專利名稱：一種黑麥1rs染色體特異的est-sts標記引物2、篩選方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2、 篩選方法及用途，屬于基因分子標記研究領域。
技術背景小麥是世界上重要的糧食作物之一，在生產中常常受到各種病害 的威脅，造成產量或品質的下降。小麥的近緣物種黑麥，具有抗病、 高產、耐瘠等許多優良性狀。研究表明黑麥1RS染色體上有抗白粉 病、抗條銹病、抗葉銹病、抗桿銹病、抗麥二叉蚜等眾多抗性基因， 還有提高產量和適應性的基因。通過遠緣雜交和染色體操作技術，可 將黑麥1RS染色體上的這些有益基因導入至普通小麥。黑麥1RS染色體或染色體片段導入普通小麥后，需要對其迸行 鑒定，才可有效利用1RS上的外源優異基因。建立在DNA序列基礎 上的分子標記，特別是以PCR為基礎的分子標記，以其準確、快捷、 不受植物生長時期限制等優點而被廣泛運用。Ko Jong-Min等篩選出 了兩個黑麥基因組特異的RAPD (Random amplified polymo卬hic DNA,隨機擴增的多態性DNA)標記，并獲得了兩個克隆pSclOC和 pSc20H,原位雜交結果顯示它們分布于所有黑麥染色體上(參考文 南犬Jong-Min Ko, Geum-Sook Do， Duck畫Yong Suh， et al. 2002. Identification and chromosomal orgnization of two rye genome-specifiRAPD products useflil as introgression markers in wheat. Genome, 45:157-164)。然而RAPD標記穩定性較差，難以在育種中有效利用。 M.Cristina Katto等根據pSc20H克隆設計了可以鑒定黑麥染色體片段 的以PCR為基礎的標記(參考文獻M.Cristina Katto， Takashi R. Endo,Shuhei Nasuda. 2004. A PCR-based marker for targeting for small rye segments in wheat background. Genes Genet. Syst" 79.p. 245-250)。劉成等篩選到黑麥特異的RAPD標記，并將其轉化為SCAR標記(參考 文獻劉成，李光蓉，楊足君，馮娟，周建平，任正隆.2006.黑麥基因 組特異DNA片段的分離與SCAR標記的建立.西北植物學報,26(12): 2434-2438)。然而這些標記對黑麥全基因組均有擴增，不是1R或IRS染色體特異的，從而無法將黑麥的1R染色體與2R 7R染色體區分 開。Koebner等根據黑麥與小麥rRNA基因間隔區序列差異，合成了 黑麥IR染色體特異引物NOR-Rl，可以鑒定1RS染色體，但對不含 有1R染色體上核仁組織區的重組材料用引物NOR-R1將無法鑒定 (參考文南犬Koebner R. M. D. 1995. Generation of PCR-based markers for the detection of rye chromatin in wheat background. Theor Appl Genet, 90: 740-745)。EST (expressed sequence tag,表達序列標簽)是指從不同組織來 源的cDNA文庫中隨機挑選克隆，并對其3'端或5'端迸行單輪測序 所獲得的短cDNA序列(參考文獻Adams M D， Kelley J M， Gocayne J D, Dubnick M， Polymeropoulos M H. 1991. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science:252:1651-1656)。由于EST標記直接來源于cDNA,其保守性較高， 特別是在親緣物種之間具有相對的保守性，所以根據EST所開發的 STS標記(Site tagged sequence,位點標簽序列，即直接在EST序列 兩端設廿引物)在物種之間具有較好的通用性(參考文獻:LaRotaM, Sorrells M E. 2004. Comparative DNA sequence analysis of mapped wheat ESTs reveals the complexity of genome relationships between wheat and rice. Funct Integr Genomics, 4: 34~46)。比較基因組學石開究 表明普通小麥及其近緣物種之間存在共線性，因此可以利用小麥上已 開發的EST序列來研究小麥的親緣物種。 發明內容本發明利用黑麥屬與小麥屬(7H"c)同屬于小麥亞族 (7h力'"Vwe)，理論上它們具有較高的共線性關系，定位于小麥第一部 分同源群上的EST序列很可能也存在于黑麥1R染色體的相應部位， 因此設廿以PCR為基礎的標記，轉化成STS引物，篩選黑麥IRS染 色體特異的分子標記，以快速檢測和追蹤導入普通小麥背景中的黑麥 IRS染色體。本發明的技術方案是通過如下手段實現的這種黑麥IRS染色 體特異的EST-STS標記引物2，其特征在于該標記引物是根據小麥 第一部分同源群的EST序列一 BE443401為模板設廿而得到的，其 序列為STS, : F: 5，- GCATCTGCCAACACTCTCAA - 3，，
