合理設計的細胞培養基的制作方法

專利名稱：：合理設計的細胞培養基的制作方法
技術領域：
：本發明涉及合理地設計用于細胞培養物(例如，應用于多肽生產的細胞培養物)的細胞培養基的方法；用所揭示方法設計的細胞培養基；使用所述培養基產生大量相關多肽(例如，抗體)的方法；使用本文所揭示方法和培養基產生的多肽；及含有所述多肽的醫藥組合物。本發明特別可用于大規模細胞培養物。本文所揭示方法和組合物特別可用于在分批、補料分批和灌注動物細胞培養物中產生大量多肽。
背景技術：
：大部分生物技術產品(無論是在市場上有售或者只是在研發中)是蛋白治療劑；因此，人們需要在細胞培養物中產生這些多肽。而且，經常需要動物細胞(與(例如)細菌細胞形成對照)的細胞機器產生許多形式的多肽治療劑(例如，糖基化蛋白或雜交瘤產生的單克隆抗體(MAb))。因此，人們越來越需要優化這些多肽在細胞培養物中且特別是在動物細胞培養物中的產生。與細菌細胞培養物相比，動物細胞培養物具有更低的生產速率且通常會產生更低的產率。因此，大量研究集中在可優化多肽產量的動物細胞培養條件上，即，支持高細胞密度和高效價的條件。舉例來說，已確定將細胞培養基的葡萄糖濃度維持在低濃度下且在生產階段中于約400至600mOsm摩爾滲透壓濃度下培養細胞會增加動物細胞培養物的重組蛋白產量，其中在所有階段的培養也應在選定谷酰胺濃度(優選地，介于約0.2至約2mM之間)下進行。還確定了在補料分批過程中對動物細胞培養物限量補加葡萄糖可控制乳酸產生而無需以恒定速率補加葡萄糖。此外，已知改良在大規模細胞培養培養基中的全部氨基酸累積濃度、個別氨基酸濃度、及個別氨基酸彼此間(例如，谷酰胺與天冬酰胺)和個別氨基酸與全部氨基酸間(例如，谷酰胺與全部氨基酸)的比率能夠在實質上改善大規模多肽生產。傳統上，對動物細胞培養物的培養基研究集中在3種技術上l)向起始培養基中補加培養基組份及增加培養物補加頻率；2)對不同的培養基強度和不同的組份濃度應用多因數設計；及3)分析條件(使用過的)培養基的氨基酸、維生素、及其它組份，并添加低含量或耗盡的那些組份。這些方法通常使用細胞密度、存活率和效價響應作為優化指標。然而，上述方法只是根據最后結果(即，細胞密度、存活率和效價)間接地檢測細胞的營養素需求而非檢測并提供優化蛋白生產的實際細胞營養素需求。
發明內容本發明涉及合理地設計用于(例如)應用于多肽生產的大規模細胞培養物的細胞培養基(例如，大規模細胞培養基)的方法；用所揭示方法設計的細胞培養基(例如，大規模細胞培養基)；使用所述培養基產生大量相關多肽(例如，抗體)的方法；使用本文所揭示方法和培養基產生的多肽；及含有所述多肽的醫藥組合物。這些方法和組合物可用于培養(例如，分批、補料分批和灌注培養)細胞。這些方法和組合物特別可用于大規模培養(例如，分批、補料分批及灌注培養)動物細胞，例如，哺乳動物細胞。本發明的合理設計的培養基含有用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸。在一個實施例中，本發明提供一種在細胞培養物中產生多肽的方法，所述方法包含提供細胞培養物，所述細胞培養物包含細胞(包含編碼相關多肽的核酸)及期望細胞培養基(包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸)；并將所述細胞培養物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。在一個本發明實施例中，所述期望細胞培養基包含依據等式A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F計算的經基線調整氨基酸濃度A,其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價納入相關多肽中的氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，N是相關多肽的期望濃度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數。在另一實施例中，本發明提供一種在細胞培養物中產生多肽的方法，所述方法包含提供細胞培養物，所述細胞培養物包含細胞，所述細胞包含編碼相關多肽的核酸；及起始細胞培養基，其中所述起始細胞培養基的體積是期望細胞培養基體積的約60-99%;對所述細胞培養物提供補加細胞培養基，其中所述補加細胞培養基的體積是期望細胞培養基體積的約1-40%，且其中所得期望細胞培養基包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸；并將所述細胞培養物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。在一個本發明實施例中，所得期望細胞培養基具有依據等式A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F計算的經基線調整氨基酸濃度A，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價納入相關多肽中的氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，N是相關多肽的期望濃度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數；并將所述細胞培養物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。在另一本發明實施例中，所述起始細胞培養基包含依據等式B=[A-(Z*V)]/(1V)計算的濃度B的氨基酸，其中Z是補加細胞培養基的氨基酸濃度，且V是作為所述期望細胞培養基體積一部分的補加培養基體積。在本文所揭示方法的另一實施例中，Y為0至約1.5。在本文所揭示方法的又一實施例中，F為約l至約1.5。在本文所揭示方法的再一實施例中，Y為0至約1.5且F為約1至約1.5。在本文所揭示方法的一個實施例中，所述期望細胞培養基包含大于或等于約3mM的酪氨酸。在本文所揭示方法的另一些實施例中，所述期望細胞培養基包含介于約7mM與約30mM之間的亮氨酸；介于約7mM與約30mM之間的賴氨酸；介于約7mM與約30mM之間的蘇氨酸；介于約7mM與約30mM之間的脯氨酸；及/或介于約7mM與約30mM之間的纈氨酸。在本文所揭示方法的再一實施例中，亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和纈氨酸在期望細胞培養基中的組合濃度是介于約35mM與約150mM之間。在又一實施例中，亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和纈氨酸在期望細胞培養基中的組合濃度是全部必需氨基酸在所述期望細胞培養基中濃度的介于約60%與約80%之間。在本文所揭示方法的一個實施例中，必需氨基酸在期望細胞培養基中的組合濃度是全部必需氨基酸在所述期望細胞培養基中濃度的介于約30%與約50%之間。在本文所揭示方法的另一實施例中，氨基酸在所述期望細胞培養基中的濃度是介于約120mM與約350mM之間。在本文所揭示方法的再一實施例中，將脯氨酸在細胞培養物中的濃度維持在大于約1mM。在本文所揭示方法的又一實施例中，將脯氨酸在細胞培養物中的濃度維持在大于約2mM。在生產多肽方法的一些實施例中，所述細胞培養物是大規模細胞培養物。在其它實施例中，所述細胞是動物細胞。本發明的又一方面提供依據本文所揭示方法產生的多肽。本發明的另一方面提供一種醫藥組合物，其包含依據本文所揭示方法產生的多肽及醫藥上可接受的載劑。本發明的又一方面提供一種細胞培養的方法，所述方法包含提供細胞培養物，所述細胞培養物包含細胞及期望細胞培養基，所述期望細胞培養基包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸及用于細胞維持的計算濃度的氨基酸；并將所述細胞培養物維持在所述細胞可于所述細胞培養物中生長和復制的條件下。在一個本發明實施例中，所述期望細胞培養基包含依據等式A'=[(M*X)+(Y*M*X)]*F計算的經基線調整氨基酸濃度A'，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數。在所述細胞培養方法的一些實施例中，所述細胞培養物是大規模細胞培養物。在其它實施例中，所述細胞是動物細胞。本發明的又一方面提供細胞培養基，其包含介于約120mM與約350mM之間的氨基酸總濃度。本發明的另一方面提供一種用于生產相關多肽的細胞培養基，其包含介于約120mM與約350mM之間的氨基酸總濃度。本發明的另一方面提供一種用于生產相關多肽的細胞培養基，其包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸。在一個本發明實施例中，用于生產相關多肽的細胞培養基包含依據等式A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F計算的經基線調整的氨基酸濃度A，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價納入相關多肽中的氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，N是相關多肽的期望濃度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數。本發明的再一方面提供一種細胞培養基，其包含依據等式A'=[(M*X)+(Y*M*X)]*F計算的經基線調整氨基酸濃度A'，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，Y是細胞維持因數，且F是基線因數。在一些實施例中，所述細胞培養基是大規模細胞培養基。在其它實施例中，所述細胞培養基是動物細胞培養基。本發明的再一方面提供一種確定在可于細胞培養物中產生相關多肽的細胞培養基中所用優化氨基酸濃度的方法，所述方法包含確定所述細胞在細胞培養物中于目標細胞密度下形成細胞群細胞群所需氨基酸濃度；確定在細胞培養物中于目標多肽效價下產生相關多肽所需氨基酸濃度；確定所述細胞在細胞培養物中的細胞維持所需氨基酸濃度；并加合所述各濃度以提供在細胞培養物中可產生相關多肽的細胞培養基中所用優化氨基酸濃度。本發明的又一方面提供確定在可于細胞培養物中產生相關多肽的細胞培養基中所用氨基酸的優化氨基酸濃度A的方法，所述方法包含確定所述細胞于設定細胞密度下形成細胞群細胞群所需氨基酸濃度X;確定于設定多肽效價下產生相關多肽所需氨基酸濃度P;及依據等式A=[(M*X)+(N*P)+(M*Y*X)]*F確定優化氨基酸濃度A，其中M是所述細胞培養物的期望目標細胞密度的乘數，N是相關多肽的期望目標濃度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數。在確定優化氨基酸濃度的方法的一些實施例中，所述細胞培養物是大規模細胞培養物。在其它實施例中，所述細胞是動物細胞。從下述具體實施方式和上述權利要求書可明了本發明的其它特征和優點。圖1描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的細胞密度(Y軸；"細胞密度(106個細胞/mL)")隨時間(X軸；"天數")的變化。在實例2的合理設計的培養基中培養細胞。圖2描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的抗-IL-22抗體效價(Y軸；"效價(g/L)")隨時間(X軸；"天數")的變化。在實例2的合理設計的培養基中培養細胞。圖3描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的細胞密度(Y軸；"細胞密度(106個細胞/mL)")隨時間(X軸；"天數")的變化。在實例3的合理設計的培養基中培養細胞。圖4描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的抗-IL-22抗體效價(Y軸；"效價(g/L)")隨時間(X軸；"天數")的變化.在實例3的合理設計的培養基中培養細胞。圖5描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的抗-IL-22抗體效價(Y軸；"效價(g/L)")隨時間(X軸；"天數")的變化。在"傳統培養基"(一種基于傳統細胞培養物要求的培養基，參見，例如，美國公開專利申請案第2006/0121568號)、使用本文方法制備的"合理設計的培養基"、或含有額外添加至"傳統培養基"中的3.7mM脯氨酸的"傳統培養基+脯氨酸"中培養細胞(參見實例4)。圖6描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的細胞密度(Y軸；"細胞密度(106個細胞/mL)"隨時間(X軸；"天數")的變化。在"傳統培養基"、"合理設計的培養基"、或"傳統培養基+脯氨酸"中培養細胞(參見實例4)。