專利名稱：一種具有抑制蛋白酶作用的藥物的檢測方法
技術領域：
本發明申請是申請文件“一種具有抑制蛋白酶作用的藥物的制備方法及檢測方法”的分案申請，原申請的申請號為2004100310574，申請日為2004年4月12日。
技術領域：
本發明屬于蛋白檢測領域，具體涉及一種具有抑制蛋白酶作用的藥物的檢測方法。
背景技術：
α1-蛋白酶抑制物(又名α1-抗胰蛋白酶，alpha-1 Antitrypsin，簡稱α1-PI)是分子量約為53,000道爾頓的糖蛋白，每升血漿平均含有1.5克。該蛋白在機體中主要是抑制彈性蛋白酶和其它絲氨酸蛋白酶的分解作用。當機體中有活性的α1-PI濃度顯著低于絲氨酸蛋白酶的濃度時，正如發生在具有α1-PI遺傳缺陷的人群中，肺組織就會遭到絲氨酸蛋白酶的破壞而引起慢性病變，如肺氣腫。這種肺氣腫的病人可應用α1-PI作長期的替代治療，然而市場上的α1-PI產品供不應求，因此，開發能工業化生產高質量α1-PI的工藝才能滿足市場的需求。
以往有多種已發表的可用于工業化生產具有抑制蛋白酶作用的藥物的方法。Glaser等人(Anal.Biochem.1982，124364-371)應用硫酸銨沉淀法從人血漿的Cohn氏組分IV-1中一步得到純度約為70％的α1-PI，然后再經陰離子交換層析法(DEAE-cellulose)精制，但收率偏低，只有40％左右。
Coan等人(美國專利US 4,379,087；Vox Sang.1985，48333-342)使用聚乙二醇沉淀法和陰離子交換層析法從人血漿的Cohn氏組分IV-1中純化α1-PI，收率約為50％，純度只有60％左右。此方法是美國拜爾公司(Bayer Corporation)1988年批準上市的α1-PI產品Prolastin的原型，該制劑中有活性的α1-PI僅占總蛋白的≥35％(見其產品說明書，14-7601-001(Rev.Jan.2002))。
Burnouf等人(Vox Sang.1987，52291-297)采用陰離子交換(DEAE Sepharose CL6B FF)和凝膠過濾(Sephacryl S-200)層析法從人血漿上清A(相當于Cohn氏組分II+III)中分離得到純度80-90％的α1-PI，收率為65-75％。
上述這些提純α1-PI的方法都未能在取得高收率的同時，保證產品的高純度和高活性。而且，上述方法工藝比較繁，成本比較高。實際操作上，分子大小及等電點都與α1-PI接近的蛋白，如血漿中含量最多的白蛋白，令分離高純度α1-PI的工作相當困難；而將沒有活性的α1-PI與有活性的α1-PI分開則是更大的挑戰。對離子交換層析條件的多番嘗試之后，本發明將簡單的兩步層析法整合成為可用作治療藥物之高純度和高活性的α1-PI的制備方法。
現有的α1-PI檢測技術通常應用特異性的抗體來定量測定α1-PI，包括放射性免疫擴散法，火箭免疫電泳法和ELISA法。可是，現有的應用特異抗體的技術無法將有活性的α1-PI與無活性的α1-PI區分開來，而且現有的這些技術成本相對比較高。
發明內容[要解決的技術問題]為了實現高收率，保證產品的高純度和高活性，同時簡化工藝及降低成本，本發明提供一種具有抑制蛋白酶作用的藥物的制備方法；同時針對現有檢測技術操作繁瑣、檢測靈敏度低的情況，本發明提供一種簡單易行、檢測靈敏度高的具有抑制蛋白酶作用的藥物的檢測方法。
為了實現高收率，保證產品的高純度和高活性，同時簡化工藝及降低成本，本發明提供一種具有抑制蛋白酶作用的藥物的制備方法，該方法含有如下步驟病毒滅活處理含有α1-PI的水溶液，離子交換樹脂吸附、洗脫。