R: 5 ，- ACGGCAGCATGTAGAGACAA - 3' 。所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2，其特征在于 引物STS目擴增出的兩條大小為1680bp和1750bp的特異片段位于 黑麥1RS染色體上。所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2的篩選方法， 其特征包括如下步驟a、 引物的設計與合成根據小麥第一部分同源群的EST序列， 選取35個堿基數大于300bp的EST序列進行下載，利用Primer Premier5.0軟件設廿了35對引物，條件為退火溫度50-60°C,引物的 長度18-22bp, GC。/o含量為40-60%，預期擴增產物300-600bp ;合成 的引物用超純水溶解至20^imolL-l作為母液于-20。C冰箱保存，使用 前吸取部分母液用10mM Tris - HC1與lmM EDTA稀釋至2pmo1 /L 作為工作液待用；b、 黑麥染色體特異標記引物的篩選利用步驟a設計合成的35 對EST-STS引物，分別對普通小麥中國春；小麥近緣物種帝國黑麥、 簇毛麥、大麥和鵝觀草的基因組DNA進行多態性擴增分析，結果引 物STSWE3(序列為STSwe3F: 5，- GCATCTGCCAACACTCTCAA- 3， 和STSwe3R: 5，- ACGGCAGCATGTAGAGACAA - 3，)在帝國黑麥中 擴增出大小為1680bp和1750bp的特異帶，從而篩選出黑麥染色體組 特異的EST-STS標記引物；c、 黑麥1R染色體特異標記引物的篩選利用步驟b中篩選到的
多態性EST-STS引物，分別對普通小麥中國舂和一整套中國春-帝國黑麥的二體附加系進行擴增分析，結果在帝國黑麥與中國春-帝國黑 麥1R二體異附加系中分別擴增出大小為1680bp和1750bp的特異帶，確定黑麥1R染色體特異標記引物；d、黑麥1RS染色體特異標記引物的篩選利用步驟b中篩選到 的多態性EST-STS引物，分別對普通小麥小偃6號、帝國黑麥、普 通小麥銘賢169和小麥/黑麥1BL/1RS易位系洛夫林10、洛夫林13 進行擴增分析，結果洛夫林10、洛夫林13和帝國黑麥能擴增大小為 1680bp和1750bp的特異帶，確定黑麥1RS染色體特異標記引物STSwE3 °所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物的篩選方法，步驟b 所述擴增分析包括在體積為0.2mL的Eppendof管中依次加入約 10 20ng的模板DNA, 1xPCR buffer, 1.5mmol I/1 MgCl2, 200mmol L-1 dNTP，左右引物終濃度各為0.2^imo1 L'1, 0.5U Taq DNA聚合酶，最 后用無菌蒸餾水補充反應體系至10liL ;然后將有上述反應液的 Eppendofl放置在PE2700基因擴增儀上迸行擴增反應；擴增反應程序 為先94。C預變性3分；再94。C變性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸l 分20秒，循環32次；72。C延伸10分；最后1(TC保存；擴增反應結束后對PCR擴增產物進行電泳檢測，結果引物STSwe3 在帝國黑麥中擴增出大小為1680bp和1750bp的特異帶，而無黑麥基因組的中國春、大麥、簇毛麥和鵝觀草沒有擴增出這兩條帶,確定STSwE3就是黑麥染色體組特異的標記。 所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2的篩選方法，所述 PCR擴增產物逬行電泳檢測步驟為在PCR擴增產物中加入指示剤 2 )iL,混勻，取其中3 ^用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電 泳電壓為150 180 V，電泳1.5h后，用銀染法迸行染色，最后將染色 后的膠在凝膠成像儀上觀測照相。