圖7描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的細胞存活率(Y軸；"存活率[%]")隨時間(X軸；"天數")的變化。在"傳統培養基"、"合理設計的培養基"、或"傳統培養基+脯氨酸"中培養細胞(參見實例4)。圖8描繪細胞經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的指定氨基酸((圖8A)脯氨酸；(圖8B)蘇氨酸；(圖8C)纈氨酸；(圖8D)色氨酸；或(圖8E)酪氨酸)濃度(Y軸；"[uM]"")隨時間(X軸；"天數")的變化。在"傳統培養基"、"合理設計的培養基"、或"傳統培養基+脯氨酸"中培養細胞(參見實例4)。圖9描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的細胞密度(Y軸；"細胞密度(106個細胞/mL)")隨時間(X軸；"天數")的變化。在"合理設計的培養基"或"不涉及維持因數和基線因數的合理設計的培養基"中培養細胞。所述圖是5個獨立同樣試驗(r^5)的代表圖(參見實例6)。圖10描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的細胞存活率(Y軸"存活率(％)")隨時間(X軸；"天數")的變化。在"合理設計的培養基"或"不涉及維持因數和基線因數的合理設計的培養基"中培養細胞。所述圖是5個獨立同樣試驗(n-5)的代表圖(參見實例6)。圖11描繪經改造可表達抗-IL-22的CHO細胞的抗體效價(Y軸；"效價(g/L)")隨時間(X軸；"天數")的變化。在"合理設計的培養基"或"不涉及維持因數和基線因數的合理設計的培養基"中培養細胞。所述圖是5個獨立同樣試驗(n-5)的代表圖(參見實例6)。具體實施例方式如本文所用術語"分批培養"是指一種培養細胞的方法，其中在所述培養過程開始時提供最終會用于培養所述細胞的所有組份，包含所述培養基以及細胞本身。通常在某個時刻停止分批培養并收獲及(視需要)純化所述培養基中的細胞及/或組份。如本文所用術語"補料分批培養"是指一種培養細胞的方法，其中在所述培養過程開始后的某個時刻對所述培養物提供額外的組份。所提供組份通常包含在所述培養過程中耗盡了的細胞營養補劑。通常在某個時刻停止補料分批培養并收獲及(視需要)純化所述培養基中的細胞及/或組份。在本發明的優選實施例中，所述細胞培養是動物細胞培養(例如，哺乳動物細胞培養)，其為分批培養或補料分批培養。如本文所用術語"灌注培養"是指一種培養細胞的方法，其中在所述培養過程開始后以連續方式或半連續方式對所述培養物提供額外組份。所提供組份通常包含在所述培養過程中耗盡了的細胞營養補劑。所述培養基中的細胞及/或組份部分通常以連續或半連續方式收獲并視需要經純化。如本文所用術語"生物反應器"是指供原核細胞或真核細胞培養物(例如，動物細胞培養物，例如，哺乳動物細胞培養物)生長所用任何容器。所述生物反應器可具有任一大小，只要其可用于培養細胞，例如，哺乳動物細胞。通常，所述生物反應器可為至少30ml且可為l升、10升、100升、250升、500升、1000升、2500升、5000升、8000升、10,000升、12,0000升或更大、或任一中間體積。在培養期間通常需控制所述生物反應器的內部條件，包括但不限于pH和溫度。所述生物反應器可由任何適用于在本發明培養條件下容納懸浮于培養基中的哺乳動物細胞培養物的材料制成。如本文所用術語"生產型生物反應器"是指在相關多肽或蛋白生產中所用最終生物反應器。大規模細胞培養物生產型生物反應器的體積一般大于約100ml，通常為至少約10升，且可為500升、1000升、2500升、5000升、8000升、10,000升、12,0000升或更大、或任一中間體積。一名普通技術人員可認識到且能夠選擇用于實踐本發明的適宜生物反應器。如本文所用術語"細胞密度"、"細胞濃度"或類似詞組是指存于給定體積培養基中的細胞數目、重量、質量等。"峰值細胞密度"或類似詞組是指在給定體積培養基中可達到的最大細胞數目，且"期望峰值細胞密度"或類似詞組是指實踐人員期望在給定細胞體積中獲得(例如，目標)的最大細胞數目。那些所屬領域的技術人員會明了所述目標值的變動，例如，一名所屬領域的技術人員可以期望細胞群細胞群這一術語來表達目標值，且所述目標值可以一個或多個適當的度量單位(例如，期望峰值細胞群細胞群單位)計。如本文所用術語"細胞存活率"是指細胞在培養物中于一組給定培養條件或實驗變動條件下生存的能力。所述如本文所用術語也指在特殊時間時活著的細胞占此時存于培養物中細胞(活著的及死亡的)總數目的比例。如本文所用術語"培養物"和"細胞培養物"是指在適合細胞群體生存及/或生長的條件下懸浮于細胞培養基中的細胞群體。如本文所用這些術語可指包含所述細胞群體(例如，動物細胞培養物)與其中懸浮有所述群體的培養基的組合。如本文所用術語"整合活細胞密度"或"IVC"是指活細胞在培養過程中的平均密度乘以培養進行的時間。假如所產生多肽量及/或蛋白量與在培養過程中所存在活細胞數目成比例，則整合活細胞密度是評定在培養過程中所產生多肽量及/或蛋白量的有用工具。如本文所用術語"培養基(medium)"、"細胞培養基(cellculturemedium)"、和"培養基(culturemedium)"是指含有為正在生長中動物(例如，哺乳動物)細胞提供養分的營養素的溶液。通常，這些溶液提供所述細胞最小生長及/或生存所需要的必需和非必需氨基酸、維生素、能量來源、脂質及微量元素。所述溶液還可含有促進生長及/或生存(高于最小速率)的組份，包括激素和生長因子。將所述溶液以優選方式調配到最適合細胞生存和增殖的pH和鹽濃度。在一個實施例中，所述培養基是確定成份培養基。確定成份培養基是其中所有組份具有已知化學結構的培養基。在另一本發明實施例中，所述培養基可含有源自所屬領域已知的任何來源或方法的氨基酸，包括但不限于源自單一氨基酸添加物或源自蛋白胨或蛋白水解產物(包含動物或植物來源)添加物的氨基酸。如本文所用術語"接種"是指對生物反應器或另一容器提供細胞培養物的過程。所述細胞可能先前己在另一生物反應器或容器中繁殖。另一選擇，所述細胞在將其提供給生物反應器或容器之前(例如，即將提供給生物反應器或容器之前)經冷凍和解凍。所述術語是指許多細胞，包含單一細胞。如本文所用術語"效價"是指借助動物細胞培養物產生的相關多肽的總量除以給定培養基體積量；因此"效價"是指濃度。效價通常以毫克多肽/毫升培養基為單位表達。如本文所用術語"抗體"包括包含至少一個(且通常兩個)VH域或其部分及/或至少一個(且通常兩個)VL域或其部分的蛋白。在某些實施例中，所述抗體是兩個免疫球蛋白重鏈與兩個免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過(例如)二硫鍵相互連接。所述抗體或其一部分可從任何來源獲得，包括但不限于嚙齒類動物、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物)、駱駝科動物等，或其可以重組方式產生，例如，嵌合、人源化及/或活體外產生的，例如，通過那些所屬領域的技術人員熟知的方法獲得。涵蓋于術語"抗體的抗原-結合片段"中的結合片段的實例包括但不限于(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL及CH1域構成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含2個在鉸鏈區中由二硫橋鍵連接的Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域構成的Fd片段；(iv)由單臂抗體的VL和VH域構成的Fv片段；(v)dAb片段，其由VH域構成；(vi)駱駝科動物或駱駝科動物源化重鏈可變域(VHH);(vii)單鏈Fv(scFv;參見下文)；(Viii)雙重特異性抗體；及(ix)—個或多個與Fc區融合的免疫球蛋白分子片段。此外，盡管Fv片段的兩個域VL和VH通過不同基因編碼，但所述域可使用重組方法借助合成連接子來連接，所述合成連接子能夠使其作為其中VL和VH區配對形成單價分子的蛋白單鏈(稱作單鏈Fv(scFv))制備；參見(例如)伯德(Bird)等人，(1988)科學"c/wce)242:423-26;休斯頓(Huston)等人(1988)美國國家科學研究院學報(/VocAtoZ.Acaa.Sd.".SU85:5879-83)。所述單鏈抗體還欲涵蓋于術語"抗體的抗原結合部分"中。可借助那些所屬
技術領域：
人員已知的習用技術獲得這些片段且以與完整抗體相同的方式評價有用的片段。"抗原-結合片段"可視需要進一步包括可增強(例如)穩定性、效應細胞功能或補體結合中的一者或多者的部分。舉例來說，所述抗原結合片段可進一步包括聚乙二醇部分、白蛋白、或重鏈及/或輕鏈恒定區。應理解，除"雙特異性"或"雙功能性"抗體外，抗體應理解為其各結合位點均為相同的。"雙特異性抗體"或"雙功能性抗體"是一種具有2個不同重鏈/輕鏈配對及2個不同結合位點的人工雜交抗體。雙特異性抗體可借助各種方法(包括融合雜交瘤或鏈接Fab'片段)來產生。參見，例如，Songsivilai及拉赫曼(Lachmann)(1990)臨床與實驗免疫學(C7!'",&;;7./mmimoD79:315-21;克斯特尼(Kostelny)等人(1992)免疫學雜志(/./mmtmoZ.)148:1547-53。詞組"蛋白"或"蛋白產物"是指一種或多種氨基酸鏈。如本文所用術語"蛋白"與"多肽"同義且如所屬領域通常所理解，是指通過順序肽鍵鏈接的至少一種氨基酸鏈。在某些實施例中，"相關蛋白"或"相關多肽"是通過已轉化到宿主細胞中的外源核酸分子編碼的蛋白。在某些實施例中，其中"相關蛋白"由用于轉化宿主細胞的外源DNA編碼，所述外源DNA的核酸序列決定了氮基酸的序列。在某些實施例中，"相關蛋白"是一種通過宿主細胞內源性核酸分子編碼的蛋白。在某些實施例中，可通過用外源核酸分子轉染宿主細胞來改變此相關內源性蛋白的表達，所述外源核酸分子可(例如)含有一個或多個調控序列及/或編碼可增強相關蛋白表達的蛋白。本發明的方法和組合物可用于生產任何相關蛋白，包括但不限于具有醫藥特性、診斷特性、農用特性及/或可用于商業、實驗及/或其它應用中各種其它特性的任一種特性的蛋白。另外，相關蛋白可為蛋白治療劑。即，蛋白治療劑是一種對其在體內的一個作用區域或對其通過中間體遠程作用的一個身體區域具有生物效用的蛋白。蛋白治療劑的實例更詳細地陳述于下文中。在某些實施例中，使用本發明方法及/或組合物產生的蛋白可經加工及/或改良。舉例來說，可依據本發明產生的蛋白可經糖基化。本發明可用于培養細胞以有利地生產任何治療性蛋白，例如，醫藥上或商業上相關酶、受體、抗體(例如，單克隆及/或多克隆抗體)、Fc融合蛋白、細胞因子、激素、調控因子、生長因子、凝結/凝血因子、抗原結合因子等。一名普通技術人員應可認識到能夠依據本發明生產的其它蛋白且應能夠使用本文所揭示方法來生產所述蛋白。重組宿主細胞的表達構建體和產生本發明使用重組宿主細胞，例如，原核或真核宿主細胞，即，經含有編碼相關多肽的核酸的表達構建體轉染的細胞。詞組"動物細胞"涵蓋無脊椎動物細胞、非哺乳動物脊椎動物(例如，鳥類、爬行動物和兩棲動物)細胞、及哺乳動物細胞。無脊椎動物細胞的非限制性實例包括下列昆蟲細胞草地粘蟲(5^^7/7/era/rag^mto)(毛蟲)、埃及伊蚊"^tes(蚊蟲)、白紋伊蚊(Aeifeya仏o戸'"^)(蚊蟲)、黑腹果蠅(Drasop/z"flmeZanogosfer)(果蟲黽)、及家蠶(5om6;y;cmon')(桑蠶/蠶蛾)。許多哺乳動物細胞系是用于相關多肽重組表達的適宜宿主細胞。哺乳動物宿主細胞系包括(例如)COS、PER.C6、TM4、VER0076、MDCK、BRL-3A、W138、HepG2、MMT、MRC5、FS4、CHO、293T、A431、3T3、CV-1、C3H10T1/2、Colo205、293、HeLa、L細胞、BHK、HL陽60、FRhL-2、U937、HaK、Jurkat細胞、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、Mlx、鼠科動物骨髓瘤(例如，SP2/0及NS0)及C2C12細胞、以及經轉化靈長類動物細胞系、雜交瘤、正常二倍體細胞、及源自原代組織及原代細胞(primaryexplant)活體外培養的細胞株。能夠表達相關多肽的任何真核細胞可用于所揭示培養基設計方法。許多細胞系可自商業來源獲得，例如，美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)。在一個本發明實施例中，所述細胞培養(例如，大規模細胞培養)采用雜交瘤細胞。抗體產生雜交瘤細胞的構建為業內所熟知。在一個本發明實施例中，所述細胞培養(例如，大規模細胞培養)采用CHO細胞。另一選擇，可能在低級真核生物(例如，酵母菌)或在原核生物(例如，細菌)中以重組方式產生相關多肽。適宜酵母菌株包括釀酒酵母(Sacc/wramyc^ce^WWae)、裂殖酵母菌(Sc/n'柳acc/^ramycespom&e)、克魯維酵母菌株(幻"戸TOm戸51strains)、念珠菌屬(OmA^)、或能夠表達相關多肽的任何酵母菌株。