基因的甲基化檢測方法以及通過甲基化檢測進行的瘤形成的檢測方法

專利名稱：基因的甲基化檢測方法以及通過甲基化檢測進行的瘤形成的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種生物學試樣的前處理方法，其特征在于，在檢測生物學試樣中所含的基因和/或基因位點的甲基化，分析基因的方法中，在生物學試樣中添加多糖類而不添加蛋白質變性劑。此外，本發明還涉及實施這種前處理的生物學試樣中所含的基因和/或基因位點的甲基化的檢測方法。進而，還涉及通過使用該甲基化的檢測方法檢測特定基因的甲基化的瘤形成檢查方法。
本申請在此參照、援引并要求日本特許出愿特愿2004-359471號及特愿2004-360339號優先權。
背景技術：
通過分析存在于生物學試樣中的基因，可以使感染性疾病診斷和基因診斷成為可能。例如，使用存在于哺乳類血液或糞便中的病毒，腸內細菌群或病原性細菌，或消化管粘膜細胞，惡性瘤形成細胞、瘤形成細胞和分泌液中的基因片段，進行各種疾病的原因探求和診斷，對于個體的健康狀態的把握和惡性瘤形成的早期發現非常有用。
近年來，報道認為基因的異常甲基化的獲得這種現象多為瘤形成和惡性瘤形成的特征。
在真核細胞中，直接存在于鳥嘌呤核苷的5’側的胞嘧啶殘基的甲基化優先發生于CG缺乏的區域中(Bird，A.，Nature(1986)321209)。與之相對，稱之為CpG區域的含有不連續CG雙核苷酸的區域存在于基因的啟動子區域，但是常染色體中幾乎所有的基因相關的CpG區域受甲基化保護。CpG區域的廣泛涉及的甲基化與印記基因的轉錄的非活性化和雌的非活性X染色體上的基因轉錄的不活性化相關。此外，近年的研究報道了人腫瘤中異常的甲基化在各種基因的啟動子區域發生(非專利文獻1-3)。
CpG區域中的甲基化胞嘧啶的以往的檢測是采用甲基化感受性限制酶或甲基化反應性化學物質進行的。但是，由于該方法中只能分析限于存在甲基化可能性的部位的部分，因此存在一般無法廣泛應用的缺點。此外，還存在只能分析可以由該限制酶識別的序列中的CpG區域的缺點。由于即使通過組合甲基化感受性限制酶和核酸擴增反應，也難于區別限制酶切斷不完全的情況和甲基化等位基因數少的情況，因此例如在檢測少量試樣中的癌抑制基因的高甲基化等時，甲基化等位基因僅為集團的一小部分時，就沒有可信度。
不使用上述甲基化感受性限制酶或甲基化反應性化學物質，高敏感度檢測基因的甲基化的方法中，有用重亞硫酸鹽(bisulfite)處理基因的方法。通過重亞硫酸鹽處理基因，將非甲基化的所有非甲基化胞嘧啶修飾成尿嘧啶，使用這種修飾核酸可以檢測基因的甲基化。作為這種方法，可以例舉有例如甲基化特異PCR(MSP)法(專利文獻1)和COBRA(combined bisulfite restriction assay)法(非專利文獻4)，Methylight法(專利文獻2)等。但是，這些方法中在重亞硫酸鹽處理前不能不進行DNA的提取純化，而且需要比較多的DNA。而且，重亞硫酸鹽處理基因后，為了通過PCR等擴增DNA進行分析，需要再次進行DNA的純化。
一般的DNA的提取純化方法為采用苯酚、氯仿等有機溶劑的方法，市售的試劑盒有很多。此外，作為不使用有機溶劑的試劑盒，MagExtractor(東洋紡制)和QIAamp Stool DNA分離試劑盒(QIAGEN制)也有市售。前者是用小珠破碎膜后，用磁力珠回收吸附于小珠上的DNA，后者是通過加熱使膜蛋白質變性，來分離DNA的試劑盒。
作為不使用有機溶劑來提取分離DNA的試劑盒，公開了組合有蛋白質分解酶，和含有蛋白質變性劑、表面活性劑、螯合劑和蛋白質變性劑中的至少一種的水溶液，和鹽及共沉淀劑，以及蛋白質變性溶解劑的試劑盒(專利文獻3)，含有蛋白質變性劑、共沉淀劑和蛋白質變性劑的試劑盒(專利文獻4)。這些試劑盒必需有蛋白質分解酶或蛋白質變性劑，以獲得在PCR等中可以使用的純度的核酸為目的。
如上所述，像DNA甲基化檢測那樣，在DNA擴增反應等分析前需要人為修飾核酸的步驟時，由于需要進行多次純化，因此存在操作復雜、費時的問題。以往，核酸修飾前的提取純化中使用用于獲得與核酸擴增反應前相同的高純度DNA的純化方法。
在采用糞便的消化器官的惡性瘤形成(具體是大腸癌)的檢測方法中，有研究便潛血反應(Fecal Occult-Blood Testing；FOBT)的方法。根據歐美的隨機對照試驗3研究，進行便潛血檢查，可以發現早期癌，結果顯示有死亡率減少(檢診群中降低15-35％)的效果。此外，由于可以在檢診群中發現早期癌，因此確認了患病率和浸潤癌減少(NEngl JMed.(1993)3281365-71，Lancet(1996)3481472-7，Lancet(1996)3481467-71)。但是，該檢查方法敏感度低，便潛血反應陽性患者中大腸癌的發現率停留于2-17％。此外，在先前的歐美的隨機對照試驗3研究中，大腸癌患者中，由便潛血反應的檢診發現大腸癌的患者為27％，不能認為是令人滿意的。
對于消化器官中的瘤形成和惡性瘤形成，隨著近年來的分子生物學的發展越來越清楚了基因變異的特征。據報道大腸癌中的基因變異有例如KRAS基因的點突變，APC(adenomatous polyposis coli)基因的點突變，p53基因的點突變，BRAF基因的點突變。但是，即使研究所有這些基因的變異也無法檢測出所有的大腸癌，而且檢測方法和技術目前多為困難且花費高。如果能從糞便中檢測基因的變異，推測可以檢測瘤形成和惡性瘤形成(Nat Rev Cancer.(2002)Mar；2(3)210-9)。此外，也有關于通過加熱人糞便使膜蛋白變性，然后利用分離DNA的試劑盒提取純化DNA，然后進行DNA的重亞硫酸鹽處理，檢測瘤形成中特異性的甲基化異常，嘗試診斷大腸癌的報道(非專利文獻5)。該方法中，在DNA的提取純化中使用試劑盒，但并不經濟。
