專利名稱：一種抑制明膠酶a活性的多肽和制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學多肽的制備及應用，具體地說是應用噬菌體展示技術篩選并獲得明膠酶A(MMP-2)抑制性多肽M205C4編碼cDNA序列的過程、該多肽具有對MMP-2酶活性有抑制作用以及體外抑制腫瘤細胞侵襲轉移的作用；因此，該多肽可能應用于人類腫瘤細胞侵襲的預防和治療。
背景技術：
腫瘤已成為繼心血管疾病之后威脅人類生命的一大殺手。腫瘤的進程包括正常細胞某些基因的改變、惡性表型的形成、侵襲鄰近正常組織、遠距離及全身組織擴散(轉移)。據臨床統計，約有80％以上的腫瘤患者死于腫瘤的侵襲與轉移，故對腫瘤細胞的侵襲、轉移研究方面一直受到人們的關注。
腫瘤的生長、侵襲和轉移依賴于腫瘤血管的生成。腫瘤細胞生長轉移的主要障礙是細胞外基質。研究表明，基質金屬蛋白酶類(MMPs)和其他蛋白酶與腫瘤組織周圍基質的重塑有關。其中，MMP-2與腫瘤的發生、發展以及腫瘤臨床惡性程度密切相關。
MMP-2，又稱明膠酶A，分子量72KD，是基質金屬蛋白酶家族中的一員。MMP-2主要降解明膠、IV、V、VII、X型基底膜膠原。基質金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)為MMP-2特異性組織抑制因子，能特異性與MMP-2催化中心的Zn2+結合，封閉其催化活性。在體內，MMPs和TIMPs的轉錄和活性受多因素和多水平的調節，從而維持動態平衡。該調節機制紊亂，可出現相應的病理狀態，尤其在腫瘤侵襲、轉移中的作用更為突出。研究表明，MMP-2在多種腫瘤中過表達，并與腫瘤惡性程度密切相關，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、直腸癌、胃癌等(李東、于宏、賀占國。明膠酶與疾病關系的研究。醫學綜述，2002，8(8)442。)。TIMP-2作用作為MMP-2的組織抑制劑，其方式復雜，它一方面可以抑制MMP-2的活性，但同時還參與MMP-2的激活(李東、于宏、賀占國。明膠酶與疾病關系的研究。醫學綜述，2002，8(8)442。)，有時參與細胞生長、繁殖及刺激血管生成等病理、生理學過程。MMP-2與TIMP-2相互作用的結果與腫瘤細胞侵襲、轉移有相關性，MMP-2/TIMP-2比值甚至作為一些腫瘤惡性程度及預后判斷的一項指標(朱峰、劉新光、梁念慈。基質金屬蛋白酶及其組織抑制物與腫瘤侵襲轉移。國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，2001，22(5)229。)。MMP-2其他抑制因子如Kazal基序逆向誘導半胱氨酸豐富蛋白(RECK)、組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)等雖然可以作為MMP-2的抑制物，并且在體外已表達，但由于其作用機理仍未完全清楚，在抑制MMP-2活性的同時產生其他的副作用(Andrew H.Baker，Dylan R.Edwards and Gillian Murphy.Metalloproteinasein hibitorsbiological actions and therapeutic opportunities.Journalof cell science.2002，115(19)3719.)。
綜上所述，尋找與MMP-2特異結合的抑制劑，對于抑制MMP-2活性，同時在體內抑制腫瘤的侵襲、轉移對于腫瘤患者治療是非常重要的。
發明內容
1.發明目的本發明的目的是提供一種抑制MMP-2活性的多肽及其制法以及該多肽抑制MMP-2作用和體外抑制腫瘤細胞侵襲轉移作用。
