板上進行5-20個循環的選擇之后，將群體引入含木糖作為唯一碳源的基本礦物培養基的液體培養基中，并繼續傳代培養約50代。使后續群體形成孢子并且通過群體接合構建新群體。將異質性酵母屬細胞的新群體在木糖基本培養基的液體培養基中生長約50代。此時后，保存一些樣品，另使一些樣品形成孢子。使得自所選群體的萌發孢子全體接合以產生新的異質性釀酒酵母細胞群體并在液體木糖基本培養基中在選擇壓力下生長約50代。可以重復這一過程直至達到期望的生長速率。
為確定群體在木糖基本培養基上的生長速率是否增加，將分別取自選擇365、569、1013、1059、1170和1377天后的樣品以在600nm(OD)光密度為0.1-0.2單位、搖速220rpm和30℃下接種到木糖基本培養基中。在24小時后再次測試OD并按標準微生物學方法來計算在24小時期間的平均倍增時間。將結果以圖表形式作圖，并顯示在圖1中。
圖1顯示，當群體全體隨著接合和選擇循環在作為唯一碳源的木糖上生長發生演變，它們的生長速率的改善是呈指數形式的。預計這種在木糖作為唯一碳源上的生長速率的改善會持續到在木糖上的生長速率達到與在葡萄糖作為唯一碳源的生長速率相等為止。
實施例3非重組酵母屬菌株的異質群體在木糖豐富培養基中的乙醇產量與其在木糖基本礦物培養基上的生長速率相關在木糖基本礦物培養基上群體的倍增時間按實施例2、圖1所述來確定。通過將在600nm的光密度為1-2群體樣品接種到250mL搖瓶中的50mL含5％w/v木糖、0.5％w/v的酵母提取物和1％w/v細菌蛋白胨(XYP)的培養基中來確定乙醇產量。培養物在30℃和220rpm條件下培養，并在2天期間監測乙醇產量。
獲得的數據(表1)表明，在木糖豐富培養基中產生乙醇的能力隨著異質群體在木糖基本培養基上倍增時間的降低而增加。兩種特性的改善與所應用的接合和選擇過程的重復次數和時間長度相一致。
表1.隨著非重組酵母屬異質群體在木糖基本礦物培養基中生長速率的增加，在豐富培養基中木糖的乙醇發酵得到改善

乙醇產量數表示為在指定時間(分鐘)產生的乙醇g/L。
實施例4按照Test T1和T2對能夠以木糖作為唯一碳源生長的酵母屬純非重組菌株進行表征通過標準的微生物學方法從實施例2的木糖利用群體中純化酵母屬菌株分離物，并按Test T1和T2檢測在作為唯一碳源的木糖上的生長和產量。包含菌株CEN.PK(Karhumaa et al.(2005)Yeast 22259-368)和NL67(Higgins et al.(1999)Applied and Environmental Microbiology65680-685)作為在本文所描述方法應用之前存在的代表性菌株型。菌株NM04/41257和NM04/41258(被保存)來源于已經經歷1059天實施例2和圖1所述方案群體。菌株ISO 10(NM 05/45177)和ISO 7(NM 05/45178)是得自已經分別經歷1377和1431天實施例2和圖1所述方案群體。各個被分離酵母菌株通過孢子形成以及隨后衍生的單倍體與帶有遺傳標記的已知釀酒酵母實驗室菌株相接合而證實為釀酒酵母種的成員。
表2.如Test T1中所述釀酒酵母純菌株在木糖基本培養基上的生長

按Test T2的描述檢測釀酒酵母純菌株在木糖基本培養基上的生物質產量。同樣包含菌株CEN.PK和NL67作為不是用本文中描述的方法產生的代表性菌株型。CEN.PK的產率為每50mL培養物1mg的干酵母物質；NL67的產率為每50mL培養物2mg的干酵母物質；NM04/41257的產率為每50mL培養物產生50mg的干酵母物質；NM04/41258的產率為每50mL培養物55mg的干酵母物質；ISO 10的產率為每50mL培養物145mg的干酵母物質；ISO 7的產率為每50mL培養物114mg的干酵母物質。
上面數據表明，該方案可產生擁有利用木糖作為唯一碳源快速生長的能力和產量較高的菌株。參考實施例2和圖1中群體數據，此數據證明可以反復應用該方案以獲得具有在木糖上最大的可能生長速率和產量的菌株，該生長速率和產量可以與在葡萄糖上的生長速率和產量相等。