適宜細菌株包括大腸桿菌(Esc/^n'c/z!'aco//)、枯草芽孢桿菌(5ad/Zi^、鼠傷寒沙門氏菌(&Zmo"e〃atyP/u>mm'Mm)、或能夠表達相關多肽的任何細菌株。在細菌中表達可形成納入所述重組蛋白中的包涵體。因此，可能需要重組蛋白再折疊以產生活性或更具活性材料。若干從細菌包涵體獲得經恰當地折疊的異源性蛋白的方法為所屬領域所知。這些方法通常涉及使所述蛋白自所述包涵體溶解，隨后使用離液劑使所述蛋白完全變性。當在所述蛋白的基本氨基酸序列中存在半胱氨酸殘基時，經常必需在可恰當地形成二硫鍵(氧化還原系統)的環境中完成所述再折疊。再折疊的通用方法揭示于科諾(Kohno)(1990)酶學方法(Af"/z.Enz;ymoZ.)185:187-95，歐洲專利EP0433225和美國專利第5，399，677號中。本發明使用由至少一種編碼相關多肽的聚核苷酸構成的構建體，其呈質粒、載體、及轉錄或表達盒形式。載體能夠引導以可操作方式與其鏈接的基因表達。所述載體在本文中稱作"重組表達載體"或"表達載體"。總的來說，在重組DNA技術中可用表達載體經常呈質粒形式。在本說明書中，"質粒"和"載體"可互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明意欲包括具有等效功能的其它形式的表達載體，包括但不限于病毒載體(例如，復制缺陷型反轉錄病毒、經改造甲病毒(alphaviruses)、腺病毒及腺伴隨病毒)。適用于在動物細胞中蛋白表達的構建體為所屬領域所熟知。舉例來說，聚核苷酸可以可操作方式鏈接到表達控制序列，例如，那些存于揭示于(例如)考夫曼(Kaufman)等人(1991)核酸研究(A^c.Acj^)19:4485-90中的pMT2或pED表達載體中的表達控制序列。其它適宜表達控制序列可發現于所屬領域已知的載體中且包括但不限于HaloTagpHT2、pACT、pBIND、pCAT3、pCI、phRG、phRL(普洛麥格公司(Promega)，麥迪遜(Madison)，WI);pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA4/HisMAX、pcDNA4/HisMAX-E、pcDNA31/Hygro、pcDNA3.1/Zeo、pZeoSV2、pRc/CMV2、pBudCE4pRc/RSV(英杰生命技術公司(Invitrogen)，卡爾斯巴德(Carlsbad),CA);pCMV-3Tag載體、pCMV-Script⑧載體、pCMV-Tag載體、pSG5載體(吉泰公司(Stratagene)，拉由拉市(LaJolla)，CA);pDNR-Dual、pDNR-CMV(克隆泰公司(Clonetech)，巾白洛阿爾托(PaloAlto)，CA);及pSMEDA(惠氏公司(Wyeth),麥迪遜，WI)。表達重組蛋白的通用方法也為人們所知且例示于(例如)考夫曼(1990)^#;^法￡>|"附0/.,185:537-66中。如本文所定義"以可操作方式鏈接"意指以酶促方式或以化學方式連接以在擬表達聚核苷酸與表達控制序列之間以可通過轉染宿主細胞表達編碼蛋白的方式形成共價鍵。本發明的重組表達構建體可攜帶額外序列，例如，調控序列(例如，可調控載體復制(例如，編碼相關多肽(或肽)的核酸序列的復制、轉錄起點)或所述編碼多肽表達的序列)、標簽序列(例如，組氨酸)、及可選擇標記基因。術語"調控序列"意欲包括啟動子、增強子及任何其它可控制轉錄、復制或轉譯的表達控制元件(例如，聚腺苷酸化信號、轉錄剪接位點)。所述調控序列闡述于(例如)戈德爾(Goeddel)，基因表達技術(Gewefic;rewZcwrec/mo/ogy):(^Mef/u^"'打五wzy附oZogyJ,學術出版社(AcademicPress),圣地亞哥(SanDiego),CA(1990)中。那些所屬領域的技術人員應會意識到包括調控序列選擇在內的表達載體設計將取決于各種因素，包括宿主細胞的選擇和期望蛋白表達程度。供蛋白在哺乳動物宿主細胞中表達的優選調控序列包括針對高程度蛋白表達的病毒元件，例如，源自FF-la啟動子和BGHpolyA、巨細胞病毒(CMV)的啟動子及/或增強子(例如，CMV啟動子/增強子)、源自猿病毒40(SV40)的啟動子及/或增強子(例如，SV40啟動子/增強子)、源自腺病毒的啟動子及/或增強子(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及源自多瘤病毒的啟動子及/或增強子。病毒調控元件及其序列闡述于(例如)美國專利第5，168，062號、第4,510,245號及第4,968,615號中，所有所述案件的全文均以引用的方式納入本文中。可選擇或構建含有適當調控序列的適宜載體，所述調控序列包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因及其它序列，視情況而定。在所揭示方法中還可使用通過使用具有誘導型啟動子序列的載體(例如，四環素誘導型載體，例如，pTet-OnTM和pTet-Off(克隆泰(Clontech)，帕洛阿爾托(PaloAlto)，CA))所實現的誘導型蛋白表達。關于表達載體的其它詳情，參見，例如，分^^"摩,^"J^皇手嚴Mo/ecw/arCtomVzg:aLa60rato/7Ma做aZ;(第2版)薩姆布魯克(Sambrook)等人編寫，冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，NY(1989)。關于核酸操控(例如，在制備核酸構建體、誘變、測序、將DNA導入細胞中、基因表達、及蛋白分析中)的許多已知技術和方案還詳細地闡述于最新分子生物學實驗方法匯編(CMre"f/Votoco/;yMofeo^r)(第2版)奧蘇貝爾(Ausubel)等人編寫，約翰威利父子出版社(Wiley&Sons),阿拉梅達(Alameda)，CA(1992)中。插入表達構建體以產生相關多肽的聚核苷酸可編碼任何能夠在細胞培養物中所用宿主細胞中表達的多肽。因此，所述聚核苷酸可編碼全長基因產物、部分全長基因、肽、或融合蛋白。所述聚核苷酸可由基因組DNA或cDNA構成且可源自任何動物。聚核苷酸可通過所屬領域熟知的方法(例如，PCR或RT-PCR)從細胞或生物體分離或可通過已知習用化學合成方法來生產。所述以化學方式合成的聚核苷酸可與天然聚核苷酸擁有若干同樣的生物特性且因此可用作天然聚核苷酸的替代物。多肽還可通過在一種或多種昆蟲細胞表達載體(例如，桿狀病毒載體)中以可操作方式鏈接所述編碼相關多肽的聚核苷酸與適宜控制序列并采用昆蟲細胞表達系統來以重組方式產生。用于桿狀病毒/Sf9表達系統的材料和方法可以試劑盒形式自市場上購得(例如，MAXBAC⑧試劑盒，英杰生命技術公司，卡爾斯巴德，CA)。可通過所屬領域熟知的許多方法來實現所述表達構建體對宿主細胞(例如，動物細胞)的轉染。細胞可經瞬時轉染或經穩定轉染。存在可用于將分子(特別是核酸)遞送到宿主細胞(例如，動物細胞)中的若干不同的公認方法。隨細胞類型、期望轉染(即，瞬時或穩定)、及具體實驗要求(例如，不同細胞系或原發細胞的轉染、轉染分子類型(基因組DNA、DNA、寡核苷酸)、或所選表達構建體)而定，各轉移方法具有那些所屬領域的技術人員已知的優點和缺點。常用轉染方法包括(例如)磷酸鈣沉淀、脂質體介導的轉染、DEAE葡聚糖介導的轉染、基因槍、電穿孔、納米粒子遞送、聚胺、附加體、及聚乙烯亞胺。另外，許多轉染試劑盒和試劑可從諸如下述等公司購得英杰生命技術公司(VOYAGER,LIPOFECTIN⑧)、EMD生命科學公司(EMDBiosciences),圣地亞哥，CA(GENEJUICETM)、起安捷(Qiagen)，杰曼鎮(Germantown),MD(SUPERFECT)、奧比杰(Orbigen)，圣地亞哥，CA(SAPPHIRE),且許多其它轉染試劑盒和試劑為那些所屬領域的技術人員所知。轉染方案還可發現于分子生物學的基本方法(^w!'cM"/io心/"AfoZecwZar所oZogy)(第2版)Davis等人編寫，阿普頓朗格出版社(AppletonandLange)，CT(1994)中。本發明使用細胞培養物(例如，大規模動物細胞培養物)來產生大量相關多肽。大規模瞬時轉染方法揭示于乂—J/^^虜離動^^智應乂g孝^^^"術a^ge-"^M,ma/!'朋Ce〃Cu/erec/moZog}^(生物技術和生物工藝系列(BiotechnologyandBioprocessingSeries)),Lubiniecki編寫，馬塞爾'德克爾出版社(MarcelDekker)，NY(1990);Kunaparaju等人(2005)生物技術生物工程(5^ec/moZ.)91:670-77;米爾瑞拉(Maiorella)等人(1988)生物/技術(所o/rec/motog;y)6:1406-10;巴爾迪(Baldi)等人，上述；蘭范(LanPham)等人，上述；邁斯納(Meissner)等人，上述；杜羅切(Durocher)等人，上述〗。一般來說，哺乳動物細胞培養物的大規模瞬時基因表達可采用若干類型常用轉染模式中的任一種(例如，聚乙烯亞胺、電場脈沖、CALFECTIONTM或磷酸鈣沉淀)以在期望規模或體積(例如，大于10升)下達成高轉染效率(德魯慈(Derouazi)等人，上述；羅斯(Rols)等人(1992)欲#主激眾學染,安rEwr.fi/oc/zem.)206(1):115-21;伍木和伯納德(WurmandBernard)(1999)生物技術新見(O^r.Op!'".說otec/moZ.)10(2):156-59;斯萊格和克里斯坦森(SchlaegerandChristensen)(1999)細胞技術(Cytofec/mo/ogy)30(1-3):71-83;喬丹(Jordan)等人(1998)細胞技術(Cy欣ec/mo/ow)26(1):39-47;林德(Lindell)等人(2004)生物化學與生物物理學報(所oc似m.說op/i;^.)1676(2):155-61)。這些大規模培養物一般是在具有攪拌板的生物反應器、振蕩器或培養箱中生長，且還可稱作"旋動"或"懸浮"培養物。因此，與其中細胞附著于板或燒瓶上的傳統轉染相反，所揭示方法一般使用懸浮培養物。大規模細胞培養物一般視為具有大于約100ml體積的細胞培養物。在一些情形中，可能先產生表達相關多肽的細胞系且隨后使用所述細胞系接種大規模細胞培養物。表達相關蛋白的穩定細胞系可通過各種熟知的方法(包括用于本文所揭示瞬時轉染的方法)來產生。一般來說，穩定細胞系可通過在化學成份確定的培養基中長期生長和選擇來產生。舉例來說，經編碼相關多肽的核酸轉染(例如，通過磷酸鈣沉淀、或脂質體轉染)的細胞可伴隨經攜帶新霉素抗性基因的載體轉染，此賦予對新霉素/遺傳霉素的抗性(G418)。經轉染細胞隨后在含有G418的培養基中生長且生存的細胞無性系地繁殖擴大以產生穩定表達的細胞系。此細胞系等份試樣隨后可用于接種大規模培養物并產生大量相關蛋白。轉染細胞需要優化若干變量，包括細胞接種密度(例如，約lxl()S個至約3x106個細胞/mL培養物)、血清濃度(例如，0-10%)、培育溫度(例如，約20-38'C)、轉染媒介或試劑(化學或電)、培養體積(例如，約5ml-20升)、及培育時間(例如，約24-144小時)。對于各細胞類型來說，最佳參數會有所變化。然而，對于利用選定宿主細胞轉染的特定細胞類型，商業供應商一般會提供用于其轉染的優化指導，如那些所屬領域的技術人員已知的各種參考文獻所述。此等資料來源可用于指導所選宿主細胞的轉染，或可用作起始點，自所述起始點可使用簡單的反復試驗來提供最佳轉染參數。細胞培養物生產相關多肽的典型程序包括分批培養和補料分批培養。在傳統上，分批培養過程包括用特殊細胞密度的接種培養物接種大規模生產培養物，使所述細胞在有助于細胞生長和存活的條件下生長，當所述細胞達到指定細胞密度時收獲所述培養物，并純化經表達多肽。補料分批培養程序包括如下額外步驟用在所述細胞生長期間消耗的營養素和其它組份補充分批培養物。一名普通技術人員應可意識到本發明可應用于任何可在其中培養細胞的系統，包括但不限于分批系統、補料分批系統和灌注系統。在本發明的某些優選實施例中，使所述細胞在補料分批系統中生長。傳統培養(例如，分批培養和補料分批培養)的持久未解決的問題是代謝廢物的產生，所述代謝廢物對細胞生長、存活和表達多肽產生具有不利作用。具有特別不利作用的兩種代謝廢物是乳酸和銨，其分別是由于葡萄糖和谷酰胺代謝而產生的。除了由于谷酰胺代謝而以酶促方式產生外，銨還會由于隨時間進行非代謝性降解而聚集于細胞培養物中。傳統培養基調配物(包括市售培養基，例如，Ham'sF10(西格瑪(Sigma))、最低必需培養基([MEM]，西格瑪)、RPMI-1640(西格瑪)和杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)([DMEM]，西格瑪))具有較高葡萄糖和谷酰胺含量(后者是相對于其它氨基酸來說)。先前，據信，需要豐富的這些組份，這是因為所述組份是細胞初級代謝的能量來源。然而，這些營養素迅速地被消耗，造成乳酸和銨聚集，如上文所述。另外，葡萄糖和谷酰胺的初始高含量與乳酸和銨的后來聚集均會產生高摩爾滲透壓濃度，此情況本身經常會對細胞生長、細胞存活和多肽產生不利。本文所揭示合理設計的培養基可經改良以減少有害代謝產物的聚集。