專利名稱：在含有細胞的復合生物基質中測量瞬時蛋白水解活性濃度的方法
在含有細胞的復合生物基質中測量瞬時蛋白水解活性濃度的方法 發明領域
本發明屬于診斷學領域，更具體涉及實時監測瞬時出現在血液或 其他體液中的生物活性酶類濃度過程的方法，以及用于該方法的試劑。
背景技術：
在體液中存在幾種生理學上重要的生物化學系統，通過活化和隨 后滅活蛋白水解酶類起作用，例如在血液中的凝血系統、纖維蛋白溶 解系統和補體系統，以及在胃腸液中的消化酶類。為了評價這些系統 的生物學功能，實時追蹤這些蛋白水解活性的過程是重要的。這類功 能評價對于診斷至關重要，因為所述系統的紊亂可能導致致命的疾病， 如冠脈梗塞、中風或致命的出血(凝血和纖維蛋白溶解)、全身感染 和自體免疫疾病(補體系統)或食物吸收失常(胃腸液)。
在根據現有技術測定血漿或富含血小板的血漿中凝血酶產生的方 法中，血漿在幾分鐘后就變為凝膠態。這源于纖維蛋白原轉變成不溶 性纖維蛋白。該纖維蛋白聚合，從而形成纖維蛋白網，其事實上成為 真正的血塊。該血塊類似于含有流體(即血漿或血清)的海綿，其中 產生凝血酶。在這種凝血酶產生過程中，信號底物轉變為產生信號的 離去基團。由于凝膠是相對透明的，可以實時記錄凝固血漿中的熒光 信號。然而，在用全血測量的情況下，信號量顯著下降(通常低于在
透明血槳中測得量的5%)，并且紅細胞的任何活動都非常影響該信號。 所形成的纖維蛋白網(凝膠)捕獲紅細胞，過一會兒出現"血塊收縮"， 導致凝膠的不均一性，從而將凝膠內部捕獲的流體和纖維蛋白網外部 存在的流體分離開。按照"海綿狀網"的圖像，血塊收縮導致類似于部分 海綿體被擠出的情況。這對于信號的這種影響，使得測量幾乎是不可能的。
WO 03/093831描述了一種在血漿或富含血小板的血漿中實時測 量凝血酶活性的適當技術。該技術包括向所述生物基質中加入信號底 物。蛋白水解酶能夠轉化該底物，該底物的離去基團可通過適當的技 術測量。這可以是熒光、光密度、NMR測量等，其選擇主要取決于信 號的性質。當使用熒光時，那么原則上可能在混濁的溶液中測量，例 如富含血小板的血漿或含有纖維蛋白的血漿。同樣，在全血，即含有 血小板、血白細胞和紅細胞的血漿中測量也是可能的。然而，血紅細 胞的存在對于信號有很大的干擾影響。
因此，仍然需要一種在全血中以可靠和簡單的方式實時測量凝血 酶產生的方法。本發明提供了這一方法。
發明概述
我們現在出乎意料地發現當在頻繁混合的條件下，在凝血或血漿 中基本上按照WO 03/093831中所述進行蛋白水解活性特別是凝血酶活 性的測量時，血塊不會形成為凝膠，而是形成致密得多的凝塊，基本 上將所有的流體都留在纖維蛋白網以外。
因此，本發明的一個方面提供了實時測定凝血或血漿或其他體液 樣本中的蛋白水解活性、尤其是凝血酶活性從樣本中出現和消失的過 程的方法，其包括以下步驟
a)向所述樣本中加入信號底物，所述信號底物引起可檢測的信號， 所述信號與產生的蛋白水解活性經反應形成的轉化產物的量相關；
bl)實時監測所述樣本中該信號的發展，提供曲線；以及
cl)頻繁混合所述樣本，從而以致密的方式發生血塊形成，致使樣
本的大部分保持流體，并抑制細胞沉淀，
其中重復并以交替的方式進行所述步驟bl)和cl)。
6在一個特別和優選的實施方案中，所述方法包括以下額外和可選 擇的步驟
d) 在第二個沒有觸發蛋白水解活性的平行樣本中，加入對步驟a) 中所定義的信號底物具有常數已知(constant know)的穩定蛋白水解活 性、但在其他方面惰性的物質；
e) 在步驟d)中加入步驟a)所定義的同樣信號底物，所述信號底物 通過與已知具有穩定的蛋白水解活性的物質反應，引起可檢測信號；
