專利名稱：：一種前t載體及其制備與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種可用于快速克隆PCR產物的前T載體及其制備與應用。(二)背景4支術PCR技術是分子生物學和基因工程研究中的一項基本技術，它被廣泛用于體外擴增已知或未知的特異DNA片段。對PCR產物進行快速有效的克隆是開展雜交分析、高質量測序及從復雜PCR產物中分離目的片段等下游實驗，實現PCR產物多種用途的必經之路。T-載體是近年發展起來的一種用于直接克隆PCR產物的新型載體。T-載體一般為線性，其分子末端各有一個3'dT(脫氧胸苷)突出。利用7^DNA聚合酶的末端轉移酶活性，在擴增DNA的3'末端非才莫纟反依賴地加上一個核苦酸，通常為脫氧腺苷酸(dA)。這個3'dA突出端被用于把PCR產物插入到插入位點有一個3'dT突出的T-載體上。這樣就將PCR產物以粘性末端連接的方式直接克隆到載體上。這種方式不僅克服了常規克隆方法的缺點，而且操作筒便、方法快捷、連接效率高，因而其應用范圍非常廣泛。經典的T-載體的構建方法有兩種(1)將載體通過5VwaE或五coRV等平端內切酶線性化切出平端，在缺乏dATP及存在過量dTTP情況下，用7^DNA聚合酶催化，在3，末端加上dT，回收后即得到T-載體。該方法對反應條件要求嚴格，平末端加dT的效率達不到100°/。，因為反應是一個動態過程，r"《酶的工作效率隨反應體系中越來越多的T末端產生而P爭低，這就導致少量兩端均未加T的平端線性化質粒的存在，在與PCR產物連接過程中難以避免載體自身環化，且經過兩次回收的過程較繁瑣；每次生產T-載體產量有限(一般為l嗎)，不適于大規模生產，且dT堿基不太穩定，故批次質量不穩定，如果其貯存時間較長或多次凍融反復使用，克隆效率會大大降低。如藍白斑篩選時，即使有大量白色菌落出現，其中很多都是假陽性。這樣制作T-載體只是為維護商業利益有意回避他人復制。(2)用脫氧核苦酸末端轉移酶(TDT)在線性化載體的3，末端加上雙脫氧胸腺嘧咬核香酸(ddTTP)。這種方法存在明顯缺點一是同樣不能保證100%的載體分子末端都能加上dT，二是難以控制加上去的正好是l個dT。利用限制性內切酶制備T-載體是T-載體制備方法中最為先進的方式，國內外的一些學者都進行了嘗試，并建立了相應的T-載體。在內切酶家族中，有一類稱可變酶，它們的識別序列中的一個或幾個核苷酸是可變的。經查NewEnglandBiolabs公司的目錄，符合上述特征的酶列于表1:表1可用于生產T-載體的限制性內切酶(NEB)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>國內也有較多的文章"R道T載體的構建及其應用。酶法制備T載體首先要得到一個環狀的前T質粒載體，經Xcml酶切兩個位點后，載體的大片段DNA線性化，而且兩個3，末端均帶dT，從而得到可用于PCR產物快速克隆的T載體，如市場上供應pUCm-T載體。用酶法制備T載體有可能存在以下幾個方面的問題，一，如果酶切質粒DNA質量不高，外源基因不能插入載體中，而載體轉化感受態細胞后能夠在抗性平板上生長。pUCm-T載體設計了藍白斑篩選方案以篩選目的DNA片段是否插入載體，如果插入載體，編碼半乳糖苷酶ot肽的基因LacZ被插入失活，細胞內沒有半乳糖苷酶活性，在含有生色底物X-gal的篩選平板中白色菌落為插入失活陽性克隆，而蘭色菌落為不含外源基因的陰性克隆。這種方法需要使用價格昂貴的X—gal，制備藍白斑篩選平板也比較麻煩。二，如果兩個IcmI酶切位點空間位置較近，將影響載體的酶切效率，即使載體DNA的純度很高，酶的質量也^艮好，也會出現酶切載體一"刀"的情況，這種線性的載體不能和PCR產物連接，而是載體自連，從而導致陰性克隆的產生。
發明內容本發明既是為了提供一種可用于快速克隆PCR產物、篩選陽性克隆過程中不需要使用X-gal的前T載體，及其制備與應用。為達到發明目的本發明采用的技術方案是一種前T載體，由以下方法制備得到(1)以含有氨卡青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質粒為模板進行PCR擴增，在引物的5'末端引入Xc附I酶切位點，擴增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表達調控序列、兩端含有ZcmI酶切位點的DNA片段；(2)利用重疊延伸拼接技術，將步驟(1)得到的DNA片段和T載體進行連接；(3)將步驟(2)所得連接產物轉化大腸桿菌DH5cc或JM109，篩選陽性克隆，即得所述前T載體。本發明還涉及制備所述的前T載體的方法，所述方法如下(l)以含有氨節青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質粒為模板進行PCR擴增，在引物的5，末端引入Xc附I酶切位點，擴增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表達調控序列、兩端含有Xcwl酶切位點的DNA片段；(2)用T4DNA連接酶將步驟(1)得到的DNA片段和pUCm-T載體進行連接；(3)將步驟(2)所得連接產物轉化大腸桿菌DH5oc或JM109,篩選陽性克隆，即得所述前T載體。所述含有氨千青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質粒可為下列之一①pET28，②pET29。具體的，步驟(1)引物DNA片段的兩端各設計一個酶切位點CCANNNNN*NNNNTGG，上游的Xcml酶切序列的NH殳計為T，下游的義cwl酶切序列的1SP設計為A。優選的，步驟(1)以質粒pET28或pET39為模板DNA進行PCR擴增，引物序列為Ph5，XXXGGATCCAAGGGTATAATGGGCCTAACTACGGCTACACTA3，，P2:5，CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT3，，PCR反應條件94。C預變性3分鐘，94。C變性30s，45。C退火30s，72。C延伸90s,三個循環；然后94。C變性30s，72。C延伸90s，27個循環。本發明還涉及所述的前T載體在制備用于快速克隆PCR產物的T載體中的應用。