將含有α1-PI的水溶液經病毒滅活處理，首先通過陰離子交換樹脂吸附α1-PI，并從陰離子交換樹脂上有選擇性地洗脫有活性的α1-PI；然后經過陽離子交換樹脂，得到具有抑制蛋白酶作用的藥物。含有α1-PI的水溶液包括人的血漿或血漿組分、含有基因重組α1-PI的微生物或細胞培養液以及含有α1-PI轉基因的動物體液包括乳汁和血漿。正常的人血漿，每升含有0.83-4.0克的α1-PI，其中相當大部分在血漿蛋白的工業化生產過程中富集于某些血漿組分。Wright等人的研究發現，在轉基因綿羊的乳汁中，α1-PI的含量可高達每升60克(Biotechnology，1991，9830-834)。在微生物如大腸桿菌(Casolaroet al，1987，J.Appl.Physiol.，632015-2023)和酵母(Hubbard et al，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.，86680-684)中，應用基因重組技術可產生大量的α1-PI。優選的含有α1-PI的材料是人血漿的Cohn氏組分IV，因其是應用低溫乙醇沉淀法(Cohn氏法)的常規工業化血漿蛋白純化過程中的廢棄物。為了增加α1-PI制品的安全性，在陰離子交換層析法處理以前，溶解的Cohn氏組分IV可經由一種或多種方法聯合去除/滅活病毒。病毒去除/滅活方法包括巴斯德(巴氏)消毒法，干熱法，低pH孵放法，有機溶劑/去污劑(S/D)處理法，辛酸或辛酸鹽處理法，超濾病毒去除法，納米過濾法，等等。
人血漿中的α1-PI有超過100種不同的分子變異體(variants)，含量高的幾個變異體的等電點在4.3-4.6之間。當溶液的pH高于其等電點時，α1-PI帶負電，能結合到陰離子交換樹脂上。溶液的pH比其等電點高的越多，α1-PI與陰離子交換樹脂的結合力越大。溶液中的陰離子與α1-PI競爭陰離子交換樹脂上的結合位點，因此，低的離子強度有利于α1-PI被吸附到陰離子交換層析柱。調節經病毒去除/滅活處理過的含有α1-PI的水溶液的pH至≥4.8，且≤12.0，并調節其離子強度至≥0.1mS/cm，且≤10.0mS/cm，使其流過陰離子交換層析柱。可用的陰離子交換樹脂包括強陰離子交換樹脂和弱陰離子交換樹脂，例如，安瑪西亞(Amersham)公司的Q Sepharose Fast Flow和DEAESepharose Fast Flow。目標蛋白α1-PI結合到陰離子交換樹脂上，部分雜蛋白不被吸附而得以除去。增加層析柱洗液的鹽濃度或調節洗液的pH，進一步洗脫部分雜蛋白，繼續增加洗液的鹽濃度或調節洗液的pH就把吸附的α1-PI有選擇性的洗脫下來。含α1-PI的陰離子交換層析柱洗脫液隨后用陽離子交換層析法精制。調節經透析處理的含α1-PI的陰離子交換層析柱洗脫液的pH至≥4.8，且≤13.0，并調節其離子強度至≥0.1mS/cm，且≤10.0mS/cm，使其流過陽離子交換層析柱。可用的陽離子交換樹脂包括強陽離子交換樹脂和弱陽離子交換樹脂，例如，安瑪西亞公司的SP Sepharose Fast Flow和CM SepharoseFast Flow。目標蛋白α1-PI流過陽離子交換樹脂，剩余的絕大部分雜蛋白被吸附而得以除去。收集陽離子交換層析柱流出液，通過超濾或透析處理，經配方后除菌過濾，然后裝瓶凍干及密封保存，作為純化的具有抑制蛋白酶作用的藥物。
同一構思的上述方法可以進行如下的改變具有抑制蛋白酶作用之藥物的制備方法，其特征在于將含有α1-PI的水溶液經病毒滅活處理后，首先使α1-PI流過陽離子交換樹脂，隨后被陰離子交換樹脂所吸附，并令有活性的α1-PI從陰離子交換樹脂上有選擇性地洗脫下來，得到具有抑制蛋白酶作用的藥物。上述兩種方法效果基本相同。