所述改良形式可發現于(例如)美國公開專利申請案第2005/0070013號(限制葡萄糖補加)和第2006/0121568號(改良氨基酸含量和比率)中，所述兩個案件的全文均以引用的方式納入本文中。合理的培養基設計和調配與本發明的培養基調配物相比，傳統培養基調配物以較低氨基酸總含量開始。舉例來說，DME-F12(杜貝克氏改良鷹氏培養基與Ham'sF12培養基的50:50混合物)的總氨基酸含量為7.29mM且稱為RPMI-1640的傳統細胞培養基的總氨基酸含量為6.44mM(參見，例如，莫頓(Morton)(1970)活體夕卜(/"W加)6:89-108;漢姆(Ham)(1965)美國國家科學院學報(/Voc.Ato.AcW.Scf'.C;.S.A.)53:288-93;穆爾(Moore)等人(1967)美國醫學會期刊a.Am.M^Ca//Um.)199:519-24，所有參考文獻均以引用的方式納入本文中)。最新培養基調配物(例如，揭示于美國公開專利申請案第2006/0121568號中的培養基)含有更高濃度的氨基酸和營養素。然而，傳統調配物并非基于實際計算的細胞要求(其包括細胞生長、細胞維持)和(對于用于生產重組多肽的細胞培養物來說)生產要求。使用本文所提供這些變量是確定具有更高而且無毒性總氨基酸濃度的培養基調配物的方法。本文所述細胞培養基調配物(例如，大規模細胞培養基調配物)在依據(例如)本文所述其它培養步驟及依據(例如)諸如那些發現于(例如)美國公開專利申請案第2006/0121568號中的改良形式等改良形式使用時可優化細胞密度和多肽效價。本文所述培養基調配物的氨基酸濃度是基于l)細胞群細胞群；2)細胞維持；和3)多肽生產所需氨基酸濃度。在一個本發明實施例中，細胞培養基含有用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸。在另一本發明實施例中，細胞培養基含有通過等式A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F表示的濃度A的氨基酸，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價納入相關多肽中的氨基酸濃度，M是期望細胞群細胞群(即，期望細胞群細胞群峰值單位)的乘數，N是相關多肽的期望濃度(即，期望或目標多肽效價)的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數。在上述等式中針對每單位多肽效價納入相關多肽中的氨基酸濃度P是基于重組蛋白的一級結構，g卩，所述多肽的氨基酸含量。因此，P將根據擬通過所述大規模細胞培養生產的相關多肽而有所變化。隨后可使用相關多肽的期望濃度(即，期望或目標多肽效價)的乘數N將P轉化成對相關多肽目標濃度的氨基酸要求。在下文一些本發明代表性實例中，多肽效價的基本單位是1g/L。在含有使用本文所提供等式所獲得代表性計算值的下文表1中，在10g/L效價下相關多肽所需細胞培養基的氨基酸濃度(第4列)可通過在1g/L下所需氨基酸濃度P(第2列)乘以乘數N來確定，其中N=10。表l:在期望細胞群細胞群下10g/L抗體目標效價所需經基線調整氨基酸濃度的代表性確定值，其中期望細胞群細胞群是通過15x106個細胞/就的期望峰值細胞密度來表示。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>可通過(例如)將特定細胞系的整合活細胞密度(IVC)乘以單位生產率(qp)來計算乘數N(N-IVC^qp)。舉例來說，如果特定細胞系的接種密度是0.8xl(^個細胞/mL，在第6天和第10天的細胞密度是15x10e個細胞/mL，且在第18天的細胞密度是11x1(^個細胞/mL(g卩，在第6天和第15天是該數值的73%),那么IVC=211x106(個細胞/mL"天(即，[(0.8+15)/2]*6天+[(15+15)/2]*4天+[(15+11)/2]*8天)。如果所選細胞系的平均單位生產率(qp)是(例如)47嗎/106個細胞/天，那么在第18天N=10g/L(即，211x106(個細胞/mL"天x47^^/106細胞/天)。一名熟悉所屬
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的人員會了解可對任何細胞系進行這些計算或可根據細胞特征和來源來估計此N值。另一選擇，所述乘數N不需要從IVC和qp計算且可簡化為特殊細胞培養物的合理目標效價。闡述IVC和qp計算以及合理N和M值的進一步選擇的預計實例作為實例5在下文中提供。如本文所用"細胞群細胞群"、"細胞密度"和類似詞組是指一群細胞。舉例來說，細胞群細胞群可指細胞沉淀物。如本文所用"期望細胞群細胞群"及類似詞組是指實踐人員期望在細胞培養物中獲得的一群細胞，例如，細胞沉淀物。如本文所用"細胞群細胞群單位"及類似詞組反映表示細胞群細胞群的許多方式，例如，細胞數目、細胞密度、細胞體積、堆積細胞體積、細胞干重等。一名所屬領域的技術人員會知道對于特定實驗條件來說如何最方便或適當地表示細胞群細胞群單位等。一名所屬領域的技術人員還應理解隨細胞群細胞群單位而定，期望細胞群細胞群乘數M(即，期望細胞群細胞群峰值單位)可通過期望峰值細胞數目、期望峰值細胞密度、期望峰值細胞體積、期望峰值堆積細胞體積、期望峰值干重等來表示。在一個本發明實施例中，通過細胞密度表示細胞群細胞群單位且通過期望峰值細胞密度表示期望細胞群細胞群。在另一實施例中，通過細胞干重或質量表示細胞群細胞群單位。經脫水細胞群細胞群基本上是由存于此細胞群細胞群中的所有蛋白、碳水化合物、脂質和核酸構成。因此，氨基酸濃度X可以實驗方式測定，通過首先旋動已知數目的細胞以形成細胞沉淀物，對所述細胞沉淀物進行干燥且接下來將經干燥沉淀物暴露于酸水解，借此使所述細胞沉淀物的細胞蛋白溶解以產生個別氨基酸，隨后通過氨基酸分析儀定量所述氨基酸(參見，例如，實例l)。此提供給定數目細胞的氨基酸濃度X，隨后使用M，期望峰值細胞密度的乘數將所述氨基酸濃度X轉化成期望峰值細胞密度的氨基酸要求。在表1中，15x1(^個細胞/mL期望峰值細胞密度所需細胞培養基的總氨基酸濃度(第5列)可通過將1(^個細胞/mL所需氨基酸濃度X(第3列)乘以乘數M來確定，其中Md5。因此，在本發明的一些代表性實例中，所述細胞群細胞群單位是10S個細胞/mL。另一選擇，例如，對于已知可能會降解的氨基酸來說，在上文等式中所用氨基酸濃度X可從文獻值確定，例如，妮柏格(Nyberg)等人(1999)f激^^^f欽^T覆(^'ofec/mo/.62:324-35;納多(Nadeau)等人(2000)2:277-92;及伯納里斯(Bonarius)(1996)生物技術生物工程(^'o欣/mo/.說oe叫乃0:299-318，或揭示于所述出版物或所屬領域已知的類似出版物中的方法。當期望細胞群細胞群的乘數M代表期望峰值細胞密度時，M可選擇為(例如)特定細胞系的峰值密度，即所述細胞系生產率達最大時的密度，或細胞系在特定時期時基于具體生長速率的預測密度。細胞維持所需細胞培養基的氨基酸濃度Y是期望細胞群細胞群(例如，期望峰值細胞密度)所需氨基酸濃度的百分比。在一個本發明實施例中，維持要求可介于期望細胞群要求的0%與300%之間，此可在無營養素引發毒性風險的情況下提供足夠營養素以供細胞使用。在另一本發明實施例中，維持要求可介于期望細胞群要求的0%至150%之間，此可在無營養素引發毒性風險的情況下提供足夠營養素以供細胞使用。維持要求隨著培養時程增加而增加(例如，對于21天培養來說維持要求為100-150%)。在表1中，細胞維持所需細胞培養基的氨基酸濃度(第6列)可通過將期望峰值細胞密度所需氨基酸濃度(第5列)乘以細胞維持因數Y來確定，在此代表性實例中，所述細胞維持因數Y是100呢，從而可獲得延長的培養期。對于不同的細胞(和不同的細胞系)來說，維持因數Y會有所不同，此隨細胞在培養物中的獨特代謝需求而定。而且，細胞在培養物中的維持要求也會因在過程中的變動(例如，接種密度、培養時程、溫度轉變的時間等)而有所不同。作為初始指導，人們可(例如)在第0至5天為培養物提供0%維持(每日)，在第6至10天為培養物提供3%至5%維持(每日)，及在第ll至21天為培養物提供7%至10%維持(每日)。對于大于21天的過程來說，對那些額外天數可提供2%至5%維持(每日)培養物。一名普通技術人員會了解調整維持因數Y以優化密度和效價僅為常規反復試驗的問題。依據細胞維持要求調整氨基酸濃度對于增加存活率及細胞培養物生產率來說十分重要且因此是本發明的一個重要方面。舉例來說，依據細胞維持要求調整氨基酸濃度能夠使所述細胞培養物持續更高細胞密度、細胞存活率并產生更高多肽效價(參見，例如，實例6)。一旦確定期望1)細胞群(第5列)；2)細胞維持(第6列)；和3)對于目標效價來說的多肽生產(第4列)的氨基酸要求，就可獲得所述目標細胞培養物的總氨基酸濃度計算值。在表1中，目標細胞培養物所需細胞培養基的總氨基酸濃度計算值(第7列)可通過將在10g/L效價下相關多肽所需細胞培養基的氨基酸濃度(第4列)、15x106個細胞/mL期望峰值細胞密度所需細胞培養基的氨基酸濃度(第5列)、及選定細胞維持水平所需細胞培養基的氨基酸濃度(第6列)加合來確定。一旦按照上文所述獲得目標細胞培養物所需細胞培養基的總氨基酸濃度計算值，就可通過基線因數F將所述值調整到期望細胞培養基氨基酸濃度A，此會產生氨基轉移的驅動力，例如，細胞群轉移所需額外氨基酸、驅動轉運跨過細胞膜所需額外氨基酸等。此經調整的數值A在本文中稱作"基線調整的氨基酸濃度"或"優化濃度"。經基線調整的氨基酸濃度A表示會遞送到培養物中且相對于培養物最終體積表達的累積氨基酸總量，所述培養物最終體積包括起始培養基的體積加上灌注或補料分批培養的任何補料的體積。將總氨基酸濃度調整到基線調整的氨基酸濃度是本發明的一個重要方面，這是因為此容許更高細胞存活率、細胞密度和多肽效價(參見，例如，實例6)。可將細胞培養基的總氨基酸濃度計算值增加高達2007。的基線因數F可介于1(0%增力口)至3(200%增力口)之間。在一個本發明實施例中，F的范圍是介于1與L5之間。在另一本發明實施例中，低于1的F值可通過改良細胞培養基的總氨基酸濃度計算值而偏置(表l，第7列)，此可通過改良期望細胞群所需氨基酸濃度、細胞維持所需氨基酸濃度及/或引入相關多肽中所需氨基酸濃度來實現。舉例來說，0.5基線因數可通過將細胞培養基的總氨基酸濃度計算值增加(例如)兩倍(或更多倍)而偏置，此可通過改變M、X、N、P及/或Y來實現。在表1中，目標效價和期望峰值細胞密度所需細胞培養基的經基線調整氨基酸濃度A(第8列)可通過將細胞培養基的總氨基酸濃度計算值(第7列)乘以基線因數F來確定，所述基線因數F在表1的代表性實例中為1.3(對應于30%增加，相對于細胞培養基的總氨基酸濃度值來說)。含有基線調整濃度A的氨基酸的培養基在本文中稱作"期望細胞培養基"。因此，"期望細胞培養基"表示具有基線調整濃度A的目的培養基(goalmedium)。此培養基包含至少一種通過上述等式確定濃度的氨基酸。優選地，所述期望細胞培養基含有一種以上通過上述等式確定濃度的氨基酸。更優選地，所述期望細胞培養基含有至少12種通過上述等式確定的經調整濃度的氨基酸，例如，經調整濃度的精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、和纈氨酸。一名所屬
技術領域：
的人員應理解，期望細胞培養基的經基線調整氨基酸濃度A可通過許多方式來獲得，所述方式包括但不限于分別添加各氨基酸、添加蛋白胨或其它蛋白水解產物及/或通過向起始細胞培養基(或起始細胞培養基混合物，例如，培養基粉末)中添加另一濃縮細胞培養基(例如，補加細胞培養基(或培養基混合物，例如，培養基粉末)。一名所屬
技術領域：
的人員應理解添加蛋白胨(或其它蛋白水解產物)可通過所選特定蛋白胨產品的氨基酸含量來指導或通過確定由特定蛋白胨所提供氨基酸濃度來指導，例如，一般來說，5g/L蛋白胨可提供約40mM至約50mM的總氨基酸濃度。期望細胞培養基的氨基酸濃度是基于至少一種通過本文所揭示本發明等式確定的基線調整濃度A的氨基酸；然而，此濃度以及所述期望細胞培養基的其它氮基酸濃度可能因受若干因素的影響而與經基線調整氨基酸濃度有所不同。舉例來說，某些氨基酸可能在培養期間產生且因此可保持在低含量。其它氨基酸可基于公開數值(參見，例如，美國公開專利申請案第2006/0121568號)而有所變化。而且，一些氨基酸(例如，甲硫氨酸)可以更大速率被特定細胞類型消耗且因此應添加過量。另一些氨基酸(例如，脯氨酸)為細胞生長和多肽生產提供驅動力(參見實例4)，且這些氨基酸在一些情況下應以比通過上述本發明等式所確定量更高的量提供。另外，如果使用上述等式獲得的濃度被視為具有毒性，那么人們可改良經基線調整氨基酸濃度(例如，考慮絲氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸的含量)。在獲得在期望細胞培養基中所用氨基酸的經基線調整氨基酸濃度A后，依據諸如那些上文所指定因數等因數改變所述經基線調整氨基酸濃度是在一名所屬
技術領域：