所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2的用途，其特 征在于使用標記引物擴增分析1RS易位材料，能夠同吋擴增出兩 條大小為1680bp和1750bp特異帶的材料，即可確定含有黑麥1RS 染色體。本發明與已有技術相比較的優點是1 、本發明的黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物不僅拓寬 了小麥EST的使用范圍，同吋為深入研究普通小麥遠緣雜種材料提 供了新的工具。2、本發明的黑麥1RS染色體特舁的EST-STS標記引物利用普通 PCR技術就可以進行，不需要其他繁瑣的程序，可以簡單、快速地鑒 定黑麥1RS染色體。3 、本發明的黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物與模板的 結合能力較強，雖然本研究所使用的退火溫度為55°C,但退火溫度 在51-58。C均能較好地擴增出目標片段，實驗條件要求比較寬松。4 、本發明的黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物序列位于 小麥IBS染色體中部區域，根據比較基因組學的原理，該標記也應
該位于1RS染色體中部區域，因此可以結合其它1RS染色體的特異標記鑒定涉及IRS不同斷點的材料。
圖1 : BE443401的序列以及本發明STSWE3的正向引物和反向引 物的反向互補序列在EST序列上的位置。圖2 :用本發明設廿合成的35對EST-STS引物分別對普通小麥中國春；小麥近緣物種帝國黑麥、簇毛麥、大麥和鵝觀草的基因組 DNA進行多態性擴增分析，結果只有引物STSwE3在帝國黑麥中擴增 出大小為1680bp和1750bp的帶，而中國春、大麥、簇毛麥和鵝觀草沒有擴增出這兩條帶，說明STSwE3是黑麥染色體組特異的標記。圖3 :用普通小麥中國舂、帝國黑麥及一整套中國舂-帝國黑麥 1R 7R 二體異附加系共9個材料的DNA為模板，用本發明的引物 STSwE3進行PCR擴增，結果顯示只有附加1R染色體的材料能擴增 出與帝國黑麥一樣的大小為1680bp和1750bp的特異帶，而對照中國 春和2R 7R異附加系沒有擴增出這兩條特異帶，說明這兩條帶位于 黑麥1R染色體上。圖4 :用普通小麥小偃6號、帝國黑麥、普通小麥銘賢169、小 麥/黑麥1BL/1RS易位系洛夫林10和洛夫林13共5個材料的DNA 為模板，用本發明的引物STSwE3迸行PCR擴增，結果顯示只有洛夫 林10和洛夫林13能擴增出與帝國黑麥一樣的大小為1680bp和 1750bp的特異帶，說明這兩條帶位于黑麥1RS染色體上。
圖5 :用普通小麥小偃6號與"德國白粒"黑麥雜交后代選育的11個材料的DNA為模板，用本發明的引物STSwE3迸行PCR擴增， 其中4個含有1RS染色體的后代材料均擴增出1680bp和1750bp的特異帶,7個不含有黑麥1RS染色體的材料沒有擴增出相應的特異帶。 圖示1 11為小偃6號與"德國白粒"黑麥雜交后代材料，M為分子 量標記DL2000 。
具體實施方式
實施例l 、引物的設廿與篩選1 、 EST序列的獲得根據美國農業部網站 (http:〃wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml )發布的小麥表達序列標 簽(EST)數據庫，查找定位于小麥第一部分同源群不同物理區段的 EST及其序列，選取35個保守性比較強的且堿基數大于300bp的EST 序列進行下載。附圖1是其中一個EST —BE443401的堿基序列。2、引物的設廿與合成將步驟1中下載的EST序列，利用Primer Premier 5.0軟件對其進行引物的設廿，共設廿了35對引物。引物設 廿的條件為退火溫度50-60°C，引物的長度18-22bp， GCy。含量(鳥 嘌Guanine和胞嘧啶Cytosine占堿基總數的比例)為40-60%,預期 擴增產物300-600bp。設廿的引物由上海聯合基因有限公司合成。3 、引物的稀釋將步驟2中合成的引物，用超純水溶解至20|_imol L"作為母液于-20。C冰箱保存，使用前吸取部分母液用lxT.E (10mM Tris-HCl與ImM EDTA PH = 8.0)稀釋至2pmo1 L'1作為工作液待用。4、黑麥特異標記的篩選如果某個引物在黑麥中擴增出與其他供試材料有差異的帶，那么這個引物就是篩選出的黑麥染色體組的特 異的引物。利用步驟3中稀釋好的35對EST-STS引物，分別對普通小麥中 國春；小麥近緣物種帝國黑麥、簇毛麥、大麥和鵝觀草的基因組DNA 進行多態性擴增分析，具體擴增如下在體積為0.2mL的Eppendof 管中依次加入約10 20ng的模板DNA, lxPCR buffer, 1.5mmol L" MgCl2，200mmol I/1 dNTP,左右引物終濃度各為0.2^mol L",0.5U &《 DNA聚合酶，最后用無菌蒸餾水補充反應體系至10pL。