非專利文獻1Jones，P.A.等人，Nat.Genet.，(1999)；21163-167非專利文獻2Issa等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，(2000)；910140-153非專利文獻3Herman等人，N.Engl.J.Med.，(2003)；3492042-2054非專利文獻4Xiong等人，Nucleioc Acids Res(1997)；252532-2534非專利文獻5Muller等人，The Lancet，(2004)；3631283-1285，專利文獻1特表2000-511776號公表公報專利文獻2特表2002-543852號公表公報專利文獻3特開平7-236499號公開公報專利文獻4特開2001-17173號公開公報

發明內容
本發明的課題在于提供簡便又經濟地檢測生物學試樣中所含基因的甲基化的方法。進而，以在采用基因的甲基化的檢測方法檢查瘤形成時提供正確且敏感度良好的檢查方法為課題。
為了解決上述課題，本發明人反復進行了積極的研究，結果發現，在檢測基因的甲基化時，作為將未甲基化的非甲基化胞嘧啶修飾成尿嘧啶，區分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶的方法，可以例舉有重亞硫酸鹽處理方法，但是如果在試樣中添加多糖類，不添加蛋白質變性劑，即使不再純化DNA，也可以在此之后進行重亞硫酸鹽處理，可以檢測出未修飾成尿嘧啶的甲基化胞嘧啶，從而完成本發明。而且，通過檢測生物學試樣中所含多種基因的甲基化，計算它們的總和，可以更為正確地進行瘤形成的檢測，從而完成本發明。
也就是說，本發明由以下內容構成。
1.生物學試樣的前處理方法，其特征在于，在檢測生物學試樣中所含的基因和/或基因位點的甲基化的方法中，在前述生物學試樣中添加多糖類，不添加蛋白質變性劑。
2.根據前項1中記載的生物學試樣的前處理方法，其中，多糖類為糖原。
3.基因和/或基因位點的甲基化的檢測方法，該方法通過使經前項1或2中記載的前處理方法進行前處理的生物學試樣與重亞硫酸鹽相接觸，使該生物學試樣中所含的基因和/或基因位點的非甲基化的胞嘧啶轉換成尿嘧啶，檢測沒有轉換成尿嘧啶的胞嘧啶。
4.瘤形成的檢查方法，其通過檢測生物學試樣中所含的基因和/或基因位點中的SFRP2基因、DCC基因和MGMT基因的甲基化，計算甲基化基因的總和。
5.根據前項4中記載的瘤形成的檢查方法，其通過再檢測APC基因和/或hMLH1基因的甲基化，計算甲基化基因的總和。
6.根據前項4或5中記載的瘤形成的檢查方法，甲基化的檢測是通過前項3中記載的方法進行的。
通過本發明的前處理方法，可以在極短時間內極簡便地獲得提供給用于使生物學試樣中所含的基因和/或基因位點的非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的處理的試樣。此外，本發明的前處理的方法，由于操作簡便，可以防止試樣的污染和試樣的損失，可以大量獲得經過前處理的試樣。因此，可以適用于只能微量采取的試樣，需要大量核酸的分析方法等。
進而，如果根據本發明的檢查方法，可以正確且敏感度良好地檢查瘤形成。


圖1是表示生物學試樣為糞便時包括前處理方法的一系列操作的圖。(實施例1)圖2是表示糞便溶解溶液的稀釋例的圖。(實施例1)圖3是表示糞便中的APC基因的1A啟動子區域的甲基化的有無的分析結果的圖。SM表示大小標記，各編號表示試樣編號。而且，Mc表示甲基化的對照，M表示檢測出甲基化，U表示沒有檢測出甲基化。(實施例3)圖4是表示糞便中DCC基因的啟動子區域或5’區域的甲基化的有無的分析結果的圖。SM表示大小標記，各編號表示試樣編號。而且，Mc表示甲基化的對照，M表示檢測出甲基化，U表示沒有檢測出甲基化。(實施例3)圖5是表示糞便中MGMT基因的啟動子區域的甲基化的有無的分析結果的圖。SM表示大小標記，各編號表示試樣編號。而且，Mc表示甲基化的對照，M表示檢測出甲基化，U表示沒有檢測出甲基化。(實施例3)圖6是表示糞便中SFRP2基因的啟動子區域或5’區域的甲基化的有無的分析結果的圖。SM表示大小標記，各編號表示試樣編號。而且，Mc表示甲基化的對照，M表示檢測出甲基化，U表示沒有檢測出甲基化。(實施例3)
符號說明a 試樣(糞便)b 溶解緩沖液c 試樣溶液c1 試樣溶液沉淀c2 試樣溶液上清d 糖原e 重亞硫酸鈉具體實施方式
本發明中所謂“生物學試樣”包括從生物體采取的組織、血液、尿、血清、糞便、射出精液、咳痰、鼻涕、唾液、腦脊髓、淚等體液。作為本發明的生物學試樣，糞便是特別合適的。糞便中存在腸粘膜細胞、血液細胞、腸內細胞群、病原微生物(例如細菌和病毒)、腸內新生組織(包括大腸癌和息肉)等。糞便作為用于進行各種疾病相關基因和微生物相關基因，例如遺傳病等的原因基因、大腸癌組織來源基因或細菌來源基因等分析的非侵襲DNA材料是有效的。
首先，優選使采取的生物學試樣懸浮或溶解于適當的溶解液中，適當稀釋，制備試樣溶液。可以采用通過從不含蛋白質變性劑的公知液體中考慮生物學試樣的種類和量來適當選擇懸浮或溶解生物學試樣的溶解液。本發明中，所謂“蛋白質變性劑”是指從生物學試樣中提取DNA等核酸時通常使用的蛋白質變性劑，具體可以舉例有尿素、鹽酸胍、鳥嘌呤硫酸鹽、硫氰酸胍鹽等。另一方面，也可以預先使該溶解液中含有蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等非特異性蛋白質分解酶。
例如，在生物學試樣為糞便時，可以將糞便中所含的固體物質溶解于前述溶解液中，并且只要是不含蛋白質變性劑的物質，就沒有特別的限制，例如優選Tris-EDTA緩沖液，pH值為9前后的溶液。可以通過對于1mg糞便加入0.1-100μL，優選1-30μL，更優選3-7μL左右的上述溶解液來制備試樣溶液。例如，可以在1.5mL的管中，取100mg糞便，加入500μL溶解液來溶解糞便。
在將糞便中的腸內細菌等微生物的基因的檢測作為目的時，為了使微生物的膜蛋白變性，可以將試樣溶液進行例如60-95℃加熱10分鐘-10小時的處理。可以對如上述方式獲得的試樣溶液進行適當的離心分離。離心分離可以以3000-8000rpm，優選4000-6000rpm，更優選5000rpm左右的旋轉數進行1-5分鐘。試樣為糞便時，優選進行離心分離以除去不需要的固體物等，使用上清液。