實施例5能利用木糖作為唯一碳源快速生長和產生乙醇的非重組酵母屬菌株通過使1標準微生物環的菌株純細胞在30℃以200rpm搖速在250mL Erlenmeyer燒瓶中的50mL蒸餾水中生長16小時來制備菌株ISO10接種物，該蒸餾水中含有2.5g木糖、0.5g酵母提取物、0.5g細菌蛋白胨。同時培育七個50mL的培養物。通過在22℃以3000g離心5分鐘來收集培養物。去除上清液，將細胞沉淀重新懸浮在無菌蒸餾水中，并再次離心。去除上清液，將細胞沉淀重新懸浮并匯集在20mL的木糖基本培養基中，該培養基在每升蒸餾水中含有50g木糖、13.4g不含氨基酸的Difco YeastNitrogen Base，并添加有0.4mg的CuSO4.5H2O、1mg的ZnSO4.7H2O、2mg的MnSO4.4H2O、1mg的Na2MoO4.2H2O、1mg的Na2B4O7.10H2O、2mg的泛酸鈣、2mg的鹽酸硫胺素、2mg鹽酸吡哆醇、4mg的肌醇、1mg的煙酸和0.4mg的生物素。
細胞隨后被接種到處于2LBraun Biostat B發酵罐內的980mL相同木糖基本培養基中，其已經被預溫到30℃并通20％的氧。在酵母的生長中，每分鐘泵10L的空氣，以1200rpm攪拌并根據需要添加KOH或磷酸來使pH維持在pH5。24小時后，取出300mL體積的培養物，并換入300ml新鮮木糖基本培養基取代(其中包含50g的木糖加10g不含氨基酸的DifcoYeast Nitrogen Base，以及按上述量的微量鹽和維生素)。這提供了每升為4g干酵母相當物的細胞群培養物。通氣和攪拌被分別維持在10L/min和1200rpm，并且pH維持在pH5。在這些條件下，酵母生物質在4小時內倍增(基于干酵母物質)，由消耗的10g木糖產生4g干酵母物質。
當用上述方法培養的酵母達到約12g(干酵母相當物)/L的密度時，將30g新鮮木糖添加到培養物中，并且將空氣供應降到4L/min，使攪拌器速度降到200rpm。在不能檢測到溶解氧的這些條件下，在20小時內消耗了17g木糖，并進一步產生1g干酵母物質以及1.75g/L的乙醇和1g/L的木糖醇。
實施例6在以指數生長的非重組酵母菌株中木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)的活性將如test T1中所述在葡萄糖、酵母提取物和細菌蛋白胨瓊脂上生長的酵母菌株接種到250ml搖瓶內的50ml培養基中，達到600nm處的光密度為0.1-0.2單位，該培養基中含有5％w/v的木糖、0.5％w/v的酵母提取物和1％w/v的細菌蛋白胨(XYP)。將培養物在30攝氏度和180rpm條件下培養，直至它們在600nm的光密度達到3-5單位。如果細胞在培養24小時后沒有達到所需的密度，正如在菌株比如NL67和CEN.PK的情形下，則仍然收集它們并進行測試。通過在4℃下3000×g離心5分鐘來收集細胞。棄去上清液，將細胞沉淀重新懸浮在被冷卻的蒸餾水中并再次離心。棄去上清液，并且重復此過程以去除所有痕量的培養基。
將細胞再懸浮在裂解緩沖液中，并且按Eliasson A.，et al.(2000)Applied and Environmental Microbiology，volume 66 pages 3381-3386的描述制備細胞提取物。隨后按照Eliasson A.，et al.(2000)Applied andEnvironmental Microbiology，volume 66 pages 3381-3386中描述和提及的方法對細胞提取物檢測XR、XDH和XK的活性。發現由下述活性，其中一單位活性被定義為在30℃每毫克蛋白每分鐘還原或氧化1nmol的NAD(P)H的活性。
表3.酵母菌株的酶活性單位

這些數據顯示，反復應用來獲得在木糖作為唯一碳源上生長的酵母的接合和選擇方法已經導致在木糖和木糖醇代謝中關鍵的XR和XDH活性的改善。
有可能的是，由于雜交和選擇過程中應用的選擇壓力，在我們的菌株中，其它一些酶和活性比如那些涉及戊糖磷酸途徑的酶和活性，也已經得到天然的改善。本領域的技術人員將認識到，我們的菌株可以明顯的被用作進一步改善的基礎，該改善使用進一步的選擇和雜交、誘變、原生質體融合、胞導和/或重組DNA技術的組合，其優化XR、XDH、XK的活性，或引入和優化木糖異構酶，或改善木糖、木糖醇和木酮糖代謝所需的其它遺傳變化。
實施例7按Test T7表征能在作為唯一碳源的木糖醇上生長的酵母屬純非重組菌株按test T1所述在葡萄糖、酵母提取物和細菌蛋白胨瓊脂上培養純菌株。將菌株的集落接種到50mL 5％w/v木糖醇加0.67％不含氨基酸的DifcoYeast Nitrogen Base中，并按Test T7所述檢驗生長。
表4.按Test T7所述釀酒酵母純菌株在木糖醇基本培養基上的生長

