專利名稱：一種定向誘導雞胚精原干細胞分化為成骨細胞的方法
技術領域：
本發明涉及雞胚精原干細胞分化為成骨細胞的方法，屬于細胞工程
背景技術：
雞精原干細胞(SSCs)具有分化的多能性，在體外培養過程中加入合適的誘導分化劑可以誘導出所需要的特殊類型細胞和組織，從而引起了人們的極大關注。目前人們對干細胞誘導分化為成骨細胞的研究多限于在哺乳類動物(大鼠、小鼠)，Gopalakrish.V等利用鼠骨髓基質干細胞(BMSCs)誘導為成骨細胞，Deliloglu-gurhan從分子水平研究BMSCs誘導成骨細胞的內在機理；張維成、丁亮華等分別利用大鼠和人的骨髓基質干細誘導成骨細胞，均獲得了成功。
但是對家禽SSCs的研究目前還處于起步階段，雞胚SSCs的研究多見于分離方法、提取純化，獲得雞精原干細胞，多種細胞因子離體培養，SSCs冷凍保存以及SSCs或睪丸組織移植等方面，而對其體外誘導分化為多種細胞的能力的研究尚未見有報道。本實驗目的旨在研究雞胚SSCs體外定向誘導向成骨細胞分化的能力，為探索精原干細胞(SSCs)的臨床應用價值和多能性提供素材。
發明內容
本發明的目的是提供一種定向誘導雞胚精原干細胞分化為成骨細胞的方法，將所提取獲得的雞精原干細胞，通過研究對雞精原干細胞進行體外誘導培養，獲得有效的誘導成骨細胞的方法，為誘導后對其繼續進行體外擴增培養并應用于臨床實驗，使其成為一種成熟的技術。
本發明的技術方案是一種定向誘導雞胚精原干細胞分化為成骨細胞的方法，其特征是將所提取獲得的雞精原干細胞接種于無飼養層培養瓶內，利用條件培養液進行誘導培養，所述培養液為DMEM高糖培養基中含有10％小牛血清、2％的雞血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/L β-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10-7mol/L地塞米松、0.01mol/L β-磷酸甘油鈉、0.05g/L維生素C。
本發明工藝先進簡單，無需專門的儀器設備，只要掌握細胞培養的基本操作規則，簡便易行。通過研究干細胞具有分化潛能的多能性為探索精原干細胞(SSCs)的臨床應用價值和多能性提供素材，對誘導后的成骨細胞進行體外繼續擴增培養并應用于臨床實驗，使其成為一種成熟的技術，實施細胞替代療法，為最終實現組織器官的再生和替換提供可能，并借此希望找到一條建立大規模生產所需細胞平臺的途徑，進而為發育生物學、醫學、遺傳學領域開拓一個嶄新的研究前景。本發明所采用的誘導方法也適用于其它禽類的精原干細胞的誘導研究，且可操作性強。
圖1、圖2為經ALP染色后的成骨細胞圖片；圖3、圖4為經Von kossa’s染色后的成骨細胞圖片；圖5、圖6為免疫組化(I型膠原)染色后的成骨細胞圖片。
具體實施例方式
步驟1雞胚SSCs的分離與純化取孵化16-19天雞胚胎，無菌獲取雞睪丸。經膠原酶(1mg/ml)消化，后用胰蛋白酶(0.25％)消化，以獲取生精上皮上的SSCs、支持細胞和間質細胞等，后經350目過濾篩過濾、percoll梯度離心、貼壁速度差，以獲取較高純度的精原干細胞，用臺盼藍染色計數，調整細胞密度為1x105個/ml，接種于6孔培養板，置于38℃、5％CO2培養箱中培養。
步驟2雞胚SSCs的離體誘導培養SSCs培養3-4天后，用預熱的條件誘導液(基礎培養基+10-7mol/L地塞米松+0.01mol/L β-磷酸甘油鈉+0.05g/L維生素C)進行半量換液。以后每24小時觀察，每72小時全量換液。觀察時隨機抽取10個非重疊視野(×100)，計算成骨細胞占SSCs細胞數的比例。(表1)步驟3堿性磷酸酶(ALP)改良鈣鈷法對雞SSCs在體外條件誘導劑培養3周左右，棄去誘導劑，置固定液中固定8-10分鐘，蒸餾水沖洗3次。置基質液中，37℃孵育4-6小時。取出滴加數滴硝酸鈷，作用5-7分鐘，PBS沖洗。滴加20g/l硫化銨數滴，作用5-8分鐘，PBS沖洗。伊紅復染5分鐘，沖洗，晾干，鏡檢。