(前處理方法)在提交進行基因的修飾處理前對按上述方式獲得的試樣溶液或試樣溶液的離心分離后的上清液(以下，存在將兩者均稱為“試樣液”的情況)進行前處理。作為前處理，在試樣液中添加多糖類。多糖類，只要是具有作為DNA載體的功能，對隨后進行的重亞硫酸鹽處理不產生影響的多糖即可，作為這種多糖類，具體而言，優選糖原。
按作為DNA載體起作用的量添加多糖類。例如，可以對于10-100μL試樣液加入2-200μg的糖原。更優選在42μL上述試樣液中加入45μg糖原，可以形成合計45μL的溶液。糖原可以使用市售的糖原。可以在試樣液中直接添加糖原的粉末使之溶解，但是優選添加制備成糖原溶液的糖原。糖原溶液的濃度可以根據試樣的量等適當調整，可以調制成例如15-20mg/mL。糖原以存在于試樣液中的狀態于37℃溫育15-30分鐘。
接著，優選進行使試樣液中的DNA堿性變性，由雙鏈變成單鏈DNA的反應。堿性變性處理可以通過公知的方法進行。例如可以通過氫氧化鈉溶液的添加進行。進而，可以于37℃溫育15-30分鐘。然后，在進行的分析中，使用市售的試劑盒時，存在市售的試劑盒中含有堿性變性試劑的情況。這種情況，可以按照試劑盒的使用說明書中記載的方法進行堿性變性。
例如，在43μL通過離心分離溶解了糞便的試樣溶液所獲得的上清液中添加2μL糖原溶液(15-20mg/mL)，5μL氫氧化鈉溶液(例如使用DNA甲基化試劑盒TM(ZYMO RESEARCH公司)時為M-DilutionBufferTM)，使總體積為50μL。這種情況，可以在添加糖原和氫氧化鈉溶液后進行一次溫育。具體而言，可以于35-40℃，優選37℃下溫育15-30分鐘。
(甲基化的檢測方法)本發明還涉及基因和/或基因位點的甲基化的檢測方法。本發明中，所謂“基因和/或基因位點的甲基化的檢測”是指檢測與存在于生物學試樣中的特定的基因啟動子區域或5’區域或基因位點相關的CpG島/CpG序列的胞嘧啶的甲基化。使用重亞硫酸鹽修飾存在于試樣液中的生物學試樣中的所有基因的非甲基化胞嘧啶，進行向尿嘧啶的轉化。在使用重亞硫酸鹽的修飾處理時，由于甲基化胞嘧啶沒有轉化為尿嘧啶，如果檢測出修飾處理后的胞嘧啶，該胞嘧啶則被判斷為甲基化，含有該胞嘧啶的基因和/或基因位點也被判斷為甲基化。
對于實施了前述前處理的試樣液，非甲基化胞嘧啶的修飾可以通過本身公知的方法進行。例如，通過使含有重亞硫酸鹽的市售修飾試劑與經前處理的試樣液直接接觸，修飾試樣液中所含的基因和/或基因位點中的非甲基化胞嘧啶，可以轉換成尿嘧啶。具體而言是可以使用DNA甲基化檢測用試劑盒的市售產品，例如DNA甲基化試劑盒TM(ZYMORESEARCH公司)、MethylEasyTM(Human Genetic Signatures公司)、CpGenome DNA Modification試劑盒TM(CHEMICON公司)等進行。
甲基化的檢測方法可以使用本身公知的方法。基因中的甲基化的有無的檢測可以按照甲基化特異PCR(MSP)法、COBRA(combinedbisulfite restriction assay)法、Methylight法等進行。例如，由PCR擴增的該擴增的DNA中的非甲基化胞嘧啶是否轉換成尿嘧啶的確認，可以通過使用可以擴增非甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶的序列的引物，和可以擴增甲基化胞嘧啶未轉換成尿嘧啶的序列的引物來擴增核酸，確認該擴增產物來進行。在試樣的性質上，擴增的基因優選200bp以下，更優選180bp以下。
(瘤形成的檢查方法)
本發明還涉及通過檢測生物學試樣中所含的基因和/或基因位點的甲基化來檢查瘤形成的方法。在本發明中，所謂上述生物學試樣中所含的基因，具體可以例舉有SFRP2(secreted apoptosis-related protein-2)基因、DCC(deleted in colorectal carcinomas)基因和MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶)基因。進而，還可以包括APC(adenomatouspolyposis coli)基因和/或hMLH1基因。這些基因和/或基因位點已知為尤其是與消化器官的惡性瘤形成(癌)和瘤形成(腺瘤)相關的基因。通過檢測上述所示的各基因和/或基因位點的甲基化，可以檢測與消化器官相關的瘤形成。
瘤形成可以是惡性瘤形成(癌)，也可以是瘤形成(腺瘤)。在這種情況下，作為用于檢測甲基化而進行重亞硫酸鹽處理前的生物學試樣，例如糞便的前處理，實施上述說明的本發明的前處理方法，即添加多糖類而不添加蛋白質變性劑的方法是簡便的，合適的，并沒有特別的限定。例如也可以使用MagExtractor(東洋紡制)和QIAamp Stool DNA分離試劑盒(QIAGEN制)等市售產品，根據本身公知的方法實施提取DNA的方法。
在本發明中，所謂“計算甲基化基因的總和”可以通過定量加算通過上述基因和/或基因位點的甲基化的檢測所定量檢測出的各基因的基因啟動子區域或5’區域的甲基化的值而算出的值，也可以按照不伴隨定量的方法計算出甲基化的基因數的總和。例如，通過求出SFRP2、DCC和MGMT基因的甲基化的總和，可以正確地檢查消化器官的瘤形成。進而，還可以包括APC和/或hMLH1基因的甲基化的總和。
具體而言，檢測存在于SFRP2基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化、存在于DCC基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化、以及存在于MGMT基因的啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化，通過求出它們的總和來實現。進而，可以通過檢測存在于APC基因的1A啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化和/或存在于DCC基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化，加算于先前所示的3種基因來源甲基化的總和上而求出總和。由此可以檢測出存在于消化器官中的瘤形成。