這些數據顯示，用來獲得在作為唯一碳源的木糖上生長的酵母的反復接合和選擇方法已經導致了也能利用木糖醇作為唯一碳源的一些菌株。
實施例8按Test T8使用木糖豐富培養基通過能在作為唯一碳源的木糖上生長的酵母屬純非重組菌株產生乙醇將按test T1所述在葡萄糖、酵母提取物和細菌蛋白胨瓊脂上生長的酵母純分離物接種到250mL搖瓶中的50mL培養基中達到在600nm光密度為1-2單位，該培養基含有5％w/v木糖、0.5％w/v酵母提取物和1％w/v細菌蛋白胨(XYP)，并按Test T8所述進行檢測。
表5.使用木糖豐富培養基產生乙醇

這些數據顯示，基于酵母在作為唯一碳源的木糖上生長的選擇策略可產生能從木糖產生乙醇的酵母菌株。這些數據與實施例3(表1)的數據結合，顯示了利用木糖作為唯一碳源生長和產生細胞生物質的能力與從木糖產生乙醇的能力增加相一致地增加。此外，能利用木糖醇和木糖的菌株比如NM04/41258和ISO 7能夠產生乙醇。有關菌株NM04/41258和ISO 7(NM 05/45178)能利用木糖醇并從木糖產生乙醇的發現與美國專利No.4,511,656的教導相反，該專利聲明應該篩選菌株以分離利用D-木糖但不利用木糖醇的特定集落。
實施例9分離和表征能在厭氧條件下利用木糖作為唯一碳源產生乙醇的酵母屬純非重組菌株從已經經歷1106天選擇的木糖利用群體純化分離物，并對其進行TestT9。檢測50個單獨的分離物，在3周到4個月之后檢測到它們的乙醇產量在0.24g/L-0.75g/L范圍內。菌株NM04/41257和NM04/41258也包括在這些檢測中。
表6.在厭氧條件下在木糖基本培養基中純酵母菌株的乙醇產量

這些數據表明，有可能獲得能在厭氧條件下發酵木糖產生乙醇的非重組酵母屬酵母。NM04/41257和NM04/41258菌株是相對于表中其它菌株從更早的的選擇群體中純化出來的。這種數據顯示，本文中描述的重復方案可以導致通過非重組菌株厭氧產生乙醇的效率增加。
實施例10通過以高密度接種到基本培養基的非重組酵母在好氧條件下快速產生乙醇將在葡萄糖、酵母提取物和細菌蛋白胨瓊脂(如上所述)上生長的菌株ISO 10接種到250mL Erlenmeyer燒瓶內的50mL 5％w/v木糖、0.5％w/v酵母提取物和1％w/v細菌蛋白胨(XYP)中，并在30℃和220rpm培養72小時。同時培育20個燒瓶。通過在22℃以3000×g離心10分鐘來收集細胞。棄去上清液，并在再次離心前使細胞沉淀再次懸浮在10mL無菌水中。再次棄去上清液，并在進一步離心前使細胞再次懸浮在無菌蒸餾無菌水中。最后，將細胞重新懸浮在20mL無菌蒸餾水中。
發酵培養基的制備、過濾消毒方法如下YNB含有0.67％無氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base；XYNB是YNB加5％木糖；GXYNB是YNB加0.5％葡萄糖和4.5％木糖。培養基被包含在125mL的錐形玻璃瓶內。它們用3mL的細胞懸浮物接種并在30℃置于220rpm搖床中，按前述以每小時間隔對乙醇產量進行讀值。接種后馬上測量培養物在600nm的光密度，確定培養物的細胞密度是5.7-6.1×108/mL。
表7.通過非重組酵母屬細胞的高密度接種物產生乙醇

各數值表示在接種后指定時間培養物上清液中乙醇的g/L量。由培養在無碳源YNB中的細胞產生的少量乙醇最可能是由酵母在72小時接種物制備階段合成和累積的內源貯藏糖攜帶過去的。3小時后YNB培養物中乙醇濃度的下降表明貯藏的糖已被耗盡或變得耗盡，并且乙醇正在被細胞消耗和/或乙醇被蒸發。
這些數據顯示有可能獲得在木糖是唯一碳源的基本培養基中快速發酵木糖產生乙醇的酵母屬非重組菌株。此外，這些菌株能夠在也添加了可發酵的己糖比如葡萄糖的培養基中從木糖產生乙醇，因為在GXYNB中4小時所產生的乙醇超出了預計完全由存在的葡萄糖所產生的量。
實施例11在作為唯一碳源的木糖上生長的非重組酵母生物質展現出廣泛的工業有用特征。
本領域的技術人員應該知道，酵母已經證明了其在多種發酵應用中的工業應用價值(例如面包和乙醇(適于飲用和不適于飲用)的生產)，并且也可作為氨基酸和蛋白質、核苷酸(例如DNA和RNA)、酶(例如轉化酶和肌醇六磷酸酶)、抗氧化劑(例如谷胱甘肽)和其它細胞組分比如細胞壁組分(例如葡聚糖)的來源。前述提及的特征只是舉例說明，并非意在限制。
酵母能在含木糖的培養基上生長并隨后用于各種工業目的將是非常有益的。因此，通過舉例的方式檢驗菌株IOS10在木糖上生長后的各種特征。