含有α1-PI的水溶液的病毒滅活處理通過加入具有病毒滅活作用的化學試劑進行孵放來完成的。具有病毒滅活作用的化學試劑加入到含有α1-PI的水溶液，在攝氏0度與攝氏50度之間孵放一個小時以上。病毒滅活處理前可加入相應穩定劑。
具有病毒滅活作用的化學試劑是有機溶劑和去污劑(S/D)。其中所用的去污劑是非離子化的。具有病毒滅活作用的化學試劑還包括辛酸以及辛酸鹽，等等。病毒滅活處理過程中常用的穩定劑是2％-50％的蔗糖和0.001M-0.50M的檸檬酸鈉。
最常用的有機溶劑是磷酸三丁酯，最常用的去污劑是TritonX-100。另外，吐溫80(Tween 80)也是常用的去污劑。所加入的磷酸三丁酯的終濃度在0.01％與10.0％之間，同時加入的Triton X-100的終濃度在0.01％與10.0％之間。
具有抑制蛋白酶作用的藥物的檢測方法是應用絲氨酸蛋白酶與α1-PI反應而引起相應波長的光吸收變化，從而定量測定α1-PI的活性。絲氨酸蛋白酶與底物反應引起相應波長的光吸收變化，α1-PI通過抑制絲氨酸蛋白酶而改變該波長的光吸收變化，具體方法包括如下步驟1)利用絲氨酸蛋白酶與α1-蛋白酶抑制物反應；2)測定引起相應波長的光吸收變化；3)依據光吸收變化測得定量的α1-蛋白酶抑制物的活性。
所加入的絲氨酸蛋白酶的終濃度在0.1ppm與100ppm之間，同時加入五倍于該酶重量的相應底物。量度一定時間內該波長的光吸收改變就可定量測定α1-PI的活性。應用絲氨酸蛋白酶檢測α1-PI活性的方法稱為，絲氨酸蛋白酶抑制力測定法。每個單位的絲氨酸蛋白酶抑制力定義為，與對照相比，在一分鐘內，改變相應波長的光吸收1個單位的活性。
最常用的絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶或彈性蛋白酶。其它可用的絲氨酸蛋白酶包括糜蛋白酶，凝血酶，纖維蛋白溶酶以及膠原酶，等等。高純度的胰蛋白酶比較容易得到，因而最常用于α1-PI的活性測定。應用胰蛋白酶檢測α1-PI活性的方法稱為，胰蛋白酶抑制力測定法。在沒有抑制物時，胰蛋白酶每分鐘的降解產物會增加相應波長的光吸收。每個單位的胰蛋白酶抑制力定義為，與對照相比，在一分鐘內，減少相應波長的光吸收1個單位的活性。胰蛋白酶的常用底物是苯甲酰精氨酸乙酯，胰蛋白酶抑制力測定的常用光波長是253nm。本發明提供的制備方法有效地實現高收率，保證產品的高純度和高活性，同時簡化工藝，降低成本；檢測方法簡單易行、靈敏度高。
應用本發明提供的方法與用陰離子交換(DEAE Sepharose CL6BFF)和凝膠過濾(Sephacryl S-200)提純α1-PI，最后用常規的ELISA方法檢測，結果表明本發明提供的方法有效地實現高收率，保證了產品的高純度和高活性。
現有的α1-PI檢測技術通常應用特異性的抗體來定量測定α1-PI，包括放射性免疫擴散法，火箭免疫電泳法和ELISA法。可是，現有的應用特異抗體的技術無法將有活性的α1-PI與無活性的α1-PI區分開來，而且現有的這些技術成本相對比較高。本發明提供的檢測方法應用簡單的絲氨酸蛋白酶與相應底物的反應定量測定有活性的具有抑制蛋白酶作用的藥物，排除了無活性的α1-PI，提高了精確度；同時操作步驟簡單，成本相應降低了。
具體實施方式本發明共設計如下反應條件表1、反應條件
下面的實施例應該是對本發明的進一步說明，而不是將本發明限定為所列舉的實施例。