本發明的特定的基因或基因位點的堿基序列，對于SFRP2基因如NC_000004中所示，對于DCC基因如同No.NT_033905.3所示，對于MGMT基因如同No.HSU95038所示。進而，對于APC基因如GenBank登錄號No.HSU02509所示，hMLH1基因如同No.AB017806所示。此外，可以再研究SFRP1基因的甲基化，對于該SFRP1基因如NC_000008所示。
可以使用以下引物作為存在于這些基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的核酸擴增用引物。
可以擴增存在于APC基因的1A啟動子區域的CpG區域的引物如下所示。
APC1A-NF5’-ATATTTTYGAGGGGTAYGGGGTTA(序列號1)APC1A-MF5’-TATTGCGGAGTGCGGGTC(序列號2)APC1A-NR5’-ACRAAAATAAAAAACRCCCTAATC(序列號3)APC1A-NF(序列號1)和APC1A-NR(序列號3)被設計成可與甲基化胞嘧啶的存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶的存在的等位基因雜交，通過這兩個引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都可獲得148bp的擴增產物。
另一方面，APC1A-MF(序列號2)設計為只與甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，如果存在甲基化胞嘧啶，通過APC1A-MS(序列號2)和APC1A-NAS(序列號3)這兩個引物可以獲得84bp的擴增產物。
也就是說，在確認了存在于APC基因的1A啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶上的甲基化時，則確認有148bp和84bp兩種基因擴增產物，此外，在存在于APC基因的1A啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶上沒有確認甲基化時，則只確認有148bp這一種基因擴增產物(圖1)。
只要是可以擴增APC基因的必需區域的引物，不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。優選通過組合使用序列號1-3引物進行一次核酸擴增處理，可以確認根據存在于APC基因的啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化而堿基數不同的DNA的擴增。
可以擴增存在于DCC基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的引物如下所示。
DCC-NF5’-AGGTGGAGAAAGAGGTGGAGGAA(序列號4)DCC-MR5’-ACCAAAAATCGCGAACAACG(序列號5)DCC-NR5’-TCAACCAACACCTTCRAAACCAAA(序列號6)DCC-NF(序列號4)和DCC-NR(序列號6)被設計成可與甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶的存在的等位基因雜交，通過這兩個引物組，無論有無甲基化胞嘧啶，都獲得了151bp的擴增產物。
另一方面，DCC-MR(序列號5)設計為只與甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，如果存在甲基化胞嘧啶，則通過DCC-MR(序列號5)和DCC-NF(序列號4)這兩個引物可以獲得133bp的擴增產物。
也就是說，在確認了存在于DCC基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶上的甲基化時，則發現了151bp和133bp兩種基因擴增產物，此外，在存在于DCC基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶上沒有確認甲基化時，則只發現了151bp這一種基因擴增產物(圖2)。
只要是可以擴增DCC基因的必需區域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。優選通過組合使用含有序列號4-6所示序列的引物進行一次核酸擴增處理，可以確認根據存在于DCC基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化而堿基數不同的DNA的擴增。
可以擴增存在于MGMT基因的啟動子區域的CpG區域的引物如下所示。
MGMT3-NF5’-GYGTTTYGGATATGTTGGGAT(序列號7)MGMT3-MF5’-ACGTTCGTAGGTTTTCGC(序列號8)MGMT3-NR5’-AACTCCRCACTCTTCCRAAAACRA(序列號9)
MGMT3-NF(序列號7)和MGMT3-NR(序列號9)被設計成可與甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，通過這兩個引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都可獲得134bp的擴增產物。
另一方面，MGMT3-MF(序列號8)設計為只與甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，如果存在甲基化胞嘧啶，則通過MGMT3-MF(序列號8)和MGMT3-NR(序列號9)這兩個引物可以獲得82bp的擴增產物。