將菌株ISO10在如下培養基值培養，其中每升培養基中含有50g木糖、13.4g無氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base，補充有0.4mg的CuSO4.5H2O、1mg的ZnSO4.7H2O、2mg的MnSO4.4H2O、1mg的Na2MoO4.2H2O、1mg的Na2B4O7.10H2O、2mg的泛酸鈣、2mg的鹽酸硫胺素、2mg鹽酸吡哆醇、4mg的肌醇、1mg的煙酸和0.4mg的生物素。細胞以1200rpm攪拌，同時以12L/min供給空氣，并使溫度為30℃，用1M的KOH和1M的磷酸使pH維持在pH5。當細胞密度在A600是14時，通過在22℃以3000×g離心10分鐘來收集細胞。將細胞沉淀重新懸浮在蒸餾水水中并再次離心。這個清洗步驟被實施三次，并且將生物質置于1號Whatman濾紙上達到濕生物質為22-25％固體。
檢測生物質的以下特征以證明有可能在木糖作為唯一碳源上培養非重組酵母以獲得具有通常與工業應用相關的特征的酵母生物質。
乙醇發酵能力。將酵母接種于基于糖蜜的培養基中，以檢驗乙醇發酵能力，其被定義為從可發酵的糖比如蔗糖、葡萄糖和果糖產生乙醇的能力。蔗糖蜜在水中稀釋并通過加熱到121℃5分鐘消毒。當冷卻到22℃時，將糖蜜在22℃以4000×g離心10分鐘以去除固體。稀釋上清液到終濃度為18％w/w蔗糖相應物，并補充0.67％w/v的過濾消毒的Difco Yeast NitrogenBase。40mL的此培養基用6.8mg干酵母物質的對應物接種，并在30℃無搖動條件下培養。以24小時間隔，使用裝備有用于乙醇檢測的YSI膜2786的YSI 2700 Select Biochemistry Analyzer(YSI Inc.Yellow Springs，Ohio，USA)對乙醇進行檢測。24小時后酵母產生16.8g/L乙醇，一周后酵母產生59g/L乙醇。
發酵面包面團。為檢驗發酵能力(其被定義為發酵糖比如葡萄糖、果糖和麥芽糖、由此產生使面團膨脹的二氧化碳的能力)，將酵母添加到面包面團混合物中并檢驗其產生發酵面包的能力。所制備的面團含有500g全麥大豆粉(wholemeal flour soy)和亞麻籽面包混合液(Kitchen Collection，Christchurch)、300mL自來水和10g酵母(24％的固體)。發酵面團并用Breville Bakers Oven on setting 3B(HWI Electrical，Sydney Australia)烘烤。酵母使面團混合物膨脹(發酵)，產生一條14cm高的面包。
葡聚糖含量。按照描述于Sutherland IW，and Wilkinson JF(1971)“Chemical Extraction Methods of Microbial Cells”，in Methods inMicrobiology Vol 5B(Eds.JR Norris and DW Ribbons)，Chapter IV pp.345-383，Academic Press London and New York的方法，對相當于59mg干物質的酵母生物質量提取葡聚糖。按照Sutherland et al.，此方法產生“沒有污染雜質的細胞壁葡聚糖”。使用所述的方法，從干酵母起始物質獲得8mg葡聚糖。
氨基酸/蛋白質的含量。將相當于24.6mg干酵母物質的酵母材料懸浮在含2.5mL 1M NaOH的玻璃試管中，并置于沸水浴中15分鐘。將煮沸的樣品冷卻到22℃，并加入蒸餾水使體積達到10mL。按照Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，and Randall RJ(1951)Journal of BiologicalChemistry 193265-275的方法，使用牛血清白蛋白標準，檢測氨基酸/蛋白質。這個檢測表明酵母中每重量份干物質含有相當于39％的氨基酸/蛋白質。
核苷酸含量。將相當于8.3mg干酵母的酵母材料再懸浮在1mL 4％w/vNaCl中并在121℃高壓滅菌15分鐘。一經冷卻到22℃，對酵母懸浮液在22℃以3000×g離心10分鐘，按照描述于Herbert D，Phipps PJ，andStrange RE(1971)“Chemical Analysis of Microbial Cells”，in Methods inMicrobiology Vol 5B(Eds.JR Norris and DW Ribbons)，Chapter III pp.209-344，Academic Press London and New York的UV分光光度吸收方法檢測上清液的核苷酸含量。酵母中每重量份干物質含有1.9％的核苷酸物質。