人員的知識范圍內。可從(或基于)各來源(例如，美國公開專利申請案第2005/0070013號及第2006/0121568號)來計算額外培養基組份(例如，維生素、鹽、葡萄糖、元素)。而且，可改良使用上述等式所獲得氨基酸的經基線調整氨基酸濃度A以提供相對于另一氨基酸的特定比率(例如，谷酰胺與天冬酰胺的比率)或使其在期望組合濃度范圍內(例如，谷酰胺與天冬酰胺的組合濃度)。舉例來說，已知高天冬酰胺、低谷酰胺培養基結合溫度轉變可促進乳酸吸收，借此對細胞培養物進行解毒(美國公開專利申請案第2006/0121568號)。因此，人們可能希望改良谷酰胺及/或天冬酰胺的基線調整濃度A以獲得最佳比率。應注意，從表l的代表性實例可見，在期望細胞培養基中所用各基線調整的氨基酸濃度的組合濃度較高，即，高于243mM。因此，本文揭示如下發現如果此濃度是基于目標細胞密度和多肽效價的計算氨基酸要求，那么高濃度氨基酸可在無毒性或效價損害的情況下用于期望細胞培養基。在一個本發明實施例中，期望細胞培養基中各氨基酸的組合濃度是介于約120mM與約250mM之間。在其它實施例中，期望細胞培養基中各氨基酸的組合濃度為大于約250mM，例如，約260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或510mM，或任何中間值。用于期望細胞培養基的氨基酸的上述確認基線調整濃度A可用于分批培養、補料分批培養和灌注培養。當用于分批培養時，在期望細胞培養基中所用初始氨基酸濃度是經基線調整的氨基酸濃度A。當用于補料分批培養或灌注培養時，經基線調整氨基酸濃度A表示可遞送給培養物的累積氨基酸總量，其包括起始培養基的體積加上所有補料的體積。因此，對于使用連續補料(例如，在第3-21天補料)或周期性補料(例如，每2-3天補料)的補料分批培養來說，改造起始培養基以使其含有依據等式B-[A-(ZW)]/(1-V)確定的起始氨基酸濃度B，其中Z是補加細胞培養基的氨基酸濃度，且V是占期望細胞培養基體積一定比例的補加培養基體積。獲得起始氨基酸濃度B所需計算的代表性實例提供于下文表2中。在表2中，根據n免補料體積(v^7呢)和補加培養基氨基酸濃度Z(第4列)將一些經基線調整氨基酸濃度A(第2列)轉化成起始培養基氨基酸濃度B(第5列)。在此實例中，改變若干經基線調整氨基酸濃度A(第2列)和起始氨基酸濃度B(第5列)以獲得在第3列和第6列中以粗體顯示的數值。天冬酰胺、門冬氨酸、谷酰胺和半胱氨酸濃度的改良是基于由美國公開專利申請案第2006/0121568號所提議濃度;將甲硫氨酸調整50%以補償其比預測值更高的量的消耗；丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸通過培養物產生(且因此保持在低濃度)；且絲氨酸、酪氨酸和纈氨酸濃度降低至無毒性含量。因此，應理解，所述起始氨基酸濃度B可基于經基線調整氨基酸濃度A或基于改良經基線調整氨基酸濃度。一名所屬
技術領域：
的人員應意識到，在補料分批和灌注細胞培養期間獲得期望細胞培養基所用補加培養基應盡可能的高度濃縮以避免從于其中進行培養的容器(例如，生物反應器或振蕩燒瓶)中溢出及避免稀釋培養基組份。在表2中所述實例中，優選補加培養基表示"補料培養基"，且補料培養基的氨基酸濃度Z陳述于第4列中。然而，可使用任何高度濃縮補加培養基或任何可為起始細胞培養基提供高度濃縮氨基酸的方法，只要可以目標體積達到期望經基線調整的氨基酸濃度A。經常使用為細胞培養物提供高度濃縮氨基酸的所述方法且所述方法為一名所屬
技術領域：
的人員熟知。一名所屬
技術領域：
的人員應理解，起始細胞培養基的起始氨基酸濃度B可通過許多方式來實現，所述方式包括但不限于分別添加各氨基酸、添加蛋白胨及/或其它蛋白水解產物及/或向起始細胞培養基(或起始細胞培養基混合物，例如，培養基粉末)中添加另一濃縮培養基(或培養基混合物，例如，培養基粉末)。一名所屬
技術領域：
的人員還應理解，補加細胞培養基的氨基酸濃度Z可通過許多方式來實現，所述方式包括但不限于分別添加各氨基酸、添加蛋白胨及/或其它蛋白水解產物、及/或向補加細胞培養基(或補加細胞培養基混合物，例如，培養基粉末)中添加另一濃縮培養基(或培養基混合物，例如，培養基粉末)。應注意，從表2的代表性實例可見，在起始細胞培養基中所用各氨基酸的組合濃度較高，即，高于125mM。因此，本文揭示如下發現如果所述起始氨基酸濃度是基于期望峰值細胞密度和期望多肽效價的計算氨基酸要求，那么高濃度氨基酸可在無毒性或效價損害的情況下用于起始細胞培養基。在一個本發明實施例中，各氨基酸的組合濃度是介于約70mM與約510mM之間。在一個本發明實施例中，各氨基酸的組合濃度是介于約120mM與約350mM之間。在另一本發明實施例中，各氨基酸在起始細胞培養基中的組合濃度是介于約70mM與約140mM之間。在另一本發明實施例中，各氨基酸在起始細胞培養基中的組合濃度是大于約140mM。表2:對于10g/L抗體目標效價、15x1(^個細胞/mL期望峰值細胞密度和17%補料來說，起始氨基酸濃度的代表性確定<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如在表3A和表3B中所示，可針對任何期望目標多肽效價和期望峰值(目標)細胞密度計算在期望細胞培養基中所用氨基酸的經基線調整氨基酸濃度A的確定值和在起始細胞培養基中所用起始氨基酸濃度B的確定值。對于補料分批培養來說，大規模培養物的期望峰值細胞密度可介于約3x10e個細胞/mL與約40x1(^個細胞/mL之間。在一個本發明實施例中，期望峰值細胞密度可介于約5xHf個細胞/mL至約20x106個細胞/mL之間。大規模培養的目標效價可介于約3g/L至約25g/L之間。在又一本發明實施例中，大規模培養的目標效價可介于約5g/L至約20g/L之間。舉例來說，在表3中，期望峰值細胞密度介于10x1(^個細胞/mL至15x1(^個細胞/mL之間，且目標效價可在3g/L至10g/L之間變化。表3A:對于各種目標效價(如通過目標多肽效價的乘數，N所表示)和期望峰值細胞密度(如通過期望峰值細胞密度的乘數，M所表示)來說，基線調整的氨基酸濃度A的代表性實例<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表3B:對于各種目標效價(如通過目標多肽效價的乘數，N所表示)和期望峰值細胞密度(如通過期望峰值細胞密度的乘數，M所表示)來說，起始培養基氨基酸濃度B的代表性實例；通過從經基線調整氨基酸濃度扣除補料和其它變化值來確定起始培養<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>使用所述等式確定經基線調整氨基酸濃度并開發大規模多肽生產的期望細胞培養基調配物，本發明者已確認出可獲得高效價和高細胞密度培養物的若干標準。通過在表4中所示數值表示的產生高于5g/L效價的標準包括但不限于下述中的一個或多個.-大于或等于約3mM酪氨酸；介于約7mM與約30mM之間的脯氨酸；介于約7mM與約30mM之間的纈氨酸；介于約7mM與約30mM之間的亮氨酸；介于約7mM與約30mM之間的蘇氨酸；介于約7mM與約30mM之間的賴氨酸；介于約35mM與約150mM之間的亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的組合濃度；占期望細胞培養基中全部必需氨基酸的介于約60%至約80%之間的亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的組合濃度；占期望細胞培養基中全部必需氨基酸的介于約30%至約50%之間的期望細胞培養基中必需氨基酸的組合濃度；及/或介于約75mM與約510mM之間的全部氨基酸組合濃度。表4:對于各種目標效價和期望峰值細胞密度來說，合理設計的培養基的氨基酸含量和關系的代表性實例(如上文所示，多肽效價的基本單位是1g/L，且細胞群的基<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>CHO細胞在各種目標細胞密度(M)、目標效價(N)、細胞維持要求(Y)、和基線調整(F)下的代表性期望細胞培養基。一名所屬
技術領域：
的人員會意識到，本發明的合理設計的培養基可用于生產相關多肽，或可用于并非設計用于多肽生產的細胞培養物。因此，合理設計的培養基可用于所揭示的細胞培養方法中，例如，用于不含改造用于產生外源相關多肽的宿主細胞或并非培養用于產生內源相關多肽的細胞培養物(例如，大規模細胞培養物)的有效生長、復制及/或維持。在此情形中，期望細胞培養基不需要考慮納入相關多肽中所需氨基酸，而是含有基于1)期望細胞群和2)細胞維持所需氨基酸濃度的氨基酸濃度。用于所揭示細胞培養方法的此期望細胞培養基含有依據等式A'=[(M*X)+(Y*M*X)]*F確定的基線調整濃度A'的氨基酸，其中X是每單位細胞群所用氨基酸濃度，M是細胞培養物的期望峰值細胞群(例如，期望峰值細胞密度等)的乘數，Y是細胞維持因數，且F是基線因數。隨后對處于容許細胞在細胞培養物中生長和復制的條件下的細胞培養物提供依據此等式所產生期望細胞培養基。在一個本發明實施例中，所述細胞培養方法使用大規模細胞培養物。在另一本發明實施例中，所述細胞培養方法使用動物細胞。向細胞培養基添加脯氨酸使用本文所揭示合理的培養基設計方法確定了在細胞培養物(例如，大規模細胞培養物)的培養期間維持高脯氨酸含量會達成多肽效價增加及細胞密度增加。此脯氨酸"閾值"介于約1mM至約2mM之間，且脯氨酸在維持上述此閾值的細胞培養物中的含量似乎為產生高細胞密度、高效價大規模細胞培養物的驅動力。令人感興趣的是，脯氨酸驅動的多肽效價和細胞存活率增加同時會增加培養物對額外氨基酸的要求(以滿足提高的消耗速率)，此至少可部分地解釋為什么本文合理設計的培養基調配物含有高濃度的氨基酸。提供細胞培養物制備通過分批和補料分批培養來生產多肽的哺乳動物細胞的各種方法為所屬領域所熟知。如上文所述，可通過許多熟知技術將足以達成表達的核酸(通常為含有編碼相關多肽的核酸及任何以可操作方式鏈接的基因控制元件的載體)引入宿主細胞系中。通常，需篩選細胞以確定那些宿主細胞實際上收納了所述載體并表達相關多肽或蛋白。檢測通過哺乳動物細胞表達的特定相關多肽或蛋白的傳統方法包括但不限于免疫組織化學技術、免疫沉淀技術、流式細胞儀技術、免疫熒光顯微術、SDS-PAGE、西方點漬分析技術、酶聯免疫吸附分析(ELISA)技術、高效液相色譜(HPLC)技術、生物活性分析和親和色譜法。一名普通技術人員可認識到其它適當技術也可檢測經表達多肽或蛋白。如果諸多宿主細胞表達所述相關多肽或蛋白，那么可使用一些或所有列舉技術來確定哪些細胞以最高程度表達所述多肽或蛋白。一旦確認表達相關多肽或蛋白的細胞，就可通用一名普通技術人員熟知的各種方法中的任一種來使所述細胞在培養物中繁殖。表達相關多肽或蛋白的細胞通常可通過使所述細胞在有助于所述細胞生存、生長和存活的溫度和培養基中生長來繁殖。初始培養物可具有任何體積，但經常具有比在相關多肽或蛋白最終生產中所用生產型生物反應器的培養物體積更小的體積，且通常使細胞在接種所述生產型生物反應器之前在大體積生物反應器中傳代若干次。細胞培養物可經攪動或振蕩以增強培養基氧化及營養素向細胞分散。另一選擇或另外，可使用所屬領域熟知的特殊鼓泡裝置來增強及控制培養物氧化。依據本發明，一名普通技術人員應理解，控制或調控細胞培養物的一些內部條件可為有益的，所述內部條件包括但不限于pH(例如，6.6至7.6)、溫度(例如，25。C至42。C)、氧和二氧化碳的含量(例如，02:10%至80%且0)2:7%至15%，在整個培養中)、及摩爾滲透壓濃度(例如，起始摩爾滲透壓濃度為260mOsm/kg至340mOsm/kg)等等。如本文所用術語"接種物"用于指含有表達相關多肽的核酸的細胞體積，其用于接種其中會發生大規模動物細胞培養的生產型容器，例如，生產型生物反應器。在一個本發明實施例中，所述接種物體積占最終體積的約60%至80%。生產型生物反應器的起始細胞密度可由一名普通技術人員選擇。依據本發明，生產型生物反應器的起始細胞密度可低達單一細胞每培養體積。在本發明的優選實施例中，生產型生物反應器的起始細胞密度可介于約0.1xK)S個活細胞/mL至約10x106個活細胞/mL之間且可更高。在接種下一中間或最終生產型生物反應器之前，初始和中間細胞培養物可生長達任何期望密度。在一個本發明實施例中，接種物細胞密度為約0.5-1xl(^個細胞/mL。優選地，大部分細胞在接種前保持活著，但并不需要全部或近乎全部存活。在一個本發明實施例中，可從上清液中取出所述細胞，舉例來說，通過低速離心。在接種下一生物反應器之前還可能需要用培養基洗滌所取出細胞以去除任何不需要的代謝廢物或培養基組份。所述培養基可為先前細胞已于其中生長的培養基或者其可為不同的培養基或由本發明實踐人員選擇的洗滌溶液。隨后將所述細胞稀釋達適當密度以供接種所述生產型生物反應器。可在另一培養基或溶液(例如，起始細胞培養基或期望細胞培養基)中稀釋所述細胞，隨本發明實踐人員的需要和期望或細胞本身的特定要求(例如，倘若細胞擬在接種生產型生物反應器之前短期儲存)而定。初始生長階段一旦按照上文所述接種所述生產型容器，就可使用借助本文所揭示的本發明等式所獲得的期望細胞培養基將動物細胞培養物維持在初始生長階段且在有助于所述細胞培養物生存、生長和存活的條件下。確切的條件可有所變化，隨細胞類型、獲得細胞的生物體、及表達的多肽或蛋白的性質和特征而定。