具體的，所述T載體制備方法如下抽提前T載體的DNA，用限制性內切酶ZcmI酶切后，0.8%1%瓊脂糖電泳分離載體DNA片段和含有抗性基因的DNA片段，回收大片段DNA，即為所述用于快速克隆PCR產物的T載體。本發明的有益效果主要體現在用本發明前T載體制備得到的載體可用于快速克隆PCR產物，篩選陽性克隆過程中不需要^f吏用X-gal。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此(實施例中所用試劑、質粒、酶、引物等，均購自上海生工生物工程技術服務有限公司)實施例1:酶切盒的構建以pET28(或pET39也可)為模板，利用下列兩條引物啦文PCR反應Pl(正向)5，XXXGGATCCAAGGGTATAATGGGCCTAACTACGGCTACACTA3'P2(反向)5，CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT3,反應參凄t如下94。C預變性3分鐘，94。C變性30s，45。C退火30s，72。C延伸90s，三個循環；然后94。C變性30s，72。C延伸90s，27個循環酶..7J2《PlusDNApolymerase實施例2:前T載體的制備實施例1的PCR產物與市場上供應的pUCm-T載體連接，連接體系如下PCR產物luLpUCm國TluL10xT4DNAligasebuffer3uLT4DNAligaseluLddH2024uL至總體積30uL14-16。C連接10小時以上，轉化￡."http://01150((或JM109也可)。實施例3:T載體的制備堿-SDS法抽提實施例2的陽性轉化子質粒，經質粒DNA回收試劑盒純化，用IcwI酶切，酶切體系如下質粒2uL10xNEBbuffer2uL(5u/uL)0.5uLddH20至總體積20uL37。C酶切反應2h以上，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離載體DNA片段和含有卡那抗性基因的DNA片段，切膠回收大片段的DNA，即得到用于快速克隆目的PCR產物的T載體。實施例4:PCR產物的克隆及陽性克隆的篩選用％《PlusDNApolymerase做PCR擴增目的DNA片段，將實施例3的T載體與目的基因連接，轉化于含氨千青霉素的平板，次日將轉化子影印于卡那平板。能在氨芐抗性平板生長，不能在卡那抗性平板生長的轉化子為含有外源基因片段的陽性克隆。權利要求1.一種前T載體，由以下方法制備得到(1)以含有氨芐青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質粒為模板進行PCR擴增，在引物的5’末端引入XcmI酶切位點，擴增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表達調控序列、兩端含有XcmI酶切位點的DNA片段；(2)用T4DNA連接酶將步驟(1)得到的DNA片段和T載體進行連接；(3)將步驟(2)所得連接產物轉化大腸桿菌DH5α或JM109，篩選陽性克隆，即得所述前T載體。2.制備如權利要求1所述的前T載體的方法，其特征在于所述方法如下(1)以含有氨節青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質粒為模板進行PCR擴增，在引物的5，末端引入Xcml酶切位點，擴增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表達調控序列、兩端含有Zcml酶切位點的DNA片段；(2)利用重疊延伸拼接技術，將步驟(1)得到的DNA片段和T載體進行連接；(3)將步驟(2)所得連接產物轉化大腸桿菌DH5oc或JM109，篩選陽性克隆，即得所述前T載體。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述含有氨芐青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質粒為下列之一①pET28，②pET29。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)引物DNA片段的兩端各設計一個義cml酶切位點CCANNNNN*NNNNTGG,上游的酶切序列的N4殳計為T,下游的Xcwl酶切序列的>1*設計為A。5.如權利要求4所述的方法，其特征在于步驟(1)以質粒pET28或pET39為模板DNA進行PCR擴增，引物序列為PI:5,XXXGGATCCAAGGGTATAATGGGCCTAACTACGGCTACACTA3'，P2:5，CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT3'，PCR反應條件94。C預變性3分鐘，94。C變性30s，45。C退火30s,72。C延伸90s，三個循環；然后94。C變性30s,72。C延伸90s，27個循環。6.如權利要求1所述的前T載體在制備用于快速克隆PCR產物的T載體中的應用。7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述T載體制備方法如下抽提前T載體的DNA，用限制性內切酶％cmI酶切后，0.8%1%瓊脂糖電泳分離載體DNA片段和含有抗性基因的DNA片段，回收大片段DNA，即為所述用于快速克隆PCR產物的T載體。全文摘要本發明提供了一種前T載體，由以下方法制備得到(1)以含有氨芐青霉素除外的大腸桿菌敏感的抗生素的抗性基因的質粒為模板進行PCR擴增，在引物的5’末端引入XcmI酶切位點，擴增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表達調控序列、兩端含有XcmI酶切位點的DNA片段；(2)用T<sub>4</sub>DNA連接酶將步驟(1)得到的DNA片段和pUCmT載體進行連接；(3)將步驟(2)所得連接產物轉化大腸桿菌DH5α或JM109，篩選陽性克隆，即得所述前T載體。本發明的有益效果主要體現在用本發明前T載體制備得到的載體可用于快速克隆PCR產物，篩選陽性克隆過程中不需要使用X-gal、陰性率低。文檔編號C12N15/63GK101333538SQ20071006981公開日2008年12月31日申請日期2007年6月29日優先權日2007年6月29日發明者于真真,任慧穎,楊丹燕,林陳水,明許申請人:浙江工業大學