谷胱甘肽含量。將相當于6.82mg干酵母的酵母材料再懸浮在0.8mL80∶20的乙醇∶蒸餾水中，渦旋混合并在22℃以10000×g離心2分鐘。上清液按如下檢測磷酸緩沖液為pH7.5，每250mL含3.99g Na2HPO4、0.43g NaH2PO4.H2O、0.59g二鈉EDTA.2H2O。NADPH溶液在100mL磷酸緩沖液中含有26.6mg NADPH四鈉鹽。通過在10mL磷酸緩沖液中稱重23.8mg的DTNB來制備5，5”-二硫-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。在蒸餾水中制備貯存濃度為0.1mM的標準谷胱甘肽。從Fluka Chemie AG獲得的谷胱甘肽還原酶貯存液每mL含有162.72單位活性。
檢測在3mL分光光度計小杯中進行，其含有1.4mL NADPH溶液+200微升DTNB溶液+10微升樣品、標準GSH溶液、或蒸餾水和390微升的蒸餾水。將樣品預溫到30℃，通過加入3微升的谷胱甘肽還原酶來起始反應。將小杯在30℃培育30分鐘，隨后使用Shimadzu UV-1201分光光度計在412nm波長處讀取相對于蒸餾水空白對照的吸光度。這個檢測表明每重量份干重物質的酵母含有0.36％總谷胱甘肽。
肌醇六磷酸酶活性。將相當于13.5mg干酵母的酵母材料再懸浮在pH4.9的0.5mL 0.2M醋酸鈉緩沖液中。將來自Sigma-Aldrich ChemieGmbH的磷酸酶底物在pH4.9的0.2M醋酸鈉緩沖液中配制成1mg/mL，將來自Sigma-Aldrich Chemie GmbH的肌醇六磷酸酶(供應商定義為每mg固體物質具有1.1單位的肌醇六磷酸酶活性)在pH4.9的0.2M醋酸鈉緩沖液中配制成0.909U/mL。檢測在小杯中進行，該小杯含有500微升的醋酸鈉緩沖液+250微升磷酸酶底物溶液和250微升或者酵母懸浮液、肌醇六磷酸酶或者蒸餾水。將小杯在30℃培養20分鐘，此時加入300微升10MNaOH。讀取相對于蒸餾水空白對照的405nm吸光度。酵母的肌醇六磷酸酶活性是每mg干酵母物質為0.068單位。
轉化酶活性。將相當于14.48mg干酵母當量的酵母材料再懸浮在1mL蒸餾水中。將懸浮液在蒸餾水中進一步稀釋100倍。按描述于US4,396,632和US 5,741,695的test T3中的比色法檢測轉化酶活性。酵母產生0.93單位轉化酶活性，其中一單位活性被定義為在30℃和pH4.9的條件下每mg干酵母每分鐘從蔗糖釋放1微摩爾的葡萄糖。
這些數據表明了非重組釀酒酵母以木糖作為唯一碳源生長以產生生物質、代謝物、細胞組分、和/或酶活性的潛力，它們與多種類型的工業應用相關。本領域的技術人員應該知道，不但可以通過經典和重組遺傳方法，還可以通過改變培養條件的手段來操作這些特征的準確水平或量，因此上面給出的結果僅具指示作用。
權利要求
1.一種產生酵母屬菌株的方法，該菌株能利用木糖作為生長唯一碳源以期望的生長速率生長，該方法包括以下步驟(a)提供酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體；(b)在允許酵母細胞間DNA組合的條件下培養酵母細胞；(c)對酵母細胞篩選或選擇利用木糖作為生長唯一碳源時具有增加的生長速率的酵母細胞；(d)分離一種或多種具有期望生長速率的酵母細胞。
2.權利要求1的方法，其中所篩選或選擇的細胞形成遺傳多樣性非重組酵母細胞群體，并且重復步驟(b)和(c)直至獲得期望的生長速率。
3.一種生產培養的酵母屬菌株的方法，該菌株能利用木糖作為生長唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長，該方法包括以下步驟(a)提供酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體；(b)在允許酵母細胞間DNA組合的條件下培養酵母細胞；(c)通過在含木糖培養基上或中培養酵母細胞來篩選或選擇酵母細胞；(d)用形成酵母屬遺傳多樣性非重組酵母細胞群體的所篩選或選擇的細胞重復步驟(b)和(c)，直至一種或多種酵母細胞已獲得利用木糖作為生長唯一碳源以每48小時至少一代的生長速率生長的能力。