2.技術方案本研究主要采用噬菌體展示技術篩選MMP-2特異性結合抑制性多肽來抑制MMP-2的活性。首先是將靶蛋白MMP-2包被酶標板，4℃過夜，使MMP-2能與酶標板很好的結合。然后用BSA封閉液封閉酶標板孔中未結合MMP-2的部位，減少非特異性噬菌體結合。向已封閉好的酶標板中加入噬菌體，使得噬菌體尾部表達的肽與MMP-2結合，再用TBST洗掉未結合的噬菌體，最后用甘氨酸-鹽酸洗脫液洗脫結合的噬菌體，用Tris-HCl中和后即得篩選的噬菌體。將該噬菌體經過擴增以后進行隨后的幾輪篩選，即可得到特異性結合MMP-2的噬菌體。在噬菌體篩選的過程中，第一輪篩選洗脫時強度要小，在隨后的幾輪中逐漸增強洗脫強度，即可得到結合能力強的特異性結合的噬菌體。將末次篩選的噬菌體涂板，挑克隆，進行噬菌體擴增，然后用MMP-2熒光藥物篩選試劑盒再次對噬菌體單克隆進行篩選，即可得到結合能力最強的噬菌體。然后將所得噬菌體提取DNA，測序，比對后就可得到抑制MMP-2酶活性的多肽編碼序列M205C4。
一種抑制明膠酶A活性的多肽M205C4，其特征是它由H N W T R W L L H PD R G G G S所示的氨基酸序列所組成。
編碼M205C4的cDNA序列為CAT AAT TGG ACG CGG TGG TTG CTTCAT CCT GAT CGT GGT GGA GGT TCG上述編碼M205C4的cDNA序列，還包含所列cDNA序列的互補序列，以及類似的人工合成序列。
篩選上述多肽M205C4的方法，其步驟如下(1)噬菌體的擴增從第一、二輪篩選的噬菌體洗脫液中取10μl，加入20mL培養至吸光度A600＝0.5的ER2738菌中，室溫放置、振蕩、培養、離心，分離出上清液，將上清液再離心，加1/6體積的PEG8000NaCl溶液，過夜；第二天將沉淀過夜的噬菌體溶液離心，棄上清，加1mL TBS混懸沉淀，離心，轉移上清液至
EP管中，離心，再次轉移上清液至新的EP管中，加1/6體積的PEG8000NaCl溶液，冰浴沉淀后離心，棄上清，100μl TBS溶沉淀，再離心1min，轉移上清至新EP管中，即得擴增的噬菌體；(2)親和篩選用100ul MMP-2靶蛋白包板，過夜，加入200ulBSA封閉液封閉，用TBST洗6次，每次在加入TBST后均在搖床上輕搖2分鐘，清洗完畢后，將酶標條在干凈的吸水紙上敲幾次，去除剩余的液體，噬菌體原庫10μl加入100μl TBST即含0.1％吐溫中，混勻后加入包被好的酶標板中，搖60分鐘，按上述方法用TBST即含0.1％吐溫洗10次，去除剩余液體后，加入100μl甘氨酸-鹽酸洗脫液，搖7分鐘，收集洗脫液，加15μl Tris-HCl中和，滴度測定，此即第一輪篩選；取10μl洗脫液進行噬菌體擴增，用擴增的噬菌體進行第二輪的親和篩選；同法進行第三輪篩選；(3)將第三輪篩選的噬菌體進行滴度測定，同時挑克隆，擴增，然后用MMP-2特異性熒光分析試劑盒檢測挑選的單克隆擴增產物對MMP-2酶活性的抑制作用，挑選抑制作用強的噬菌體單克隆提取DNA，進行DNA測序，由此cDNA翻譯得到的多肽序列命名為M205C4。
上述篩選多肽的方法在步驟(1)中在ER2738菌中加入噬菌體洗脫液后，室溫放置15min，于37℃250r/min振蕩培養(4-4.5)h，4℃10000rpm離心10min，將上清液再離心5min，加1/6體積的PEG8000NaCl為20％W/V的PEG8000、2.5mol/L的Nacl，4℃過夜，將過夜的噬菌體溶液在4℃10000rpm離心15min，轉移上清液至EP管中后在4℃12000rpm離心5min，冰浴沉淀(40-60)min，4℃13000rpm離心20min。
上述篩選多肽的方法在步驟(2)中所述的MMP-2靶蛋白包板是用pH8.6、0.1mol/L NaHCO3溶解至濃度為10μg/ml，4℃過夜，所述的BSA封閉液為5mg/mlBAS，0.1mol/L NaHCO3，pH8.6，封閉1h；所述的TBST洗液為50mmol/L，Tris-HCl，pH7.5，150mmol/L NaCl，0.1％V/V Tween-20；所述的甘氨酸-鹽酸為0.2mol/L，pH2.2，用1.0mol/L，pH9.1的Tris-HCl中和。
試驗研究結果表明不同濃度的多肽M205C4，對MMP-2具有不同程度的抑制作用，且隨著多肽M205C4濃度的不斷增加，對MMP-2的活性抑制逐漸升高，呈現劑量依賴性；中和性多肽M205C4抑制MMP-2酶活性的IC50為38.8nmol/L；不同劑量的多肽M205C4，對體外人胰腺癌細胞系PANC-1與CFPAC-1侵襲轉移作用具有不同程度的抑制作用，且隨著多肽M205C4劑量的增加，其抑制腫瘤細胞侵襲轉移的作用逐漸增強，呈現劑量依賴性。