實施例1Cohn氏組分IV加二十倍重量的純化水溶解后，加入37％蔗糖和0.38M檸檬酸鈉作為病毒滅活處理的穩定劑。隨后加入終濃度為0.3％的磷酸三丁酯和終濃度為1.0％的Triton X-100在30℃下孵放4個小時。經病毒滅活后，調節pH至6.5后，用水將離子強度降至2.5mS/cm，加到pH 6.5預平衡的DEAE Sepharose Fast Flow層析柱上。應用20mM磷酸二氫鈉和100mM氯化鈉溶液有選擇性地洗脫目標蛋白α1-PI。加大氯化鈉的濃度可把強力吸附的雜蛋白，包括銅藍蛋白，從該離子交換層析柱洗脫下來。DEAE Sepharose Fast Flow樹脂經0.5M氫氧化鈉消毒后可重復使用。
含α1-PI的洗脫液通過10kD的超濾膜包(Pall Corporation)除去鹽分。先用水將離子強度降至2.5mS/cm，再用5mM檸檬酸鈉(pH5.4)進行溶液交換。經處理的含α1-PI的溶液加到pH 5.4預平衡的CM Sepharose Fast Flow層析柱上，有活性的α1-PI流過該離子交換樹脂而得以純化。本實施例從4.18克組分IV中純化出45.3毫克，純度95.8％的α1-PI。有活性α1-PI的收率高達63.4％。
本實施例應用胰蛋白酶定量測定α1-PI的活性。在沒有抑制物時，33.3ppm的胰蛋白酶每分鐘降解166.7ppm的苯甲酰精氨酸乙酯所產生的產物會增加253nm的光吸收0.1-0.2個單位。每個單位的胰蛋白酶抑制力定義為，與對照相比，在一分鐘內，減少253nm的光吸收1個單位的活性。表2為本例的實驗數據。
表2、α1-PI活性
實施例2溶解的Cohn氏組分IV，用1M鹽酸調節pH至5.4，用水調節離子強度至1.5mS/cm，然后加到5mM檸檬酸鈉(pH 5.4)預平衡的CM Sepharose Fast Flow層析柱上。收集該離子交換樹脂的流出液，調節pH至6.5后，調節離子強度至2.5mS/cm，加到20mM磷酸二氫鈉溶液(pH 6.5)預平衡的DEAE Sepharose Fast Flow層析柱上。應用20mM磷酸二氫鈉和100mM氯化鈉溶液有選擇性地洗脫有活性的α1-PI。本實施例從5.34克組分IV中純化出58.9毫克，純度92.5％的α1-PI。有活性α1-PI的收率高達81.2％。表3為本例的實驗數據。
表3、α1-PI活性
其余的與實施例1相同。
權利要求
1.一種具有抑制蛋白酶作用的藥物的檢測方法，該方法包括步驟1)利用絲氨酸蛋白酶與α1-蛋白酶抑制物反應；2)測定引起相應波長的光吸收變化；3)依據光吸收變化測得定量的α1-蛋白酶抑制物的活性。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其中絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶、纖維蛋白溶酶或膠原酶。
全文摘要
本發明涉及一種具有抑制蛋白酶作用的藥物的制備方法及檢測方法，該方法包括步驟將含有α1－蛋白酶抑制物的水溶液經病毒滅活處理；離子交換樹脂吸附、洗脫；同時應用絲氨酸蛋白酶與α1－蛋白酶抑制物反應而引起相應波長的光吸收變化，從而定量測定α1－蛋白酶抑制物的活性。本發明的制備方法有效地實現高收率，保證產品的高純度和高活性，同時簡化工藝，降低成本；檢測方法簡單易行、靈敏度高。
文檔編號C12Q1/37GK1877303SQ20061008294
公開日2006年12月13日 申請日期2004年4月12日 優先權日2004年4月12日
發明者黃炳镠, 謝亦武, 司徒子杰 申請人:愛華生物科技(香港)有限公司