然后將有上 述反應液的Eppendof管放置在PE2700基因擴增儀上進行擴增反應。 擴增反應程序為先94。C預變性3分；再94。C變性30秒，55。C退火 30秒，72。C延伸1分20秒，循環32次；72。C延伸10分；最后10°C 保存。PCR擴增產物檢測方法為在PCR擴增產物中加入指示剤 (0.25%溴酚藍、0.25%甲基綠、40%蔗糖，水余量)2jiL，混勻，取 其中3 jiL用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(聚丙烯酰胺N,N'-甲叉雙 丙烯酰胺=39:1)電泳檢測，電泳電壓為150-180 V,電泳1.5 h左 右后，用銀染法進行染色，最后將染色后的膠在凝膠成像儀上觀測照 相。結果引物 STSWE3 (序列為STSWE3F: 5，-GCATCTGCCAACACTCTCAA - 3，禾0 STS鶴R: 5，-ACGGCAGCATGTAGAGACAA - 3')在帝國黑麥中擴增出大小為 1680bp和1750bp的帶，而中國春、大麥、簇毛麥和鵝觀草沒有擴增
出這兩條帶，如圖2所示，說明STSwE3就是黑麥染色體組特異的標 記引物。
5 、黑麥1RS染色體特異標記的篩選
利用步驟4篩選到的多態性EST-STS引物STSWE3，對中國舂和 一整套中國春-帝國黑麥的二體異附加系(公知公用，參考文獻: Driscoll C J, Sears E R, 1971. Individual additions of the chromosomes of "Imperial" rye to wheat. Agron Abstr， 1971:6)進行PCR擴增反應， 反應條件與擴增程序同步驟4 。 PCR擴增反應后對擴增產物進行電泳 檢測，檢測方法同步驟4，檢測后確定引物STSwe3在帝國黒麥及中 國舂-帝國黑麥1R 二體異附加系中分別擴增出大小為1680bp和 1750bp的特異帶，而對照中國舂與中國春-帝國黑麥2R m 二體異附 加系均沒有擴增出這兩條相應的特異帶，如圖3所示，說明這個標記 為黑麥1R染色體特異標記。
然后利用引物STSwE3擴增普通小麥小偃6號、帝國黑麥、普通 小麥銘賢169、小麥/黑麥1BL/1RS易位系洛夫林IO和洛夫林13，反 應條件與擴增程序同步驟4 。PCR擴增反應后對擴增產物用進行電泳 檢測，檢測方法同步驟4 ,結果顯示只有1BL/1RS易位系洛夫林10、 1BL/1RS易位系洛夫林13和帝國黑麥能擴增出大小為1680bp和 1750bp的特異帶，如圖4所示，說明這兩個擴增位點位于黑麥1RS 染色體上，引物STSwe3為黑麥1RS染色體的特異標記。因其擴增出 兩條特異帶，故命名為黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2。
實施例2、本發明的標記引物在1RS易位材料中的檢測應用
利用實施例1中篩選到的黑麥1RS染色體特異的標記引物 STSWE3,擴增小偃6號和::德國白粒二黑麥OS. cewa/e丄.cv gerwa"
雜交的部分后代材料，反應條件與擴增程序同步驟4 ,擴增反應后對 擴增產物進行檢測，檢測方法同步驟4 ,結果在供試的ll個材料中， 4個材料擴增出大小為1680bp和1750bp的特異帶，即可確定含有黑 麥1RS染色體。其它7個材料沒有擴增出這兩條相應的特異帶，即 可確定其不含有黑麥1RS染色體，如圖5所示。此結果與基因組原 位雜交鑒定結果一致。
本發明列舉的實施旨在更進一步地闡明這種黑麥1RS染色體特 異的EST-STS標記引物、篩選方法及用途。而不對本發明的范圍構 成任何限制。
權利要求
1.一種黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2，其特征在于該標記引物是根據小麥第一部分同源群的EST序列-BE443401為模板設計而得到的，其序列為STSWE3F5’-GCATCTGCCAACACTCTCAA-3’，R5’-ACGGCAGCATGTAGAGACAA-3’。
2 、根據權利要求1所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引 物，其特征在于引物STSwE3擴增出兩條的大小為1680bp和1750bp 的特異片段位于黑麥1RS染色體上。