3.有益效果本發明所得M205C4多肽，經過抑制MMP-2酶活性試驗測定IC50，以及體外對經過PGE2處理后獲得高侵襲性的胰腺癌細胞系PANC-1、CFPAC-1的侵襲轉移抑制性試驗研究結果表明(1).M205C4在較低濃度下即可抑制MMP-2酶活性(表1)，其IC50為38.82nmol/L。
(2).M205C4體外可以抑制PANC-1、CFPAC-1的侵襲轉移作用，并具有一定的劑量——效應關系(圖3、圖4)。
四
圖1.編碼M205C4的cDNA序列。
圖2.M205C4氨基酸序列。
圖3.胰腺癌細胞系PANC-1經PGE2處理后，MMP-2生成增加，侵襲轉移能力顯著增強，當加入M205C4后，侵襲轉移能力下降，并具有一定的劑量效應關系。
圖4.胰腺癌細胞系CFPAC-1經PGE2處理后，MMP-2生成增加，侵襲轉移能力顯著增強，當加入M205C4后，侵襲轉移能力下降，并具有一定的劑量效應關系。
五具體實施例方式
實施例1.多肽M205C4的篩選方法試驗材料(1)噬菌體12肽庫、受體菌ER2738均購自NEW ENGLAND Biolabs公司。
(2)重組人MMP-2，購自美國R&D公司。
(3)MMP-2熒光分析藥物篩選試劑盒，購自美國Biomol公司。
試驗方法(1)噬菌體的擴增從第一、二輪篩選的噬菌體洗脫液中取10μl，加入20mL培養至吸光度A600＝0.5的ER2738菌中，室溫放置15min，于37℃250r/min振蕩培養4.5h，4℃10000rpm離心10min，分離出上清液，將上清液再離心5min，加1/6體積的PEG8000NaCl(20％W/V PEG8000、2.5mol/L NaCl)溶液，4℃過夜；第二天將沉淀過夜的噬菌體溶液在4℃10000rpm離心15min，棄上清，加1mL TBS混懸沉淀，離心，轉移上清液至EP管中，4℃12000rpm離心5min，重新轉移上清液至新EP管中，加1/6體積的PEG8000NaCl溶液，冰浴沉淀40分鐘，4℃13000rpm離心20min，棄上清，100μl TBS溶沉淀，再離心1min，轉移上清至新EP管中，即得擴增的噬菌體；(2)親和篩選用100ulMMP-2靶蛋白(用pH 8.6，0.1mol/LNaHCO3溶解至濃度為10μg/ml)包板，4℃過夜，棄去包被液，加入200ulBSA封閉液(5mg/mLBSA，0.1mol/L NaHCO3pH 8.6)封閉1h，用TBST(50mol/L Tris-HCl，pH 7.5，150mmol/L NaCl，0.1％V/V Tween-20)洗6次，每次在加入TBST后均在搖床上輕搖2分鐘，清洗完畢后，將酶標條在干凈的吸水紙上敲幾次，去除剩余的液體，噬菌體原庫10μl加入100μl TBST(0.1％吐溫)中，混勻后加入包被好的酶標板中，搖60分鐘，按上述方法用TBST(0.1％吐溫)洗10次，去除剩余液體后，加入100μl甘氨酸-鹽酸(0.2mol/L pH2.2)洗脫液，搖7分鐘，收集洗脫液，加15μl Tris-HCl(1.0mol/L pH9.1)中和，滴度測定，此即第一輪篩選；取10μl噬菌體洗脫液進行噬菌體擴增，并進行第二輪的親和篩選，同法進行第三輪篩選；(3)將第三輪篩選的噬菌體進行滴度測定，同時挑克隆，擴增，然后用MMP-2特異性熒光分析試劑盒檢測挑選的單克隆擴增產物對MMP-2酶活性的抑制作用，挑選抑制作用強的噬菌體單克隆提取DNA，進行DNA測序(結果見圖1)，并經過翻譯后得到的多肽序列命名為M205C4(見圖2)。
實施例2.多肽M205C4對MMP-2的抑制作用與IC50的計算試驗方法按照MMP-2熒光檢測試劑盒方法，向96孔檢測板中加入中和性多肽M205C4(由西安華辰有限公司合成)和MMP-2，使得M205C4終濃度分別為0、5、10、25、50、100nmol/L，37℃溫育45min，加入底物，立即在波長為328/393nm處測定熒光值，并計算酶活性抑制百分率。應用SPSS10.0軟件計算IC50。