b2)測定所述第一樣本和所述第二平行樣本中信號發展的時間過 程，以提供它們各自的曲線；
f) 比較所述曲線，得出第一樣本中實時蛋白水解活性過程，以及 c2)頻繁混合第一和第二樣本，使得在所述第一樣本中以致密方式
發生血塊形成，致使所述第一樣本的大部分保持為流體，并抑制每個 樣本中的細胞沉淀，
其中重復并以交替的方式進行所述步驟b2)和c2)。
在本發明的另一個方面，提供了實施本發明方法的試劑盒。
這些和其他方面將在下文中進行更詳細的描述。
附圖
簡述
圖l是一張圖片，攝自在血塊形成過程中頻繁混合的96孔板的選 出部分(上圖)，和另一塊未混合的96孔板。在上圖中可看出，每個 孔中均形成了致密的血塊。在下圖中，透明的血槳已變為渾濁的凝膠。 混合通過每20秒重復回轉式振動(orbital shake) 5秒而進行。該圖顯 示了當使用全血時也將發生所設想的狀況的例子在振動條件下血塊 更致密。
圖2是在全血中測量凝血酶產生的典型例子。反應混合物含有來 自健康志愿者的全血、以及0.5 pM組織因子、熒光底物(400 ZGGR-AMC)和氯化鈣。熒光在96孔板熒光計上測量，從該信號計算 實時凝血酶。圖3顯示了凝血酶校準劑曲線的起始速率(熒光單位/分)與紅細
胞壓積之間的關系。凝血酶校準劑是凝血酶與a2-巨球蛋白(a2-M)的復 合物，其能夠轉化熒光底物(ZGGR-AMC)，但不被凝血酶的原漿抑制劑 (例如抗纖維蛋白酶)所抑制，并且其不參與凝血過程。所述凝血酶校 準劑轉化底物，測定的熒光基團產生熒光信號，在熒光計中測量。盡 管在所有樣本中的活性量相同，但由于紅細胞壓積(細胞體積和全血 總體積的比例)導致起始速率不同。由于供體和供體之間的紅細胞壓 積差別很大，凝血酶校準劑的起始速率可用于校準這些差別。
發明詳述
本文中所使用的"頻繁混合條件"，我們的意思是移動發生反應的 容器或容器內的流體，使得所述流體和流體中的非流體物質例如細胞 變得更為均勻地分散。很明顯，基本均勻分散將是優選的條件。例如， 通過將發生凝血酶產生的容器進行回轉式振動，血塊不會形成為凝膠， 而是形成為致密得多的血塊，從而基本上將所有的流體留在在網狀結 構之外。這同樣可通過旋轉液體中的磁力攪拌器或本領域普通技術人 員已知的其他類型攪拌器來達到。結果是，血塊收縮對信號的破壞性 影響不再存在。
發生凝血酶產生的容器，通常為比色皿，常規是透明的，放置于 控溫的儀器中，所述儀器能夠記錄底物轉化產生的信號。當從容器或 比色皿的頂部或底部進行熒光測量時，則血紅細胞的沉淀將會對信號 造成附加的干擾效應。從容器的側面而不是從底部或頂部測量會降低 沉淀的影響。或者，可通過重復混合防止沉淀，使得在血塊形成之后 或期間，流體內的沉淀性細胞再次懸上來。例如，在一秒內重復測量 熒光信號，然后各自進行數秒回轉式振動，足以進行全血中的凝血酶 測定。信號量顯著下降的缺點可通過選擇熒光探針的最佳波長并結合 接收所述熒光信號的光學系統的有利放置得以部分克服。
重復并以交替的方式監測待測樣本中實時信號發展和混合樣本，直到測定完成。整個測量通常需要約10-90分鐘。交替執行混合與測量
的頻率通常達到約每分鐘3-8次。每次混合通常需花約3-5秒。每次測 量通常為10-80毫秒。所述方法在本領域技術人員閱讀本說明書后將是 完全清楚的。更多的細節可來源于尤其是WO 03/093831，其引入本文 用作參考。 --
盡管本發明的方法尤其適用于在凝血或富含血小板的血漿、貧血 小板或無血小板血漿中實時測定蛋白水解活性、尤其是凝血酶活性的 過程，但其同樣可用于其他可能顯示凝固活性的體液中，例如唾液、 血清、尿液、腦脊液、精液和糞便。