也就是說，在確認了存在于MGMT基因的啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶上的甲基化時，則發現了134bp和82bp的兩種基因擴增產物，此外，在存在于MGMT基因的啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶上沒有確認甲基化時，則只發現了134bp這一種基因擴增產物(圖3)。
只要是可以擴增MGMT基因的必需區域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。優選通過組合使用含有序列號7-9表示的序列的引物進行一次核酸擴增處理，可以確認根據存在于MGMT基因的啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化而堿基數不同的DNA的擴增。
可以擴增存在于hMLH1基因的啟動子區域的CpG區域的引物如下所示。
hMLH15-NF5’-YGGGTAAGTYGTTTTGAYGTAGA(序列號10)hMLH15-MF5’-CGTTCGTCGTTCGTTATATATC(序列號11)hMLH15-NR5’-TATACCTAATCTATCRCCRCCTCA(序列號12)hMLH15-NF(序列號10)和hMLH15-NR(序列號12)被設計成可與甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，通過這兩個引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都可獲得149bp的擴增產物。
另一方面，hMLH15-MF(序列號11)設計為只與甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，如果存在甲基化胞嘧啶，則通過hMLH15-MF(序列號11)和hMLH15-NR(序列號12)這兩個引物組可以獲得109bp的擴增產物。
也就是說，在確認了存在于hMLH1基因的啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶上的甲基化時，則發現了149bp和109bp兩種基因擴增產物，此外，在存在于hMLH1基因的啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶上沒有確認甲基化時，則只發現了149bp這一種基因擴增產物。
只要是可以擴增hMLH1基因的必需區域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。優選通過組合使用含有序列號10-12所表示的序列的引物進行一次核酸擴增處理，可以確認根據存在于hMLH1基因的啟動子區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化而堿基數不同的DNA的擴增。
可以擴增存在于SFRP1基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的引物如下所示。
S1-NF5’-GYGTTTTTTTGTTYGTYGTATTTT(序列號13)S1-MF5’-TCGTAGCGTCGTTTTTTC(序列號14)S1-NR5’-AAAACRCAATCCCCAACRTTAC(序列號15)S1-NF(序列號13)和S1-NR(序列號15)被設計成可與甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，通過這兩個引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都可獲得166bp的擴增產物。
另一方面，S1-MF(序列號14)設計為只與甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，如果存在甲基化胞嘧啶，則通過S1-MF(序列號14)和S1-NR(序列號15)這兩個引物可以獲得120bp的擴增產物。
也就是說，在確認了存在于SFRP1基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶上的甲基化時，則發現了166bp和120bp兩種基因擴增產物，此外，在存在于SFRP1基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶上沒有確認甲基化時，則只發現了166bp這一種基因擴增產物。
只要是可以擴增SFRP1基因的必需區域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。優選通過組合使用含有序列號13-15所表示的序列的引物進行一次核酸擴增處理，可以確認根據存在于SFRP1基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化而堿基數不同的DNA的擴增。
可以擴增存在于SFRP2基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的引物如下所示。
S2-NF5’-GGTTGTTAGTTTTTYGGGGTTT(序列號16)S2-MF5’-TCGTTTCGTTTTTTTTCGGTTTC(序列號17)S2-NR5’-CAACAACAACRAACCAAAACCCTAC(序列號18)S2-NF(序列號16)和S2-NR(序列號18)被設計成可與甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，通過這兩個引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都可獲得159bp的擴增產物。
另一方面，S2-MF(序列號17)設計為只與甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交，如果存在甲基化胞嘧啶，則通過S2-MF(序列號17)和S2-NR(序列號18)這兩個引物可以獲得87bp的擴增產物。