生產型生物反應器可具有適合多肽或蛋白大規模生產的任何體積。在一優選實施例中，生產型生物反應器的體積為至少500升。在其它優選實施例中，生產型生物反應器的體積是1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或更大，或任何中間體積。一名普通技術人員應可認識到且能夠選擇用于實踐本發明的適宜生物反應器。所述生產型生物反應器可由任何有助于細胞生長和存活且不會影響所產生多肽或蛋白的表達或穩定性的材料制成。細胞培養物在初始生長階段中的溫度可主要根據細胞培養物保持存活的溫度范圍來選擇。舉例來說，在初始生長階段期間，CHO細胞在37T:下生長得很好。一般來說，大部分哺乳動物細胞在約35'C至39。C范圍內生長得很好。在一個本發明實施例中，生長階段(第0天至第3天)的溫度是37'C且生產階段(在第3天后)的溫度是31°C。那些所屬領域的普通技術人員應能夠選擇適合細胞生長的溫度，此隨細胞需要和實踐人員的生產要求而定。在一個本發明實施例中，將初始生長階段的溫度維持在單一恒定的溫度。在另一實施例中，將初始生長階段的溫度維持在一溫度范圍內。舉例來說，所述溫度在初始生長階段期間可穩定地升高或降低。另一選擇為，所述溫度可在初始生長階段于各時刻升高或降低不連續的量。一名普通技術人員應能夠確定是否使用單一溫度或多個溫度及是否應穩定地或以不連續的量調整所述溫度。可使所述細胞在初始生長階段期間生長更長或更短的時間，此隨實踐人員的需要和細胞本身的要求而定。在一個實施例中，可使所述細胞生長足以達成占最大活細胞密度給定百分比的活細胞密度的時間，所述最大活細胞密度是細胞在生長不受打擾時會最后達到的活細胞密度。舉例來說，可使所述細胞生長一段足以達成期望活細胞密度的時間，所述期望活細胞密度占最大活細胞密度的1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更大。在另一實施例中，可使所述細胞生長指定時間。舉例來說，隨細胞培養物的起始濃度、細胞生長的溫度、及細胞的固有生長速率而定，所述細胞可生長0天、l天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更多天。在一些情況下，可使所述細胞生長一個月或更長時間。如果細胞在接種生物反應器中于初始生長階段溫度下的生長足以使所述生產型生物反應器在接種細胞時的活細胞密度為最大活細胞密度的期望百分比，那么可使細胞在生產型生物反應器中生長O天。本發明的實踐人員應能夠選擇初始生長階段的時程，此隨多肽或蛋白生產要求和細胞本身的需要而定。細胞培養物在初始培養階段期間可經攪動或振蕩以增強氧化及營養素向細胞分散。依據本發明，一名普通技術人員應理解，控制或調控生物反應器在初始生長階段的某些內部條件可為有益的，所述內部條件包括但不限于pH、溫度、氧化等。舉例來說，可通過提供適量酸或堿來控制pH且可用所屬領域技術人員熟知的鼓泡裝置來控制氧化。轉變培養條件在初始生長階段結束時，可轉變培養條件以便于應用第二組培養條件且在培養中發生代謝轉變。抑制性代謝產物(最值得注意的是乳酸和氨)積聚會抑制生長。可通過(例如)減少乳酸比生產速率與葡萄糖比消耗速率的比率來表征通過(例如)改變溫度、pH、摩爾滲透壓濃度或細胞培養物的化學感應物含量所完成的代謝轉變。在一個非限制性實施例中，通過改變培養物溫度來轉變培養條件。在另一本發明實施例中，在第1至7天發生溫度轉變。在另一本發明實施例中，所述溫度轉變至29。C-32°C。在另一本發明實施例中，在第3天發生溫度轉變且溫度轉變為3rC。關于溫度轉變和代謝轉變的教導可發現于所屬領域中(參見，例如，美國公開專利申請案第US2006/0121568號)。后續生產階段一旦按照上文所論述轉變所述細胞培養條件，就可將所述細胞培養物在后續生產階段中維持在有助于細胞培養物生存和存活且可以足夠(例如，在工業上視為足夠)程度適當表達期望多肽或蛋白的第二組培養條件下。如上文所述，可通過轉變許多培養條件中的一個或多個條件來轉變培養，所述培養條件包括但不限于溫度、pH、摩爾滲透壓濃度、和丁酸鈉含量。在一個實施例中，轉變所述培養物溫度。依據此實施例，在后續生產階段期間，將培養物維持在比初始生長階段的溫度或溫度范圍更低的溫度或溫度范圍。舉例來說，在后續生產階段期間，CHO細胞在肯定介于25'C至35。C之間的溫度下表達重組多肽和蛋白。在一個本發明實施例中，生產階段在第3天后開始。在另一本發明實施例中，生產階段在3rc下進行。如在美國公開專利申請案第US2006/0121568號中所述，可采用多個獨立的溫度轉變來增加細胞密度或存活率或增強重組多肽或蛋白的表達。依據本發明等式，選擇期望細胞群(例如，細胞密度)和生產效價(例如，目標效價)以確立經基線調整氨基酸濃度A和起始氨基酸濃度B。因此，一般來說，將所述細胞維持在后續生產階段直至達到期望細胞密度或生產效價或接近期望細胞密度或生產效價的數值。在一個實施例中，將所述細胞維持在后續生產階段直至重組多肽或蛋白的效價達到最大值。在其它實施例中，可在此時之前收獲培養物，隨實踐人員的生產要求或細胞本身的需要或存活而定。舉例來說，可將所述細胞維持一段足以達到占最大活細胞密度1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更大的活細胞密度的時間。在一些情況下，可能需要使活細胞密度達到最大值且隨后使活細胞密度下降至某一水平，然后收獲所述培養物。在一極端實例中，可能需要使活細胞密度在收獲所述培養物之前接近或達到零。在本發明另一實施例中，使所述細胞在后續生產階段期間生長指定時間。舉例來說，隨細胞培養物在后續生長階段開始時的起始濃度、細胞生長的溫度、及細胞的固有生長速率而定，所述細胞可生長l天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更多天。在一些情況下，可使所述細胞生長一個月或更長時間。本發明的實踐人員應能夠選擇后續生產階段的時程，此隨多肽或蛋白生產要求和細胞本身的需要而定。所述培養時程應有助于確定細胞維持所需氨基酸濃度，其在本發明中可介于細胞群所需氨基酸濃度的(例如)0%至150%之間。在某些情況下，在后續生產階段期間用已經細胞耗盡或代謝的營養素或其它培養基組份補充所述細胞培養物(即，補料給細胞培養物)可為有益的或必需的。舉例來說，用在監測細胞培養物期間觀測到已耗盡的營養素或其它培養基組份補充所述細胞培養物可為有利的(參見下文"監測細胞培養條件"部分)。另一選擇或另外，在后續生產階段之前補充所述細胞培養物可為有益的或必需的。作為非限制性實例，用激素及/或其它生長因子、特殊離子(例如，鈉離子、氯離子、轉離子、鎂離子、和磷酸根離子)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低最終濃度存在的無機化合物)、脂質、氨基酸、或葡萄糖(或另一能量來源)補充所述細胞培養物可為有益的或必需的。可將這些補充組份一次全部添加(即，補加)到細胞培養物中或將所述補充組份分若干次添加到所述細胞培養物中。在一個本發明實施例中，所述補充組份可分多次以成比例的數量提供給細胞培養物。在另一實施例中，可能需要在開始時只提供某些補充組份且在稍后提供其余組份。在又一本發明實施例中，對所述細胞培養物連續地補加這些補充組份。依據本發明，添加到細胞培養物中的總體積最佳應保持在最小量。舉例來說，添加到細胞培養物中的含有補充組份的補加培養基或溶液的總體積可占在提供所述補充組份前的細胞培養物體積的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。因此，應濃縮補加培養基以避免從生物反應器溢出或培養基組份受到稀釋。所述補加培養基以優選方式提供以維持培養物具有相同的pH、溫度等，但相對于起始培養基，營養素濃度升高。在一個本發明實施例中，所述補加培養基是在表2第4列中指定為"補料培養基"的補加培養基。在一個本發明實施例中，用額外氨基酸補充具有起始氨基酸濃度B的細胞培養物以達成經基線調整氨基酸濃度A。在另一本發明實施例中，在第3至21天對所述細胞培養物提供連續補料或在第2至3天提供周期性補料。在另一本發明實施例中，在約第3天至約第20天(對于21天培養來說)以濃注補料(bolusfeeds)進行補加。在另一本發明實施例中，所述補加以周期性補料(periodicfeeds)約每2-3天補加一次。在又一本發明實施例中，補加體積占細胞培養物總體積的約1%至約40%。細胞培養物在后續生產階段期間可經攪動或振蕩以增強氧化及營養素向細胞分散。依據本發明，一名普通技術人員應理解，控制或調控生物反應器在后續生長階段的某些內部條件可為有益的，所述內部條件包括但不限于pH、溫度、氧化等。舉例來說，可通過提供適量酸或堿來控制pH且可用所屬領域熟知的鼓泡裝置來控制氧化。監測細胞培養條件在某些本發明實施例中，實踐人員可發現周期性地監測細胞培養物生長的特定條件是有益的或必需的。監測細胞培養條件可使實踐人員確定所述細胞培養物是否在次佳水平下產生重組相關多肽或所述培養物是否即將進入次佳生產階段。為了監測某些細胞培養條件，可能必需取出若干小培養物等份進行分析。一名普通技術人員應理解此取出可能會對細胞培養物造成污染且應采取適當措施以最小化此污染風險。作為非限制性實例，監測溫度、pH、細胞密度、細胞存活率、整合活細胞密度、乳酸含量、銨含量、摩爾滲透壓濃度、或表達多肽的效價可為是有益的或必需的。一名普通技術人員可利用所屬領域熟知的許多技術來量測這些條件。舉例來說，可使用血球計數器、庫爾特計數器或細胞密度檢查儀(CEDEX③，尹諾沃特斯(Innovatis),馬爾文(Malvern)，PA)測量細胞密度。活細胞密度可通過用錐蟲藍(Trypanblue)對培養物試樣進行染色來測定。因為只有死細胞吸收錐蟲藍(g卩，活細胞排斥所述染劑)，因此可通過計數總細胞數目、用吸收所述染劑的細胞數目除以總細胞數目、并取倒數來確定活細胞密度。HPLC可用于確定乳酸、銨或表達多肽或蛋白的含量。另一選擇，可通過諸如SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色(Coomassiestaining)、西方點漬分析、布氏蛋白定量分析(Bradfordassays)、羅氏蛋白定量分析(Lowryassays)、縮二脲蛋白定量分析(biuretassays)、和紫外線吸收(UVabsorbance)等標準分子生物技術來確定表達多肽或蛋白的含量。監測所述表達多肽或蛋白的轉譯后改造(包括磷酸化和糖基化)也可為有益的或必需的。收獲通過細胞培養產生的多肽隨后可從培養基或從細胞提取物純化通過所述細胞培養產生的相關多肽以用于各種應用中。可從條件培養基純化所述多肽的可溶形式。可通過從所述表達細胞制備總膜部分并用諸如TRITONX-100(EMD生物科學，圣地亞哥，CA)等非離子型清潔劑提取所述膜來純化所述多肽的膜結合形式。可通過使宿主細胞溶解(借助機械力、帕爾轟擊(Parr-bomb)、超聲波處理、清潔劑等)，通過離心去除細胞膜部分并保留上清液來制備胞質蛋白或核蛋白可使用那些所屬
技術領域：
人員已知的其它方法來純化所述多肽。舉例來說，可使用市售蛋白濃縮過濾器(例如，AMICON⑧或PELLICON⑧超濾設備(密理博(Millipore)，(比勒里卡)Billerica，MA))來濃縮通過所揭示方法產生的多肽。在此濃縮步驟后，可將濃縮物應用于純化培養基(例如，凝膠過濾培養基)中。另一選擇，可采用陰離子交換樹脂(例如，MonoQ柱，阿莫仙生物科技(AmershamBiosciences),皮斯卡塔韋(Piscataway)，NJ);所述樹脂含有具有側鏈二乙基氨基乙基(肝素-TOYOPEARL⑧或汽巴藍(Cibacronblue)3GASEPHAROSE(東曹生物科技(TosohBiosciences)，圣弗朗西斯科，EAE)或聚乙烯亞胺(PEI)基團的基質或底物。純化所用基質可為丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或通常用于蛋白純化的其它類型基質。另一選擇，可使用陽離子交換步驟來純化蛋白。適宜陽離子交換劑包括各種包含磺基丙基或羰基甲基的不溶性基質(例如，S-SEPHAROSE⑧柱，西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯(St.Louis)，MO)。從培養上清液純化多肽還可包括一個或多個使用親和性樹脂的柱步驟，例如，伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖、AF-HEPARIN650、肝素-TOYOPEARL⑧或汽巴藍(Cibacronblue)3GASEPHAROSE(東曹生物科技(TosohBiosciences),圣弗朗西斯科(SanFrancisco),CA);使用諸如苯基醚、丁基醚或丙基醚等樹脂的疏水作用色譜柱；或使用經標記蛋白的抗體的免疫親和性柱。最后，可采用一個或多個高效液相色譜(HPLC)步驟來進一步純化所述蛋白，所述高效液相色譜(HPLC)步驟采用疏水性HPLC基質，例如，具有側鏈甲基或其它脂肪族基團的硅膠(例如，Ni-NTA柱)。另一選擇，所述多肽可以方便純化的形式以重組方式表達。