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中通過在含木糖培養基上培養酵母細胞來選擇步驟(c)中的酵母細胞。
5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中含木糖培養基中包含木糖作為唯一碳源。
6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中含木糖培養基是木糖基本培養基。
7.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中含木糖培養基中包含木糖作為多種碳源中的一種。
8.權利要求1-7中任一項所述的方法，其中將酵母細胞在含木糖培養基上或中培養一段時間，該段時間足以允許利用木糖作為唯一碳源時生長速率沒有增加的酵母細胞在木糖上生長。
9.權利要求1-8中任一項所述的方法，其中酵母細胞間的DNA組合是通過接合進行的。
10.權利要求9所述的方法，其中接合是通過酵母細胞的孢子形成和具有有性繁殖能力的后代的雜交進行的。
11.權利要求1-10中任一項所述的方法，其中遺傳多樣性酵母細胞群體包含至少兩種具有遺傳差異的酵母菌株。
12.權利要求1-11中任一項所述的方法，其中酵母細胞群體包含天然出現的酵母屬菌株。
13.權利要求1-10中任一項所述的方法，其中遺傳多樣性非重組酵母細胞群體包括由化學或物理誘變、原生質體融合、孢子形成和雜交、胞導方法中任意一種或多種所產生的酵母屬菌株。
14.權利要求1-13中任一項所述的方法，其中遺傳多樣性酵母細胞群體包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
15.由權利要求1-14中任一項所述方法產生的菌株。
16.權利要求15所述菌株的衍生物。
17.一種分離的酵母屬菌株，其能以每48小時一代的生長速率利用木糖作為唯一碳源生長，其中該菌株(i)當在Test T1中具體說明的條件下生長時，產生增加5倍的生物質；和(ii)當在Test T2中具體說明的條件下生長時，產生至少10mg干重的生物質，并且該菌株是由權利要求1-14中任一項所述的方法產生的。
18.一種分離的酵母屬菌株，其能以每48小時一代的生長速率利用木糖作為唯一碳源生長，其中(i)當在Test T1中具體說明的條件下生長時，菌株產生增加10倍的生物質；和(ii)當在Test T2中具體說明的條件下生長時，菌株產生至少50mg干重的生物質；和(iii)在Test T3中檢測到至少0.1g/l的乙醇；和(iv)在Test T4中，于30℃，每mg蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；和(v)在Test T5中，于30℃，每mg蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；并且所述菌株是由權利要求1-14所述方法生產的。
19.一種分離的酵母屬菌株，其能以每48小時一代的生長速率利用木糖作為唯一碳源生長，其中(i)當在Test T1中具體說明的條件下生長時，菌株產生增加至少5倍的生物質；和(ii)當在Test T2中具體說明的條件下生長時，菌株產生至少40mg干重的生物質；和(iii)在Test T4中，于30℃，每mg蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；和(iv)在Test T5中，于30℃，每mg蛋白提取物每分鐘還原或氧化至少1nmol的NAD(P)H；和(v)在Test T7中具體說明的條件下，菌株利用木糖醇作為唯一碳源產生增加至少5倍的生物質；和(vi)對菌株進行Test T8時，檢測到濃度至少為0.04g/l的乙醇；并且其中所述菌株是由權利要求1-14中任一項所述方法生產的。
20.一種分離的酵母屬菌株，其能以每48小時至少一代的生長速率利用木糖作為唯一碳源生長，其中所述菌株利用作為唯一碳源的木糖的能力是通過非重組方法獲得的。
21.權利要求20所述的菌株，其中生長速率大于每24小時一代。
22.權利要求20所述的菌株，其中生長速率大于每8小時一代。
23.權利要求20所述的菌株，其中生長速率大于每4小時一代。
24.權利要求20所述的菌株，其中生長速率大于每2小時一代。