堿性磷酸酶(ALP)改良鈣鈷法鑒定結果在顯微鏡下觀察經ALP染色后的成骨細胞，其細胞胞漿內有黑褐色顆粒或塊狀沉淀，即ALP染色呈陽性。觀察發現有的細胞融合成大片狀，細胞間隙難以區分，也有許多以單個細胞形式存在，細胞核很明顯(見圖1、2)。
步驟4鈣結節Von Kossa’s法對雞SSCs在體外條件誘導劑培養3周左右，棄去誘導劑，PBS沖洗，于95％的乙醇中固定8-10分鐘，PBS沖洗，5％硝酸銀常溫避光15分鐘，紫外線照射15-20分鐘，蒸餾水沖洗，5％硫代硫酸鈉中2-3分鐘，蒸餾水沖洗，伊紅染液復染3-5分鐘，沖洗，晾干，鏡檢。
鈣結節Von Kossa’s法鑒定成骨細胞結果在顯微鏡下觀察經Vonkossa’s染色后的成骨細胞，可清晰看見鈣鹽沉積區域即結節呈黑色，其黑色沉淀物分布于細胞的形成基質中(見圖3、4)。
步驟5免疫組化I型膠原(Collagen I)鑒定將已誘導4周的成骨細胞棄去誘導液，用固定液(冷丙酮∶無水乙醇＝3∶2)固定1小時，PBS沖洗，加入過氧化物酶阻斷液阻斷內源性過氧化物酶8-10分鐘，加入5％BSA封閉液15-20分鐘，加入Collagen I單克隆抗體，37℃水浴1小時，PBS沖洗，加入二抗(生物素標記)，室溫孵育15-20分鐘，蒸餾水沖洗，加入鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)溶液，室溫孵育15-20分鐘，沖洗，DAB顯色，晾干，鏡檢。
免疫組化I型膠原(Collagen I)鑒定方結果定向誘導后的細胞經SABC法染色后，細胞呈棕褐色，表明雞胚SSCs定向分化為成骨細胞，并且分泌I型膠原，呈陽性反應(見圖5、6)。
表1 SSCs誘導分化為成骨細胞結果Table 1 The differentiation rate of induction of osteoblasts (n＝10)
注字母d表示孵化天數，字母ab之間表示差異極顯著(P＜0.01)。
權利要求
1.一種定向誘導雞胚精原干細胞分化為成骨細胞的方法，其特征是將所提取獲得的雞精原干細胞接種于無飼養層培養瓶內，利用條件培養液進行誘導培養，所述培養液為DMEM高糖培養基中含有10％小牛血清、2％的雞血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/Lβ-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10-7mol/L地塞米松、0.01mol/Lβ-磷酸甘油鈉、0.05g/L維生素C。
全文摘要
本發明公開了一種定向誘導雞胚精原干細胞分化為成骨細胞的方法，屬于細胞工程技術領域。其特征是將所提取獲得的雞精原干細胞接種于無飼養層培養瓶內，利用條件培養液進行誘導培養，所述培養液為DMEM高糖培養基中含有10％小牛血清、2％的雞血清、2mmol/L L－谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10
文檔編號C12N5/06GK1935986SQ20061009663
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月13日 優先權日2006年10月13日
發明者李碧春, 孫國波, 陳國宏, 吳信生, 趙文明, 徐琪, 葛劍輝, 魏彩霞, 戴建明, 孫鵬翔 申請人:揚州大學