舉例來說，所述多肽可作為與諸如麥芽糖結合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、或硫氧化還原蛋白(TRX)等蛋白的融合體加以表達。表達和純化融合蛋白的試劑盒可分別從新英格蘭生物實驗室(NewEnglandBioLabs)(貝弗莉(Beverly)，MA)、法瑪西亞(Pharmacia)(皮斯卡塔韋(Piscataway),NJ)和英杰生命技術公司(卡爾斯巴德，CA)購得。所述蛋白還可用小抗原決定部位(例如，His、myc或Flag標簽)標記且接下來使用所選抗原決定部位的特異性抗體來確認或純化。常見抗原決定部位的抗體可從許多商業來源獲得。作為傳統色譜純化模式(例如，流通和結合-洗脫色譜純化模式)的替代模式，通過本發明方法所產生多肽可通過以弱分配模式操作色譜純化柱來純化，此為一種其中至少一種在制劑中所含產物與至少一種污染物或雜質二者均結合色譜樹脂或基質的技術。在弱分配模式中，至少一種雜質比所述多肽產物與所述基質結合更緊密；且隨著加載(加載物流體)繼續，未結合多肽產物選擇性地經過所述基質且從柱流出物回收所述未結合多肽產物。此純化可大大地減少雜質的量并達成高產物回收率。此純化可使用所屬領域已知的基質和樹脂來實現，包括但不限于帶電離子交換型基質、疏水作用色譜樹脂、固定化金屬親和色譜樹脂、和羥基磷灰石樹脂。在至少一個實施例中，隨著加載物流體經過基質/樹脂，雜質/污染物在弱分配條件下被去除，所述基質/樹脂結合至少2.8mg產物/mL基質/樹脂。在至少另一個實施例中，隨著加載物流體在由至少為0.1的分配系數界定的作業條件下經過基質/樹脂，雜質/污染物在弱分配條件下被去除。從含有基質/樹脂的柱的流出物回收純化產物。表5概述在流通(FT)模式、結合-洗脫(B-E)模式、和弱分配(WP)模式的各特征之<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>分配系數(Kp)是吸附產物濃度(Q)與產物在溶液中濃度(C)的比率；因此，弱分配模式的Kp應為流通模式Kp與結合-洗脫模式Kp之間的中間值，例如，介于約0.1與20之間。為了確定合適的條件(例如，鹽、緩沖液、pH等)，對于弱分配純化模式來說，可能實施高高通量篩選或分批純化篩選研究。因此，一名所屬領域的技術人員能夠根據作業條件確定產物分配系數Kp(參見實例7.1)。使用弱分配模式的純化方法詳細地闡述于美國專利申請案第11/372,054號及第11/510,634號中，所述兩個案件的全文均以弓I用的方式納入本文中。可采用某些或所有上述純化步驟的各種組合或所述純化步驟與其它已知方法來純化通過本文所述大規模動物細胞培養方法和培養基產生的相關多肽。含有通過細胞培養物產生的多肽的醫藥組合物上述細胞培養基(例如，大規模細胞培養基)和培養細胞的方法可提供相關多肽，例如，抗體、可溶性受體、融合蛋白等。通過所揭示細胞培養方法及借助本文所揭示新穎培養基和相關方法產生的多肽(包括抗體及其片段)可用于活體外、活體內或納入醫藥組合物中及投與有需要的個體(例如，人類個體)。若干考慮確定是否投與本發明多肽的藥物基因組學方法為一名所屬領域的技術人員所熟知且包括全基因組關聯、候選基因方法和基因表達譜。本發明的醫藥組合物可經調配以適應其預期投藥途徑(例如，口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載劑)。投藥途徑的其它非限制性實例包括非經腸(例如，靜脈注射)、皮內、皮下、經口(例如，吸入)、經皮(外敷)、經粘膜、及經直腸投藥。適應各期望途徑的醫藥組合物在所屬領域中為眾人所熟知。本發明的多肽在與醫藥上可接受的載劑組合時可作為一種醫藥組合物使用。此組合物除了含有本發明多肽外還含有載劑、各種稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩定劑、增溶劑、及所述領域熟知的其它材料。術語"醫藥上可接受的"意指不會影響具生物活性活性成份的效能的無毒性材料。載劑的特征應取決于投藥途徑。本發明的醫藥組合物還可含有用于治療特定耙向病癥的額外治療因子或治療劑。舉例來說，用于治療2型糖尿病的醫藥組合物還可包括口服抗糖尿病藥劑。所述醫藥組合物可含有血栓溶解因子或抗血栓形成因子，例如，纖溶酶原激活劑和第八因子(FactorVIII)。所述醫藥組合物可進一步含有消炎劑。所述額外因子及/或藥劑可包括于醫藥組合物中以與本發明多肽產生協同作用或者以最小化由本發明多肽造成的副作用。本發明醫藥組合物可呈脂質體形式，其中本發明多肽與諸如脂質等兩性劑以及其它醫藥上可接受的載劑組合，所述兩性劑可以聚集形式作為膠團、不溶性單層、液晶或薄層存于水性溶液中。適用于脂質體調配的脂質包括但不限于單甘油酯、二甘油酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽汁酸等。如本文所用術語"治療有效量"意指醫藥組合物或方法的各活性組份的總量足以展現富有意義的患者受益，例如，改善所述病況的病癥、治愈所述病況或增加所述病況的治愈率。當應用于單獨投與的個別活性成份時，所述術語是單獨指此成份。當應用于組合時，所述術語是指可產生治療效果的各活性成份的組合量，無論其是組合投與、依序投與還是同時投與。在實踐本發明治療方法或用途中，將治療有效量的本發明多肽投與個體，例如，哺乳動物(例如，人類)。本發明的多肽可依據本發明方法單獨或結合其它療法投與。當與一種或多種藥劑一起投與時，本發明的多肽可與第二藥劑同時或依序投與。如果依序投與，則主治醫生可確定投與本發明多肽以及其它藥劑的適當順序。當經口投與治療有效量的本發明多肽時，所述結合劑可呈片劑、膠囊、粉劑、溶液或酏劑形式。當以片劑形式投與時，本發明的醫藥組合物可額外含有諸如明膠等固體載劑或佐劑。所述片劑、膠囊和粉劑含有約5%至95%的結合劑且優選地，含有約25%至90%的結合劑。當以液體形式投與時，可添加液體載劑，諸如水、石油、動物來源油或植物來源油，諸如花生油(當心花生過敏)、礦物油、大豆油或芝麻油、或合成油等。液體形式的醫藥組合物可進一步含有生理鹽水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇等二醇。當以液體形式投與時，所述醫藥組合物含有約0.5重量％至約90重量％的結合劑且優選地，含有約1重量％至約50重量％的結合劑。當通過靜脈內注射、表皮注射或皮下注射投與治療有效量的本發明多肽時，本發明的多肽可呈非經腸可接受的無熱原水溶液形式。那些所屬領域的技術人員在考慮pH、等滲性、穩定性及類似特性后可制備所述非經腸可接受的蛋白溶液。用于靜脈內注射、表皮注射或皮下注射的優選醫藥組合物除含有本發明多肽外還應含有等滲媒劑，例如，氯化鈉注射液、林格注射液(Ringer'sinjection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸化林格注射液、或所屬
技術領域：
已知的其它媒劑。本發明的醫藥組合物還可含有穩定劑、防腐劑、緩沖劑、抗氧化劑或任何其它為那些所屬領域的技術人員己知的添加劑。本發明多肽在本發明醫藥組合物中的量將取決于所治療病況的性質和嚴重程度以及患者以前所接受治療的性質。最終，主治醫師將決定用于治療各個患者的本發明醫藥組合物或多肽的量。最初，主治醫師將投與低劑量的本發明醫藥組合物或多肽并觀測患者的反應。可投與較大劑量的本發明醫藥組合物或多肽直到對于該患者獲得最佳治療效果為止，且自此時起一般不再增加劑量。預計，用于治療有需要的個體的各種醫藥組合物應含有約0.1嗎至約100mg本發明多肽/kg體重。使用本發明醫藥組合物的靜脈內(i.v.)療法的時程可有所變化，此取決治療疾病的嚴重性及各個患者的情況和潛在種特異性反應。預計，每次施用本發明醫藥組合物或多肽的時程可在(例如)1-12小時、6-18小時或12-24小時連續或間歇靜脈注射投藥范圍內。還預計，使用本發明醫藥組合物可實現皮下注射(s.c.)療法。所述療法可每日、每周或(更優選地)每兩周或每月施用一次。最后，當使用本發明醫藥組合物時主治醫生會確定適當的i.v.或s.c.療法或小分子療法的時程及所述療法的投藥時間。本申請案所列舉的所有參考文獻、專利、專利申請案和出版物的全文均以引用的方式納入本文中。實例闡述下列實例以有助于理解本發明，但并非意欲且不應詮釋為以任何方式限制本發明的范圍。所述實例并不包括諸如重組DNA技術等習用方法的詳細說明。所述方法為那些所屬領域的普通技術人員所熟知。實例1定量CHO細胞的氨基酸組成為了定量抗體-表達CHO細胞和重組蛋白-表達CHO細胞的氨基酸組成，g卩，每一氨基酸相對于細胞群(生物質)氨基酸總量的摩爾百分比，實施下列程序。簡單地說，使過度表達抗體或重組蛋白(更具體來說，抗-IL-22抗體(重組人類抗-IL-22抗體)、Myo-029抗體(抗-GDF8IgGl單克隆抗體)和重組人類BMP-2)的3種CHO細胞系在搖瓶中生長l天(BMP-2)或3天(Myo-029和抗-IL-22)。在最后一天，收獲培養物并旋轉細胞以達106個細胞/就濃度。用1XPBS將含有106個細胞的沉淀物洗滌兩次并將所述沉淀物重新懸浮于500nL5NHC1中。將含有細胞的懸浮液在100'C下加熱24小時，在此時對所述懸浮液進行真空離心。將所得沉淀物重新懸浮于500pLPBS中并使用氣相或液相色譜實施氨基酸分析。酸解確定了甲硫氨酸和色氨酸兩者在酸解期間會降格；因此，這些氨基酸在實例2和實例3中的濃度是基于CHO細胞的文獻值。另外，已確定了谷酰胺和天冬酰胺在水解期間會轉化成其酸性形式，分別為谷氨酸和天冬氨酸；因此，根據在文獻中所報告谷酰胺/谷氨酸和天冬酰胺/天冬氨酸比率調整這4種氨基酸在實例2和實例3中的濃度。除此以外，確定了這些CHO細胞系擁有相似的氨基酸組成及與其它哺乳動物細胞接近匹配的報告數值(數據未示出)(參見布納里斯(Bonarius)(1996)生物技術生物工程rBZofec/mo/.5/oe"gJ50:299-318)。實例2使用合理設計的培養基以32%體積補料在CHO細胞(細胞系l)中達成15x106個細胞/mL期望峰值細胞密度和9g/L目標抗-IL-22抗體效價實例2.1:合理設計的培養基使用本文所揭示等式，確定在CHO細胞系1中產生9g/L抗-IL-22抗體，15x106個細胞/mL所需氨基酸的經基線調整的氨基酸濃度A(表6，第2列)(細胞維持設定為50%，S卩，Y=0.5)。調整各種氨基酸的經基線調整的氨基酸濃度A(表6，第2列)以獲得如在表6第3列中所示改良經基線調整總氨基酸濃度。進行下列調整依據美國公開專利申請案第US2006/0121568A1號設定Asn、Asp和Gin的含量；2)由于Ala、Glu、Gly是由細胞培養物產生，因此應將其濃度調整到較低數值；3)鑒于胱氨酸也用于補加培養基的事實，調整了Cys的含量且將胱氨酸的培養基數值設定為在美國公開專利申請案第US2006/0121568A1號中所述數值；4)鑒于使用含有設定氨基酸組成的補料粉末來制造期望細胞培養基的事實，Arg、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe的濃度比經基線調整氨基酸濃度A高20%至100%，因而不可能達成精確匹配。從如在表6第3列中所示改良經基線調整總氨基酸濃度計算起始培養基氨基酸濃度B(表6，第4列)。表6:期望細胞培養基調配<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實例2.2:響應合理設計的培養基的細胞密度和抗體效價細胞系1細胞(抗-IL-22-表達CHO細胞)是從含有第3天培養物的搖瓶獲得且其在第0天以0.7x10S個細胞/mL接種到存于1L生物反應器(Applikon2L,(阿普利肯公司(Applikonlnc)，福斯特市(FosterCity)，CA))中的起始細胞培養基中。在第3天(約80小時)，將溫度從37。C轉變到3rC且在第3天、第5天、第6天、第7天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第17天、第20天分別以3.75體積％、4體積％、4體積％、9體積％、2體積％、1體積％、1體積％、1體積％、3體積％、2體積％和1體積％添加補料培養基(參見表2的第4列)以獲得含有如在表6，第3列中所示氨基酸濃度的期望細胞培養基。將細胞培養物保持在pH7.0下、于30%溶解氧含量中和在200rpm下攪動。每日采取試樣以測試細胞密度(CEDEX⑧細胞計數儀器(尹諾沃提斯(Innovatis),馬爾文(Malvern)，PA))、存活率(CEDEX③)和某些代謝產物的含量(諾瓦生物剖面分析儀(NovaBioProfileAnalyzer),諾瓦生物醫學公司(NovaBiomedicalCo叩eration)，沃爾瑟姆(Waltham)，MA)。將離心后培養基保存在-80°C下，以供使用蛋白AHPLC進行抗體效價分析。結果示于圖1和圖2中。如從圖1中可見，在培養第11天時達成最高細胞密度(約11x1(^個細胞/mL)，此后細胞密度降低。在培養第21天時獲得最高抗體效價(約7g/L)。因此，可使用所述合理設計的培養基來產生高細胞密度和高抗體效價。