實驗結果如表1所示，向反應體系中加入不同濃度的M205C4，對MMP-2具有不同程度的抑制作用，且隨著M205C4濃度的不斷增加，對MMP-2的活性抑制作用逐漸增強，呈現劑量依賴性。中和性多肽M205C4抑制MMP-2酶活性的IC50為38.82nmol/L。
表1 M205C4對MMP-2活性抑制作用
實施例3.多肽M205C4體外抑制胰腺癌細胞系侵襲試驗試驗材料
(1)M205C4多肽由西安華辰有限公司合成，用pH7.2PBS緩沖液溶解。
(2)人胰腺癌細胞系PANC-1與CFPAC-1，購至中科院上海細胞所。細胞培養于含10％FBS、100ug/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的DMEM培養液中，于5％CO2、37℃培養。細胞密度達80％-90％時用0.25％胰酶消化傳代。
試驗方法將PANC-1、CFPAC-1接種于培養瓶中，過夜。用終濃度為10μmol/L的PGE2處理細胞8h，胰酶消化，用含0.5％BSA的無血清DMEM中和，離心，收集細胞。用無血清DMEM重懸細胞，調整細胞密度(PANC-11.0×105/mL，CFPAC-12.0×105/mL)。將250μL細胞懸液加入已用無血清DMEM培養液潤濕好的侵襲小室上室中，同時加入PGE2(終濃度10μmol/L)和中和性多肽M205C4(終濃度分別為100、30、10nmol/L)。在下室中加入含5.0％FBS的DMEM，于5％CO2、37℃培養24h。取出上室，用棉簽去除未侵襲轉移的細胞和基質膠，結晶紫染色，顯微鏡下觀察。每樣隨機各取3個視野進行細胞計數。本試驗重復三次。
數據處理用相對值表示，即以單獨用PGE2處理的侵襲轉移細胞數為基準，其余各組與其相比即得。應用SPSS10.0軟件進行統計學分析處理，P＜0.05具有統計學意義。
試驗結果(1)胰腺癌細胞系PANC-1經PGE2處理后，侵襲轉移能力明顯增強，與對照組相比具有顯著的統計學差異(P＜0.01)。PANC-1細胞經PGE2預處理后加入中和性多肽M205C4后，其侵襲轉移能力明顯下降。高劑量100nmol/L M205C4能顯著抑制PANC-1細胞侵襲轉移，與單獨用PGE2處理組相比，具有顯著的統計學差異(P＜0.01)；中劑量30nmol/L M205C4也具有相似的作用效果(P＜0.05)，但其抑制作用小于高劑量組；低劑量10nmol/L M205C4雖然也可以抑制PANC-1的侵襲轉移，但與單獨用PGE2處理組相比無統計學差異(P＞0.05)。
(2)胰腺癌細胞系CFPAC-1未經PGE2處理時，幾乎無侵襲轉移能力(未附圖)，經PGE2處理后，侵襲轉移能力明顯增強，在鏡下觀察可見大量的細胞。CFPAC-1經PGE2預處理后加入中和性多肽M205C4后，其侵襲轉移能力明顯下降。高劑量100nmol/L M205C4能顯著抑制MMP-2的活性，使得CFPAC-1細胞侵襲轉移能力減弱，與對照PGE2處理組相比，具有非常顯著的統計學差異(P＜0.001)；中劑量30nmol/L M205C4也具有相似的作用效果(P＜0.01)，但其抑制作用小于高劑量組；低劑量10nmol/L M205C4雖然可以抑制CFPAC-1的侵襲轉移，但與PGE2處理組相比無統計學差異(P＞0.05)。
權利要求
1.一種抑制明膠酶A活性的多肽M205C4，其特征是它由H N W T R W L L HP D R G G G S所示的氨基酸序列所組成。
2.一種抑制明膠酶A活性的多肽M205C4，其特征是它具有如下cDNA序列CAT AAT TGG ACG CGG TGG TTG CTTCAT CCT GAT CGT GGT GGA GGT TCG。