本發明還提供了一種用于實施前述方法的試劑盒，所述試劑盒在
適當的容器或其他常規包裝工具中便利地包括下列成分 -已知濃度的(X2M-凝血酶復合物； -已知濃度的凝血酶；；
-含有所用信號底物的離去基團的溶液，所述離去基團能夠產生
信號，該信號可由已知的技術測量，例如熒光、光密度、NMR等；
-觸發試劑，其含有促凝血酶原激酶、組織因子、鞣花酸或高嶺
土，以啟動凝固反應；
-有助于說明凝血酶濃度過程的添加劑，特別是當止血-血栓形成 系統出現或預計出現特定異常時。適當的添加劑有，例如，血栓調節
蛋白或活化的蛋白C，其尤其適用于診斷因子VLeiden，或者是特異性 抗血栓或抗血小板藥物；
-含有信號底物的試劑；
-可直接裝載到計算機內存中的軟件程序，所述程序在計算機上 運行，用于計算由上述定義的方法測量的凝血酶活性曲線； -指導手冊。
所述試劑盒可以適當包含冷凍干燥的試劑。本發明通過以下實施例進一步說明，但是，并不表示在任何方面限制本發明的范圍。
試驗
a. 無內校準試驗的典型建立
通常，試驗按如下進行。將觸發試劑(20pL)加入96孔板的孔中。所述觸發試劑含有低濃度的組織因子(通常終濃度在0.5-20 pM之間)。加入校檬酸化的全血，通常為50-150pL，在本實施例中為80pL，最后在添加熒光底物(例如Z-GGR-AMC)和氯化鈣的混合物(通常分別為200-600,，終濃度為14-17 mM，本例中分別為400pM和16.7 mM)后開始反應。幾分鐘后(滯后時間)開始產生凝血酶，濃度上升直至達到峰值，然后再次下降。典型的曲線見圖2。盡管推薦對信號進行額外的校正，以正確計算凝血酶的實時濃度，但實時跟蹤的熒光的一階導數(例如在355 nm激發波長和460 nm發射波長處測量)是合理測量的實時凝血酶量。這些校正的性質是本領域技術人員公知的，因此校正的方法不需要在這里詳述。
b. 有內校準試驗的典型建立
將全血樣本分成兩份，樣本A和樣本B。將樣本A加入到含觸發劑(稀釋的組織因子)的96孔板的孔中，樣本B加入到含有校準量的a2-巨球蛋白-凝血酶復合物的孔中。該復合物具有酰胺水解活性，但不能被血漿抑制劑所抑制。在兩個孔中均加入熒光底物，樣本A將產生凝血酶而樣本B則不會(凝血酶產生被抑制，或檸檬酸化的樣本未被再次鈣化)。根據樣本B中通過校準量的a2-巨球蛋白-凝血酶轉化底物產生的熒光，可計算樣本A中凝血酶的實時濃度。
權利要求
1. 一種實時測定凝血或血漿樣本中的蛋白水解活性、尤其是凝血酶活性從樣本中出現和消失的過程的方法，包括以下步驟a)向所述樣本中加入信號底物，所述信號底物引起可檢測的信號，所述信號與產生的蛋白水解活性經反應形成的轉化產物的量相關，b1)實時監測所述樣本中該信號的發展，提供曲線，以及c1)頻繁混合所述樣本，從而以致密的方式發生血塊形成，致使樣本的大部分保持流體，并抑制細胞沉淀，其中重復并以交替的方式進行所述步驟b1)和c1)。
2. 權利要求l的方法，包括下列額外和可選擇的步驟d) 在沒有觸發蛋白水解活性的第二個平行樣本中，加入對步驟a)中所定義的信號底物具有常數已知的穩定蛋白水解活性、但在其他方面惰性的物質；e) 在步驟d)中加入步驟a)所定義的同樣信號底物，所述信號底物 通過與已知具有穩定的蛋白水解活性的物質反應，引起可檢測信號；b2)測定所述第一樣本和所述第二平行樣本中信號發展的時間過 程，以提供它們各自的曲線；f) 比較所述曲線，得出第一樣本中實時蛋白水解活性的過程，以及c2)頻繁混合第一和第二樣本，從而在所述第一樣本中以致密方式 發生血塊形成，致使所述第一樣本的大部分保持為流體，并抑制每個 樣本中的細胞沉淀，其中重復并以交替的方式進行所述步驟b2)和c2)。