也就是說，在確認了存在于SFRP2基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶上的甲基化時，則發現了159bp和87bp兩種基因擴增產物，此外，在存在于SFRP2基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶上沒有確認甲基化時，則只發現了159bp這一種基因擴增產物。
只要是可以擴增SFRP2基因的必需區域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。優選通過組合使用含有序列號16-18所表示的序列的引物進行一次核酸擴增處理，可以確認根據存在于SFRP2基因的啟動子區域或5’區域的CpG區域的胞嘧啶的甲基化而堿基數不同的DNA的擴增。
前述擴增產物的確認可以通過本身公知的方法進行。具體而言，可以通過用瓊脂糖凝膠進行電泳來確認。而且，在使用要進行甲基化檢測的基因或基因位點中的基因擴增時使用的引物，只使用設計為可與甲基化胞嘧啶存在的等位基因和與非甲基化胞嘧啶存在的等位基因雜交的引物時，可以采取以DNA芯片進行的雜交，克隆文庫法，變性梯度凝膠電泳法(DGGE法)，溫度梯度凝膠電泳(TGGE法)，Methylight法或SSCP法。
(試劑和試劑盒)本發明還涉及試樣前處理試劑，其是核酸修飾前使用的試劑，其特征在于含有糖原但不含蛋白質變性劑，另外還涉及上述前處理方法中使用的含有糖原不含蛋白質變性劑的試樣前處理試劑盒，以及上述核酸修飾方法中使用的核酸修飾試劑盒。
而且，本發明除了涉及檢查存在于消化器官中的瘤形成的方法之外，還涉及上述引物，引物組合。而且，本發明還涉及檢查存在于消化器官中的瘤形成的檢查用試劑和檢測用試劑盒。本發明的試劑中可以以上述各引物作為試劑，而且試劑盒中還可以含有引物或引物組合。試劑盒中除了上述引物之外也可以含有上述試樣前處理試劑以及核酸擴增用試劑，擴增產物的確認中使用的試劑等。
實施例通過以下實施例說明本發明，然而本發明顯然不受這些實施例的限制。
(實施例1)生物學試樣為糞便時的試樣的前處理方法按照圖1和圖2說明生物學試樣為糞便時的試樣的前處理方法。
1)作為用于溶解糞便的溶液，制備500mmol/L Tris-HCL、16mmol/LEDTA、10mmol/LNaCl、pH9.0的組成的溶液(溶解緩沖液)。將在1.5mL管中加入78mg樣品No.9的糞便，117mg樣品No.12的糞便，162mg樣品No.45的糞便，146mg樣品No.51的糞便，將各糞便溶解于1000μL的溶解緩沖液中，制備各糞便溶液。然后，將各糞便溶液于95℃加熱處理10分鐘(圖1左上)。
2)糞便溶液的離心分離以5000rpm對所得的糞便溶液進行3分鐘離心分離，分離上清液和沉淀(圖1右上)。
3)向溶液添加糖原在43μL上述糞便溶液的上清液(樣品No.45-1、51-1)(圖2)中加入2μL糖原溶液(15mg/mL)，攪拌。此外，用500μL溶解緩沖液稀釋100μL該上清液(樣品No.45-2、51-2)(圖2)、在43μL獲得的稀釋溶液中加入2μL糖原溶液(15mg/mL)，攪拌(圖1右下)。
4)DNA向單鏈的變性以下的步驟按照DNA甲基化試劑盒(DNA甲基化試劑盒，EZZYMO RESEARCH制)的步驟進行。在各5μL樣品中加入試劑盒中所含的M-Dilution Buffer(氫氧化鈉溶液)，于37℃溫育15分鐘。
5)非甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的轉換用DNA甲基化檢測用試劑盒DNA甲基化試劑盒TM(ZYMORESEARCH制)將非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶。在上述樣品No.9、12、45-1、51-1、45-2、51-2的溶液中添加試劑盒所含的CT轉化試劑(重亞硫酸鈉溶液)，進行溫育，修飾所有的非甲基化胞嘧啶，轉化成尿嘧啶(圖1左下)。
6)DNA的純化用試劑盒中所含的Zymo-Spin I Column將獲得的修飾基因來源的DNA純化至高純度。
(實施例2)預備研究從250例的大腸癌患者，10例大腸腺腫瘤患者，85例胃癌患者分別獲得瘤形成部分或正常粘膜部分的生物學試樣，進行以下的研究。
以施行了外科手術切除和內窺鏡切除的250例大腸癌組織(包括遺傳性非腺腫瘤性大腸癌)，10例大腸腺腫瘤組織(包括家族性大腸腺腫瘤癥)，85例胃癌組織，225例的正常大腸粘膜組織和85例的正常胃粘膜組織作為生物學試樣，對從各生物學試樣中提取的DNA進行重亞硫酸鹽處理，首先，用239病例的大腸癌進行合計15種基因啟動子區域或5’區域和基因位點(SFRP1，SFRP2，DCC，APC，MGMT，hMLH1，MINT1，MINT2，MINT31，CACNA1G，p14，p16，THBS1，DAPK，COX2)的甲基化研究。根據其結果，選擇甲基化頻率高的6個基因(SFRP1，SFRP2，APC，DCC，MGMT，hMLH1)作為大腸癌和消化器官瘤形成的檢測用標記。
然后，用250例大腸癌組織(包括遺傳性非腺腫瘤性大腸癌)，10例大腸腺腫瘤組織(包括家族性大腸腺腫瘤癥)，85例胃癌組織，225例的正常大腸粘膜組織和85例的正常胃粘膜組織對這6個基因啟動子區域或5’區域的甲基化頻率和傾向進行分析、研究。為了檢測SFRP1，SFRP2，APC，DCC，MGMT，hMLH1各基因的甲基化，使用了表1的引物。表1的引物由含有序列表的序列號1-18表示的序列的寡核苷酸構成。各引物的在各基因中的位置，堿基長度和Tm值也示于表1中。
表1

為了各基因的甲基化的檢測，通過PCR進行DNA擴增反應。使用10×PCR緩沖液(Invirogen公司)，1.5mM MgCl2，0.2mM各引物，0.1mMdNTP，1單位的Taq聚合酶(Platinum taq聚合酶；Invirogen公司)，以2μL從組織提取的DNA進行了重亞硫酸鹽處理的溶液為模板，合計20μL的PCR反應溶液。