25.權利要求20-24中任一項所述的菌株，其中在Test T1中具體說明的條件下生長時，該菌株產生至少增加2倍的生物質。
26.權利要求20-25中任一項所述的菌株，其中在Test T1中具體說明的條件下生長時，該菌株產生至少增加5倍的生物質。
27.權利要求20-26中任一項所述的菌株，其中在Test 2中具體說明的條件下生長時，該菌株每50ml培養物產生至少0.01g干重的生物質。
28.權利要求20-27中任一項所述的菌株，其中當由Test T4確定時，該菌株表達具有至少1單位木糖還原酶活性的非重組酶。
29.權利要求20-28中任一項所述的菌株，其中當由Test T5確定時，該菌株表達具有至少1單位木糖醇脫氫酶活性的非重組酶。
30.權利要求20-29中任一項所述的菌株，其中當由Test T6確定時，該菌株表達具有至少10單位木酮糖激酶活性的非重組酶。
31.權利要求20-30中任一項所述的菌株，其中該菌株表達按Test T4確定具有至少1單位木糖還原酶活性的非重組酶，和按Test T5確定具有至少1單位木糖醇脫氫酶活性的非重組酶。
32.一種分離的酵母屬菌株，其具有在作為唯一碳源的木糖上以每48小時至少一代的生長速率生長的能力，并且其能表達非重組酶，該非重組酶具有選自木糖還原酶和木糖醇脫氫酶之中的活性，其中當由testT4確定時該木糖還原酶活性是至少一單位，當由test T5確定時該木糖醇脫氫酶活性是至少一單位。
33.權利要求32所述的菌株，其中該菌株能表達具有木糖還原酶活性的非重組酶和具有木糖醇脫氫酶活性的非重組酶。
34.權利要求32或33所述的菌株，其中該菌株除了能表達一種或多種具有選自木糖還原酶和木糖醇脫氫酶活性之中的非重組酶之外，還能表達具有木酮糖激酶活性的非重組酶。
35.權利要求34所述的菌株，其中當由test T6確定時，該木酮糖激酶活性為至少10單位。
36.權利要求32-35中任一項所述的菌株，其中該菌株以大于每24小時一代的生長速率利用木糖作為唯一碳源生長。
37.權利要求32-36中任一項所述的菌株，其中該菌株的生物質在Test T1中增加至少2倍。
38.權利要求32-37中任一項所述的菌株，其中該菌株的生物質在Test T1中增加至少5倍。
39.權利要求32-38中任一項所述的菌株，其中該菌株的生物質在Test T1中增加至少10倍。
40.權利要求20-39中任一項所述的菌株，其中該菌株的生物質在Test T7中增加至少5倍。
41.權利要求20-39中任一項所述的菌株，其中在Test T2中產生至少10mg干重的生物質。
42.權利要求20-39中任一項所述的菌株，其中在Test T2中產生至少30mg干重的生物質。
43.權利要求20-39中任一項所述的菌株，其中在Test T2中產生至少40mg干重的生物質。
44.權利要求20-39中任一項所述的菌株，其中在Test T2中產生至少50mg干重的生物質。
45.權利要求20-44中任一項所述的菌株，其中當在木糖上生長時該菌株能產生乙醇。
46.權利要求20-44中任一項所述的菌株，其中該菌株發酵木糖產生乙醇。
47.權利要求20-46中任一項所述的菌株，其中該菌株在Test T3中能產生濃度為至少0.1g/L的乙醇。
48.權利要求20-46中任一項所述的菌株，其中該菌株在Test T8中能產生濃度為至少0.4g/L的乙醇。
49.一種分離的非重組酵母屬菌株，其在Test T1中具體說明的條件下產生增加至少2倍的生物質。
50.一種分離的非重組酵母屬菌株，其具有以下特征(a)在Test T1中具體說明的條件下生物質增加至少5倍；(b)在Test T2中具體說明的條件下有至少10mg干重的生物質。
51.一種分離的非重組酵母屬菌株，其具有以下特征(a)在Test T1中菌株的生物質增加至少10倍；(b)在Test T2中產生至少50mg干重的生物質；(c)在Test T3中檢測到至少0.1g/L濃度的乙醇；(d)在Test T4中具體說明的條件下檢測到至少1單位的木糖還原酶活性；(e)在Test T5中具體說明的條件下檢測到至少1單位的木糖醇脫氫酶活性。
52.一種分離的非重組酵母屬菌株，其具有以下特征(a)在test T1中菌株的生物質增加至少5倍；(b)在test T2中產生至少40mg干重的生物質；(c)在Test T7中菌株的生物質增加至少5倍；(d)在test T8列舉的條件下中檢測到至少0.04g/L濃度的乙醇；(e)在Test T4中具體說明的條件下，檢測到至少1單位木糖還原酶活性；(f)在Test T5中具體說明的條件下，檢測到至少1單位木糖醇脫氫酶活性。