3.一種篩選權利要求1所述多肽M205C4的方法，其步驟如下(1)噬菌體的擴增從第一、二輪篩選的噬菌體洗脫液中取10μl，加入20mL培養至吸光度A600＝0.5的ER2738菌中，室溫放置、振蕩、培養、離心，分離出上清液，將上清液再離心，加1/6體積的PEG8000NaCl溶液，過夜；第二天將沉淀過夜的噬菌體溶液離心，棄上清，加1mL TBS混懸沉淀，離心，轉移上清液至EP管中，離心，再次轉移上清液至新EP管中，加1/6體積的PEG8000NaCl溶液，冰浴沉淀后離心，棄上清，100μl TBS溶沉淀，再離心1min，轉移上清至新EP管中，即得擴增的噬菌體；(2)親和篩選用100ul MMP-2靶蛋白包板，過夜，加入200ulBSA封閉液封閉，用TBST洗6次，每次在加入TBST后均在搖床上輕搖2分鐘，清洗完畢后，將酶標條在干凈的吸水紙上敲幾次，去除剩余的液體，噬菌體原庫10μl加入100μl TBST即含0.1％吐溫中，混勻后加入包被好的酶標板中，搖60分鐘，按上述方法用TBST即含0.1％吐溫洗10次，去除剩余液體后，加入100μl甘氨酸-鹽酸洗脫液，搖7分鐘，收集洗脫液，加15μl Tris-HCl中和，滴度測定，此即第一輪篩選；取10μl噬菌體洗脫液進行擴增，并進行第二輪的親和篩選，同法進行第三輪篩選；(3)將第三輪篩選的噬菌體進行滴度測定，同時挑克隆，擴增，然后用MMP-2特異性熒光分析試劑盒檢測挑選的單克隆擴增產物對MMP-2酶活性的抑制作用，挑選抑制作用強的噬菌體單克隆提取DNA，進行DNA測序，得到的多肽序列命名為M205C4。
4.根據權利要求4所述篩選多肽的方法，其特征在于在步驟(1)中在ER2738菌中加入噬菌體洗脫液后室溫放置15min，于37℃250r/min振蕩培養4.5h，4℃10000rpm離心10min，將上清液再離心5min，加1/6體積的PEG8000NaCl為20％W/V的PEG8000、2.5mol/L的NaCl，4℃過夜，將過夜的噬菌體溶液在4℃10000rpm離心15min，轉移上清液至EP管中后在4℃12000rpm離心5min，冰浴沉淀40min，4℃13000rpm離心20min。
5.根據權利要求4所述篩選多肽M205C4的方法，其特征在于在步驟(2)中所述的MMP-2靶蛋白是用pH8.6，0.1mol/L NaHCO3溶解至濃度為10ug/ml包板，4℃過夜，所述的BSA封閉液為5mg/ml BAS，0.1mol/L NaHCO3，pH8.6，封閉1h；所述的TBST洗液為50mmol/L，Tris-HCl，pH7.5，150mmol/L NaCl，0.1％V/V Tween-20；所述的甘氨酸-鹽酸為0.2mol/L，pH2.2，用1.0mol/L，pH9.1的Tris-HCl中和。
6.權利要求1所述的多肽M205C4，其特征在于不同濃度的多肽M205C4，對MMP-2酶活性具有不同程度的抑制作用，且隨著多肽M205C4濃度的不斷增加，對MMP-2的活性抑制逐漸增強，呈現劑量依賴性；中和性多肽M205C4抑制MMP-2酶活性的IC50為38.8nmol/L。
7.權利要求1所述的多肽M205C4，其特征在于不同劑量的多肽M205C4，對體外人胰腺癌細胞系PANC-1與CFPAC-1的侵襲轉移作用具有不同程度的抑制作用，且隨著多肽M205C4劑量的增加，其抑制作用逐漸增強，呈現劑量依賴性。
全文摘要
一種抑制明膠酶A活性的多肽M205C4，由H NW T R W L L H P D R G G G S所示的氨基酸序列所組成。采用噬菌體展示技術篩選MMP－2特異性結合抑制性多肽來抑制MMP－2的活性，篩選多肽的方法首先是噬菌體親和篩選，其次是噬菌體的擴增，經幾輪篩選得到特異性結合MMP－2的噬菌體，并涂板，挑克隆，進行噬菌體擴增，然后用MMP－2熒光藥物篩選試劑盒再次對噬菌體單克隆篩選，即可得到抑制MMP－2酶活性的多肽M205C4，經試驗研究表明該多肽M205C4具有抑制MMP－2酶活性的作用，有抑制體外胰腺癌細胞系PANC－1和CFPAC－1侵襲轉移的作用。
文檔編號C12N7/00GK1869062SQ200610085779
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月30日 優先權日2006年6月30日
發明者韓曉, 鄭馬慶, 孫玉潔 申請人:南京醫科大學