擴增反應條件為于95℃加熱3分鐘后，以于95℃30秒，于各Tm溫度30秒，于72℃30秒為1循環，進行合計36個循環，然后于72℃加熱5分鐘。
對250個病例的大腸癌試樣，10個病例大腸腺腫瘤試樣研究各基因的甲基化的有無的結果是，在這6種基因啟動子區域或5’區域中確認了1個以上的甲基化的大腸癌病例為100％(250/250)，而且在大腸腺腫瘤中也為100％(10/10)。而且，在85例胃癌病例中也為100％(85/85)。
對于各基因啟動子區域或5’區域，對于發現了甲基化的基因給予1分的評價，對于沒有發現甲基化的基因給予0分的評價，對于各試樣，計算上述6種基因或基因位點的總和，以該總值作為M.I(甲基化指數)。大腸癌，大腸腺腫瘤，胃癌，大腸正常粘膜和胃正常粘膜的M.I的平均值和各基因的甲基化的頻率示于表2。而且，各組織中M.I平均值的測定中使用分散分析，P值表示其值。而且，M.I平均值的括號內表示95％可信區間。
表2

如表2所示，在大腸癌、大腸腺腫瘤和大腸正常粘膜中發現M.I平均值有顯著差異(P＜0.0001)。而且，在胃癌和胃正常粘膜中也發現M.I平均值有顯著差異(P＜0.0001)。也就是說，確認了消化器官瘤形成與消化器官正常粘膜的M.I平均值有明顯的差異。
例如，大腸癌的情況是，與正常粘膜相比，顯著發現尤其SFRP2，DCC，MGMT各基因的甲基化。大腸腺腫瘤的情況是顯著發現SFRP2，APC，MGMT各基因的甲基化。進而，胃癌的情況是，顯著發現SFRP2，DCC，hMLH1各基因的甲基化。根據該結果，提示從糞便中檢測出這6種基因啟動子區域或5’區域的甲基化，根據其M.I值提示也許可以預測消化器官瘤形成的存在。
根據預備研究獲得的結果，在理論上，顯示多個基因啟動子區域或5’區域中甲基化的有無的總和在瘤形成與正常組織中有差異。與此結果相同，通過從糞便中所含的基因中檢測DNA甲基化，進行了是否可以檢測消化器官中瘤形成的存在的研究。
(實施例3)基因啟動子區域或5’區域的甲基化的總和與病理診斷的關系從60名獲得知情同意的大腸內窺鏡檢查預定患者中獲得檢查施行前的糞便作為生物學試樣。用實施例1中記載的方法對獲得的糞便進行糖原處理和重亞硫酸鈉處理。對2μL經該重亞硫酸鈉處理的溶液，與預備研究中進行的方法相同的方法檢測SFRP1，SFRP2，DCC，APC，MGMT，hMLH1各基因的啟動子區域和/或5’區域的甲基化。
檢測60個病例的糞便中所含的基因的甲基化的結果，大腸內窺鏡和上部消化管內窺鏡檢查結果示于表3。性別，將女性表示為F，將男性表示為M。FOBT表示便潛血反應檢查(Fecal Occult-Blood Test)，(+)表示便潛血反應陽性，(-)表示便潛血反應陰性，N.D.表示不管是否進行便潛血反應檢查都不能確認的病例。而且，甲基化狀況(MethylationStatus)，在確認基因啟動子區域或5’區域的甲基化時表示為1，沒有發現甲基化時表示0。而且，對于沒有發現核酸擴增反應者，表示為N.A.(Not Amplified)。對于各基因啟動子區域和/或5’區域發現了甲基化時，M.I.加1分，N.A.不加分(即與0分意義相同)。
表3
將表3所示的60個病例分成以下3組惡性瘤形成(包括胃腺癌，大腸腺癌，十二指腸良性腫瘤)組，良性瘤形成(包括胃底腺息肉，胃增生性息肉，大腸管狀腺癌)組，和W.N.L(沒有發現瘤形成(癌或腫瘤)的病例)。分成這3類的病例組與APC，DCC，MGMT，hMLH1，SFRP1，SFRP2各基因的啟動子區域或5，區域的甲基化頻率以及M.I.平均值之間的關系示于表4。P值的3組間與M.I.平均值的比較中使用分散分析。而且，3組間的M.I.平均值的比較中使用分散分析。而且，3組間各基因啟動子區域或5’區域的甲基化頻率的比較用Pearson測定。
表4

其結果是，通過糞便中所含的基因的甲基化的檢測，發現其甲基化基因的總和的值的平均值，在伴隨惡性瘤形成的病例和伴隨良性瘤形成的病例和不伴隨瘤形成(W.N.L)的病例間有顯著差異。尤其是，發現了惡性瘤形成時，就SFRP2，DCC，MGMT和APC基因而言，良性瘤形成時，就SFRP2和APC基因而言，與沒發現瘤形成的組相比有顯著差異。該結果與預備研究有相同傾向。
SFRP2啟動子區域或5’區域的甲基化可以檢測瘤形成(癌和腺腫瘤)，APC基因的1A啟動子區域的甲基化也有相同傾向。還顯示出在DCC啟動子區域或5’區域的甲基化中，可以重點檢測惡性瘤形成，在MGMT啟動子區域的甲基化中也發現了這種傾向。
在本實施例中，非定量檢測了各基因啟動子區域和/或5’區域的甲基化。考慮表4的結果，M.I.值為2以上的病例為檢查陽性組(也就是懷疑消化器官中存在瘤形成的病例組)，而且，M.I.值為1或0的病例為檢查陰性組，計算該檢查方法中的敏感度和特異性。其結果示于表5。而且，P值表示Fisher的正確測定值。
表5

如表5所示，檢測存在于消化器官中的瘤形成的敏感度為90.0％，特異性為53.3％。而且，對于惡性瘤形成，顯示出可以100％檢測。
(比較例1)通過便潛血來確認對于上述預備研究中所示的病例中的60個病例進行便潛血反應，調查了通過大腸內窺鏡研究顯示出陽性的20例患者中是否有瘤形成，結果示于表6。W.N.L為沒有發現瘤形成(癌或腺腫瘤)的病例。這樣一來便潛血反應陽性的病例中有一半以上沒有發現瘤形成。
表6

根據以上結果，認為通過便潛血反應幾乎不可能進行瘤形成的判斷。另一方面，通過本發明的檢查方法，提示通過檢測尤其是多個基因啟動子區域或5’區域的甲基化，求出它們的總和(M.I.)，可以正確且簡便地進行瘤形成的檢查。
工業上利用的可能性如上所述，通過本發明的前處理方法，即使不使用蛋白質變性劑，在以后的步驟中修飾基因中所含的非甲基化胞嘧啶，可以使之轉換成尿嘧啶。
而且，通過檢測本發明的SFRP2基因，DCC基因和MGMT基因的甲基化，求出甲基化的總和，發現可以從生物學試樣，優選糞便中判定消化器官中存在的瘤形成(癌或腺腫瘤)。而且，這提示通過檢測APC基因和/或hMLH1基因的甲基化，再求出甲基化總和，可以更正確地檢測大腸癌。