3 、根據權利要求1所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引 物2的篩選方法，其特征包括如下步驟a、 引物的設計與合成根據小麥第一部分同源群的EST序列， 選取35個堿基數大于300bp的EST序列進行下載，利用Primer Premier5.0軟件設廿了35對引物，條件為退火溫度50-6CTC ,引物的 長度18-22bp， GC。/。含量為40-60%,預期擴增產物300-600bp ;合成 的引物用超純水溶解至20nmolL-l作為母液于-2(TC冰箱中保存，使 用前吸取部分母液用10mM Tris - HC1與imM EDTA稀釋到2pmo1 /L 作為工作液待用；b、 黑麥染色體特異標記引物的篩選利用步驟a設計合成的35 對EST-STS引物，分別對普通小麥中國舂；小麥近緣物種帝國黑麥、簇毛麥、大麥和鵝觀草的基因組DNA進行多態性擴增分析，結果引 物STSWE3 (序列為STSWE3F: 5，- GCATCTGCCAACACTCTCAA-3，和STSwe3R: 5，-ACGGCAGCATGTAGAGACAA - 3，)在帝國黑 麥中擴增出大小為1680bp和1750bp的特異帶，從而篩選出黑麥染色 體組特舁的EST-STS標記引物；c、 黑麥1R染色體特異標記引物的篩選利用步驟b中篩選到的 多態性EST-STS引物，分別對中國舂和一整套中國春-帝國黑麥的二 體附加系進行擴增分析，結果在帝國黑麥及中國舂-帝國黑麥1R二體 異附加系中分別擴增出大小為1680bp和1750bp的特異帶，確定黑麥 1R染色體特異標記引物；d、 黑麥1RS染色體特異標記引物的篩選利用步驟b中篩選到 的多態性EST-STS引物，分別對普通小麥小偃6號、帝國黑麥、普 通小麥銘賢169和小麥/黑麥1BL/1RS易位系洛夫林10、洛夫林13 進行擴增分析，結果洛夫林10、洛夫林13和帝國黑麥能擴增出大小 為1680bp和1750bp的特異帶，確定黑麥1RS染色體特異標記引物STSwE3 。
4 、根據權利要求1所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2 的篩選方法，其特征在于步驟b所述擴增分析包括在體積為0.2mL 的Eppendof管中依次加入約10 20ng的模板DNA, 1 xPCR buffer, 1.5mmolL"MgCl2， 200mmol L'1 dNTP,左右引物終濃度各為0.2fimo1 L/1, 0.5UTaqDNA聚合酶，最后用無菌蒸餾水補充反應體系至10nL ; 然后將有上述反應液的Eppendom放置在PE2700基因擴增儀上迸行擴增反應；擴增反應程序為先94'C預變性3分；再9fC變性30秒， 55。C退火30秒，72。C延伸l分20秒，循環32次；72。C延伸10分；最后 IO'C保存；擴增反應結束后對PCR擴增產物進行電泳檢測，結果引物STSwE3 在帝國黑麥中擴增出大小為1680bp和1750bp的特異帶，而無黑麥基因組的中國春、大麥、簇毛麥和鵝觀草沒有擴增出這兩條帶，確定STSwE3就是黑麥染色體組特異的標記。
5、 根據權利要求4所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2的篩選方法，其特征在于所述PCR擴增產物進行電泳檢測步驟為 在PCR擴增產物中加入指示齊U2jiL，混勻，取其中3^用8%非變性 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳電壓為150 180 V，電泳1.5h后，用 銀染法進行染色，最后將染色后的膠于凝膠成像儀上觀測照相。
6、 根據杈利要求1所述黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引 物2的用途，其特征在于使用標記引物擴增分析1RS易位材料， 能夠同時擴增出兩條大小為1680bp和1750bp特異帶的材料，即可確 定含有黑麥1RS染色體。
全文摘要
本發明提供一種黑麥1RS染色體特異的EST-STS標記引物2，其特征在于該標記引物是根據小麥第一部分同源群的EST序列一BE443401為模板設計而得到的，其序列為STS<sub>WE3</sub>F5’-GCATCTGCCAACACTCTCAA-3’，STS<sub>WE3</sub>R5’-ACGGCAGCATGTAGAGACAA-3’。引物STS<sub>WE3</sub>擴增出的兩條大小為1680bp和1750bp的特異片段位于黑麥1RS染色體上。本發明的標記引物不僅拓寬了小麥EST的使用范圍，同時為深人研究普通小麥遠緣雜種材料提供了新的工具，利用普通PCR技術就可以進行，不需要其他繁瑣的程序，可以簡單、快速地鑒定黑麥1RS染色體。
文檔編號C12Q1/68GK101165194SQ200710139509
公開日2008年4月23日 申請日期2007年9月28日 優先權日2007年9月28日
發明者安調過, 王春梅, 強 高 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所