53.權利要求20-52中任一項所述的菌株，其中該菌株在Test T9中具體說明的條件下在4個月期間內產生至少0.2g/L乙醇。
54.權利要求20-52中任一項所述的菌株，其中當以至少5×108細胞/ml的細胞密度接種到含木糖的基本礦物培養基中時，該菌株產生至少0.5g/L乙醇。
55.權利要求20-54中任一項所述的菌株，其中該菌株是釀酒酵母菌株。
56.一種非重組酵母屬菌株，其以保藏號NM04/41257保存在澳大利亞政府分析實驗室(AGAL)。
57.一種非重組酵母屬菌株，其以保藏號NM04/41258保存在澳大利亞政府分析實驗室(AGAL)。
58.一種非重組酵母屬菌株，其以保藏號NM05/45177保存在澳大利亞政府分析實驗室(AGAL)。
59.一種非重組酵母屬菌株，其以保藏號NM05/45178保存在澳大利亞政府分析實驗室(AGAL)。
60.權利要求20-59中任一項所述菌株的衍生物。
61.權利要求60所述的衍生物，其是重組衍生物。
62.一種由權利要求1-14中任一項所述方法產生的酵母屬酵母細胞的群體。
63.權利要求20-59中任一項所述酵母屬菌株、權利要求60所述衍生物或權利要求62所述群體在生產酵母生物質中的用途。
64.權利要求20-59中任一項所述酵母屬菌株、權利要求60所述衍生物或權利要求62所述群體在生產乙醇中的用途。
65.一種轉化木糖成為酵母生物質的方法，其包括用含木糖培養基，在允許菌株利用木糖作為碳源生長的條件下，培養權利要求20-56中任一項所述酵母屬菌株、權利要求57所述的衍生物或權利要求59所述群體。
66.一種產生酵母生物質的方法，其包括在含木糖培養基上或中培養權利要求20-59中任一項所述酵母屬菌株、權利要求60所述衍生物或權利要求62所述群體，其中至少部分的酵母生物質是利用木糖作為碳源生長所產生的。
67.一種從酵母屬菌株生產化合物的方法，該方法包括在含木糖培養基上或中，在允許產生該化合物的條件下培養權利要求20-59中任一項所述酵母屬菌株、權利要求60所述衍生物或權利要求62所述群體，其中所述化合物是由菌株在利用木糖作為碳源生長期間產生的。
68.一種生產乙醇的方法，其包括以下步驟(a)在培養基中在允許產生乙醇的條件下培養權利要求20-59中任一項所述菌株、權利要求60所述衍生物或權利要求62所述群體；(b)分離所產生的乙醇。
69.權利要求68所述的方法，其中所述培養基是含木糖培養基。
70.權利要求69所述的方法，其中所述含木糖培養基除了包含木糖外，還包含一種或多種選自下組的糖葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、麥芽三糖、麥芽糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、木糖、松三糖、α-甲基-葡糖苷、海藻糖、異麥芽糖、二氧化碳。
7l.權利要求68-70中任一項所述的方法，其中菌株在厭氧條件下培養。
72.一種生產乙醇的方法，其包括(a)用權利要求20-59中任一項所述菌株、權利要求60所述衍生物或權利要求62所述群體接種含木糖培養基到密度為至少l×108酵母/ml；(b)培養被接種的培養基足夠的時間以允許乙醇產生；(c)收集乙醇。
73.權利要求72所述的方法，其中所述密度是至少5×108/mL。
74.由權利要求68-73中任一項所述方法生產的乙醇。
75.一種標記期望的酵母屬菌株的方法，其包括(a)在允許菌株的DNA組合的條件下將該期望的菌株與權利要求20-59中任一項所述菌株、權利要求60所述衍生物或權利要求62所述群體一起培養；(b)對酵母細胞篩選或選擇被修飾的期望菌株，其利用木糖作為唯一碳源時具有增加的生長；(c)分離被修飾的期望的酵母屬菌株，其利用木糖作為唯一碳源時具有增加的生長速率。
全文摘要
本發明涉及生產能夠以期望的生長速率(比如每48小時至少一代)生長于作為唯一碳源的木糖上的酵母屬(Saccharomyces)菌株的方法、由此方法制得的菌株和由非重組方法制得的以每48小時至少一代的生長速率利用木糖作為唯一碳源生長的酵母屬菌株。
文檔編號C12N1/18GK1977042SQ200580021851
公開日2007年6月6日 申請日期2005年6月8日 優先權日2004年6月8日
發明者菲利普·約翰·利文斯頓·貝爾, 保爾·維克托·阿特菲爾德 申請人:麥克拜奧根Pty有限公司