對于在實施例中所示的糞便試樣，研究了各基因啟動子區域和/或5’區域的甲基化，結果顯示可以從糞便中檢查大腸癌和/或良性瘤形成。
這樣確認了用本發明的前處理法處理作為非侵襲DNA材料的糞便是可以實際應用的。
而且，由于不只在各種疾病的診斷上有用而且可以操作性處理多數試樣，因此可以應用于以正常集團作為對象的大腸癌等的各種檢診中。因此，通過本發明的方法可以一定程度預測與消化器相關的瘤形成，對于經本發明的檢查方法判斷為需要注意的患者，也可以進行內窺鏡檢查等，以減輕患者的負擔。
序列表<110>國立大學法人岡山大學<120>基因的甲基化檢測方法以及通過甲基化檢測進行的瘤形成的檢測方法<130>GP05-1029PCT<150>JP2004-359471<151>2004-12-13<150>JP2004-360339<151>2004-12-13<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據APC基因設計的DNA<400>1atattttyga ggggtayggg gtta 24<210>2<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據APC基因設計的DNA<400>2tattgcggag tgcgggtc18<210>3<211>24
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據APC基因設計的DNA<400>3acraaaataa aaaacrccct aatc 24<210>4<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
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<210>7<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>根據MGMT基因設計的DNA<400>8acgttcgtag gttttcgc18<210>9<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據MGMT基因設計的DNA<400>9aactccrcac tcttccraaa acra 24<210>10<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據hMLH1基因設計的DNA<400>10ygggtaagty gttttgaygt aga 23<210>11<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據hMLH1基因設計的DNA<400>11cgttcgtcgt tcgttatata tc 22<210>12<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據hMLH1基因設計的DNA<400>12tatacctaat ctatcrccrc ctca 24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據SFRP1基因設計的DNA<400>13gygttttttt gttygtygta tttt 24<210>14<211>18
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據SFRP1基因設計的DNA<400>14tcgtagcgtc gttttttc18<210>15<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>根據SFRP2基因設計的DNA<400>17tcgtttcgtt ttttttcggt ttc 23
<210>18<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>根據SFRP2基因設計的DNA<400>18caacaacaac raaccaaaac cctac2權利要求
1.生物學試樣的前處理方法，其特征在于，在檢測生物學試樣中所含的基因和/或基因位點的甲基化的方法中，在所述生物學試樣中添加多糖類，不添加蛋白質變性劑。
2.根據權利要求1中記載的生物學試樣的前處理方法，其中，多糖類為糖原。
3.基因和/或基因位點的甲基化的檢測方法，其特征在于，使經權利要求1或2中記載的前處理方法進行前處理的生物學試樣與重亞硫酸鹽相接觸，使該生物學試樣中所含的基因和/或基因位點的非甲基化的胞嘧啶轉換成尿嘧啶，檢測沒有轉換成尿嘧啶的胞嘧啶。
4.瘤形成的檢查方法，其特征在于，檢測生物學試樣中所含的基因和/或基因位點中的SFRP2基因、DCC基因和MGMT基因的甲基化，計算甲基化基因的總和。
5.根據權利要求4中記載的瘤形成的檢查方法，其特征在于，進一步檢測APC基因和/或hMLH1基因的甲基化，計算甲基化基因的總和。
6.根據權利要求4或5中記載的瘤形成的檢查方法，其中，甲基化的檢測是通過權利要求3中記載的方法進行的。
全文摘要
以提供即簡便又經濟地檢測生物學試樣中所含的基因的甲基化的方法作為課題。還以提供在使用基因的甲基化的檢測方法檢查瘤形成時，正確且敏感度好的檢測方法作為課題。在檢測基因的甲基化時，在重亞硫酸鹽處理前，如果在生物學試樣中添加多糖類，即使不添加蛋白質變性劑，不再進行DNA純化，也可以在這之后進行重亞硫酸鹽處理，可以檢測未修飾成尿嘧啶的甲基化胞嘧啶。而且，通過檢測生物學試樣中含有的多種基因的甲基化，計算它們的總和，可以更為正確地進行瘤形成的檢測。
文檔編號C12N15/09GK101076605SQ20058004248
公開日2007年11月21日 申請日期2005年12月9日 優先權日2004年12月13日
發明者永坂岳司, 松原長秀, 田中紀章 申請人:國立大學法人岡山大學