3. 權利要求1或權利要求2的方法，其中所述蛋白水解活性選自 活化的凝血因子活性包括凝血酶，活化的纖維蛋白溶解因子活性以及 補體系統活性的活化成分。
4. 權利要求l-3任一項的方法，其中所述信號底物選自包含離去 基團的化合物，所述離去基團通過形成的蛋白水解酶反應，給出可檢 測的轉化產物。
5. 權利要求4的方法，其中所述信號底物為2-0^0^-Arg-AMC。
6. 權利要求4的方法，其中可檢測的轉化產物通過光譜學尤其是 熒光、光密度或NMR測定。
7. 權利要求4-6任一項的方法，其中所述離去基團是熒光基團、 發色基團或釋放氫離子的基團。
8. 前述權利要求任一項的方法，其中可檢測的轉化產物為對硝基 苯胺或7-氨基-4-甲基-香豆素。
9. 前述權利要求任一項的方法，其中具有常數已知的穩定蛋白水解活性的物質選自012-巨球蛋白-凝血酶復合物、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復合物以及Y凝血酶。
10. 前述權利要求任一項的方法，其中在加入信號底物之前向所 述第一樣本中加入蛋白酶活化劑。
11. 權利要求10的方法，其中所述蛋白酶活化劑選自鈣離子、磷 脂、組織因子、可溶性組織因子、促凝血酶原激酶、高嶺土和鞣花酸。
12. 前述權利要求任一項的方法，其中所述第一生物樣本還包括 在研究中要檢驗其對蛋白水解系統的影響的藥劑。
13. 權利要求12的方法，其中所述蛋白水解系統是止血-血栓形成系統。
14. 權利要求12或13的方法，其中所述藥劑為抗血栓形成劑， 例如抗血小板劑或抗凝血劑。
15. 權利要求14的方法，其中抗血栓形成劑選自肝素，硫酸皮膚素，直接的凝血酶抑制劑例如水蛭素、阿戈托班或美拉加群，以及因子Xa抑制劑例如蜱抗凝蛋白，蛋白C途徑活化劑例如血栓調節蛋白或 激活的蛋白C。
16. 實施權利要求1-15任一項所述方法的試劑盒，其包含以下成分-已知濃度的0t2M-凝血酶復合物； -己知濃度的凝血酶；；-含有所用信號底物的離去基團的溶液，所述離去基團能夠產生信號，該信號可由已知的技術例如熒光、光密度、NMR等測量；-觸發試劑，其含有促凝血酶原激酶、組織因子、鞣花酸或高嶺土，以啟動凝固反應；-有助于說明凝血酶濃度過程的添加劑，特別是當止血-血栓形成 系統出現或預計出現特定異常時。適當的添加劑是，例如，血栓調節蛋白或活化的蛋白C，其尤其適用于診斷因子VLeiden，或者是特異性 抗血栓或抗血小板藥物；-含有信號底物的試劑；-可直接裝載到計算機內存中的軟件程序，所述程序在計算機上 運行時，用于計算由上述定義的方法測量的凝血酶活性曲線； -指導手冊。
17.權利要求16的試劑盒，其含有冷凍干燥的試劑。
全文摘要
本發明提供了實時測定凝血或血漿樣本中的凝血酶活性從樣本中出現和消失的過程的方法，包括向所述樣本中加入信號底物，所述信號底物引起可檢測的信號，所述信號與產生的蛋白水解活性經反應形成的轉化產物的量相關，實時監測所述樣本中該信號的發展，提供曲線，以及頻繁混合所述樣本，從而以致密的方式發生血塊形成，致使樣本的大部分保持流體，并抑制細胞沉淀，其中重復并以交替的方式進行所述監測和混合步驟。
文檔編號C12Q1/37GK101548019SQ200780040926
公開日2009年9月30日 申請日期2007年11月2日 優先權日2006年11月2日
發明者克里·塔潘登, 彼得·L·A·吉森, 溫內·瓊斯 申請人:凝血酶測量有限公司