實例3使用合理設計的培養基以33%體積補料可在CHO細胞(細胞系2)中達成15x106個細胞/mL期望峰值細胞密度和10g/L目標抗-IL-22抗體效價實例3丄合理設計的培養基使用本文所揭示等式，確定15x10e個細胞/mL和10g/L抗-IL-22抗體(上文所述)所需氨基酸的經基線調整氨基酸濃度A(細胞維持設定為50免，S卩，Y=0.5)。按照在實例2中所述調整各種氨基酸的經基線調整氨基酸濃度A(表7，第2列)以獲得如在表7的第3列中所示改良經基線調整的總氨基酸濃度。另外，對于此培養基調配來說，從現存粉末以固定組成制備起始細胞培養基和補料培養基且因此不可能實現確切的匹配。從如在表7第3列中所示改良經基線調整的總氨基酸濃度計算起始培養基氨基酸濃度B(表7，第4列)。表7:期望細胞培養基調配<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實例3.2:響應合理設計的培養基的細胞密度和抗體效價細胞系2細胞(抗-IL-22-表達CHO細胞)是從含有第3天培養物的搖瓶獲得且其在第0天以0.7x106個細胞/mL接種到存于1L生物反應器(Applikon2L)中的起始細胞培養基中。在第3天(約80小時)，將溫度從37'C轉變到3rC且用自動補加泵連續添加補料(1.S體積％/天)以獲得含有如在表7，第3列中所示氨基酸濃度的期望細胞培養基。將細胞培養物維持在pH7.0下、于30免溶解氧含量中和在200rpm下攪動。每日采取試樣以測試細胞密度(CEDEX⑧細胞計數儀器)、存活率(CEDEX⑧)和某些代謝產物含量(諾瓦生物剖面分析儀(NovaEnzymaticanalyzer))。將離心后培養基保存在-80°C下以供使用蛋白AHPLC進行抗體效價分析。結果示于圖3和圖4中。如從圖3中可見，在培養第10天時達成最高細胞密度(超過12x1(f個細胞/mL)，此后細胞密度降低。在培養第19天時獲得最高抗體效價(超過10g/L)。因此，可使用所述合理設計的培養基來產生高細胞密度和高抗體效價。實例4脯氨酸添加對細胞培養效能的影響在pH受控搖瓶(工作體積為100mL的500mL燒瓶)中培養產生抗-IL-22抗體的CHO細胞并維持在~100卬m的振蕩器上溫度受控的7%C02培養箱中。以0.7x106個細胞/mL接種細胞。培養時程為18天。在前3天，將細胞維持在37'C下，此后將溫度轉變到3rC以進行其余培養。在前3天用1M碳酸氫鈉控制pH。細胞培養基是由基于傳統細胞培養要求的培養基(稱為"傳統培養基")和合理設計的培養基(即，借助本文所揭示合理的設計調配的培養基，稱為"合理設計的培養基")構成以達成10x1(^個細胞/mL和10g/L抗體。在這兩種調配物之間值得注意的主要差別在于若干氨基酸(PRO、THR、GLY、TYR、TRP、VAL和PHE)在"合理設計的培養基"中比在"傳統培養基"中的濃度更高。所提出第3個條件是需向傳統培養基中額外添加3.7mM脯氮酸以獲得在"合理設計的培養基"中的脯氨酸含量，稱為"傳統培養基+脯氨酸"。這些調配物示于下表8中。以23體積％總量向培養物中添加惠氏(Wyeth)室內補料培養基("補料培養基"，參見表2)，包含在第3-4天、第9-14天、第17天的2%每日補料、第5-6天的1%每日補料和在第7天的3%每日補料。表8:用于脯氨酸研究的培養基調配物<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>這些實驗的結果示于圖5-7中。向傳統培養基添加脯氨酸，即，"傳統培養基+脯氨酸"(圖5)在14天中產生與"合理設計的培養基"相等的抗體產量。如在圖6中所示，將3種培養基全部維持在高細胞密度，其中在第12天出現最高密度。如在圖7中所示，將3種培養基全部保持在高細胞密度，其中與"傳統培養基"和"傳統培養基+脯氨酸培養基"的培養物相比，"合理設計的培養基"的培養物在第15-18天維持更大存活率。由于各自含有一合理設計濃度的甘氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸的各種其它培養基不產生可產生比"傳統培養基"更高抗體效價(數據未示出)的細胞培養物，因此脯氨酸用作達成高效價所需速率限制氨基酸。此例示于圖8A-E中，所述圖8A-E展示到第14天時"傳統培養基+脯氨酸"中的許多氨基酸達極低含量(注意酪氨酸耗盡)，因此可防止這些氨基酸被進一步納入抗體中。此結果還可在效價圖(圖5)中觀測到，隨著"傳統培養基+脯氨酸"的斜率在第14天后降低，同時"合理設計的培養基"在18天中維持抗體生產，所述"合理設計的培養基"含有較高含量的其它氨基酸。令人感興趣的是，"傳統培養基"中的脯氨酸濃度從未降低到低于1mM(圖8A);然而，脯氨酸對納入抗體中全部氨基酸的影響在第11天后降低。此發現表明存在脯氨酸閾值，即，在整個培養期間必須將脯氨酸濃度維持在高于lmM。實例5預言性實例用于新穎細胞系的優化細胞培養基本文所揭示培養基設計方法可用于任何細胞培養物，包括使用新穎細胞/細胞系的細胞培養物。與新穎細胞系一起使用的優化培養基可含有至少一種依據等式A-[(M承X)+(NfP)+(Y承M沐X)PF確定的經基線調整氨基酸濃度A的氨基酸。當將上述等式應用于新穎細胞培養物時，乘數M可選自(例如)1-20乂106個細胞/mL。一名所屬
技術領域：
的人員應能夠通過將在生長階段期間的最大細胞密度乘以二來計算有用的M數值，此最大細胞密度可基于生長速率來計算。當將上述等式應用于新穎細胞培養物時，可通過(例如)將IVC乘以細胞qp來計算乘數N。一名所屬
技術領域：
的人員應能夠按照在標題為"合理的培養基設計和調配"部分中所述方法通過評定生長特性來計算所述IVC。一名所屬
技術領域：
的人員應能夠通過測量基于每一細胞的抗體或重組蛋白產量來計算所述qp。當將上述等式應用于新穎細胞培養物時，可通過開始使用Y-1(g卩，期望細胞群所需100%氨基酸)且隨后推敲Y值(增高或減低)來估計細胞維持因數Y。當將上述等式應用于新穎細胞培養物時，可通過開始使用F-1.3(即，30%額外氨基酸)且隨后推敲F數值(增高或減低)來估計基線因數F。實例6維持因數和基線因數對細胞培養效能的影響為了證明維持因數Y和基線因數F對于細胞培養效能來說是重要的/關鍵的，以0.7x1()S個細胞/mL接種抗-IL-22-表達CHO細胞并將其在2L生物反應器中培養21天，pH設定值為7.0且溶解氧(DO)設定值為30呢。借助2NNa2C(VNaHC03控制pH且通過通入空氣(含有7。/。C02)來控制DO。在前3天，培養物溫度為37"C且在3天后培養物溫度轉變為3rc并保持在3rc下直到培養結束。(l)在含有目標蛋白效價和期望峰值細胞密度(但不考慮維持因數或基線因數)所需氨基酸的培養基中(即，"不涉及維持因數和基線因數的合理設計的培養基")或在(2)"合理設計的培養基"中將細胞培養21天。如在圖9和圖10中所例示，不考慮維持因數和基線因數的培養基展現存活率明顯降低(在細胞培養第21天時幾乎接近0%)及細胞密度明顯降低。而且，圖11表明在細胞培養第21天時，此相同培養基只能夠支持5g/L抗體效價。相比之下，合理設計的培養基(包括維持因數和基線因數)展現更高存活率、細胞密度和抗體效價(圖9-11)。在細胞培養第21天時，合理設計的培養基能夠支持10g/L抗體效價。這些發現表明在確定期望細胞培養基的氨基酸濃度時考慮維持因數和基線因數可改善細胞效能，如通過細胞存活率、細胞密度和多肽效價測量的。實例7使用陰離子交換型色譜以弱分配模式進行多肽純化實例7丄進行高通量篩選以確立弱分配和流通條件首先實施初步篩選研究，此確定了在各種溶液條件下的分配系數及/或結合樹脂的產物濃度，從而界定對于Mab-AAB、相關多肽和TMAE-HiCap(M)培養基來說弱分配(WP)模式和流通(FT)模式的作業區。此篩選改變了氯化鈉濃度和pH以確定其對Mab-AAB和過程相關雜質(蛋白A和HCP)與TMAE培養基的結合程度的影響。使用蛋白A酶聯免疫吸附分析(ELISA)來測量蛋白A殘留物在測試試樣中的含量。使用分析型大小排除色譜(SEC)分析測量高分子量聚集體的量。使用HCPELISA測量宿主細胞蛋白(HCP)的含量。所有篩選和柱研究均在室溫下進行。向96孔過濾板的每個孔中添加50pLTMAEHiCap基質。使每個孔在由50mM甘氨酸和可變量的Tris緩沖液(取決于經中和以達在表9中所指明pH所需量)和氯化鈉(在表10中指明)組成的溶液中達平衡。pH介于7.6至9.0之間且氯化鈉介于0mM至80mM之間。使用自動移液系統(帝肯(Tecan)100RST)稀釋每行中所用緩沖溶液。用經HCl酸化至pH3.0的500mM甘氨酸制造用于緩沖劑的儲備溶液且接下來用2MTrisBase中和達在表9中所指定pH值。此滴定所產生Tris含量取決于緩沖劑的pH。在對儲存緩沖劑濃度稀釋1倍至10倍(其對應于通過自動移液系統所實現的稀釋)下測量緩沖液pH。作為甘氨酸酸化至pH3.0的結果，所述緩沖劑對最終溶液貢獻約10mM離子強度。對樹脂實施兩次加載(加載物流體)攻擊5mg/mL以測量分配系數Kp;及122mg/mL以測量樹脂去除雜質和結合產物的能力，Q，用濃度大約等于柱加載物濃度的蛋白溶液平衡。表9:在每個孔中的緩沖液類型和pH目標所有柱A50mM甘氨酸，8.8mMTris,pH7.6B50mM甘氨酸，13.6mMTris，pH7.8C50mM甘氨酸，16.0mMTris,pH8.0D50mM甘氨酸，19.6mMTris,pH8.2E50mM甘氨酸，28.4mMTris，pH8.4F50mM甘氨酸，37.2mMTris,pH8.6G50mM甘氨酸，64.0mMTris,pH8.8H50mM甘氨酸，lOOmMTris,pH9.0表10:在每個孔中的NaCl含量(以mM計)和蛋白攻擊(mg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在高通量篩選的第一階段，使每個孔在如在表9和表10中所述NaCl和pH條件下以6:1相體積比率(300pL溶液50^L樹脂)達平衡。將該過濾板搖動20分鐘以使其達平衡。隨后通過離心所述過濾板來去除溶液。將此平衡循環重復三次。在第二階段，在適當NaCl濃度和pH下以6:1體積比率(300溶液50pL樹脂)用濃MAb-AAB溶液以5mg/mL樹脂攻擊每個孔中的樹脂。將Mab-AAB存于1mMHEPES，10mMNaCl，pH7.0，攙有300ppm蛋白A中的36mg/mL溶液用作儲備溶液。將經加載板搖動20分鐘以使所述樹脂和溶液達平衡。通過離心從所述濾板取出上清液并將收集于收集盤中。通過在A280nm下吸收來確定每個孔中上清液的蛋白濃度。在第三階段，通過添加指定NaCl溶液且在表10中所列舉pH條件下洗滌樹脂。在搖動20分鐘后取出上清液。在第四階段，添加2MNaCl以去除結合樹脂的其余蛋白。每個孔的分配系數是使用從第3階段和第4階段洗脫出的物質及第2階段的產物濃度來計算且示于表ll中。表11:用于MAb-AAB的96孔HTS篩的分配系數(Kp)<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>如在表11中所示，Kp值可用于闡述其中MAb-AAB以不同強度結合TMAE基質的區域。可通過改變流通區(K《0.1)、弱分配區(0.kKk20)和結合區(K》20)的pH條件和氯離子濃度來操控MAb-AAB結合TMAE基質的強度。從每個區中處于加載階段的各孔中取上清液試樣并對所述上清液試樣進行蛋白A分析。這些試樣的分析結果概述于表12中。存在一個pH和電導性范圍，其中TMAE色譜步驟能夠十分顯著地去除蛋白A同時使樹脂僅發生有限的蛋白損失。發現此范圍與分配系數值Kp密切相關且與任何指定pH或氯離子濃度無關。表12:來自HTS篩<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>實例7.2.流通條件下的柱流動下列實驗以流通(FT)模式進行，其中MAb-AAB與柱的相互作用十分弱。以110mg/ml和200mg/ml樹脂加載物攻擊進行兩次試驗。對于所有TMAE(HiC叩M)陰離子交換型色譜試驗來說，使用下列條件(注意在個別實驗描述中的例外情況)。可作業流速-150-300cm/hr平衡1-50mMTris，2.0MNaCI，pH7.5(5倍柱體積)平衡2-如指定值，大約等于加載物pH和氯離子含量加載后洗滌-如指定值，大約等于加載物pH和氯離子含量緩沖帶-50mMTris,2.0MNaCl,pH7.5(5倍柱體積)Mabselect蛋白A色譜使用連接到密理博K普萊姆(MilliporeK-prime)400色譜系統的MabSelect柱(2,389mL)以中試規模純化含有單克隆抗體的培養物。用5倍柱體積的50mMTris/150mMNaCl，pH7.5以300cm/hr流速使Mabselect蛋白A柱達平衡。隨后以大約40mg產物/ml樹脂加載物加載所述柱。此后在1MNaCl，50mMTris，pH7.5中進行5倍柱體積的(CV)洗滌且5CV洗滌劑含有10mMTris，75mMNaCl，pH7.5洗滌劑。隨后使用50mM甘氨酸，75mMNaCl，pH3.0洗脫所述柱。使用2MTris,pH8.5將產物池中和達pH7.6。中和峰值具有約90mM的氯離子濃度。TMAEHiCap(M)色譜經過TMAE步驟進一步純化中和蛋白A池，其中平衡、加載和洗滌溶液在pH7.5(用50mMTris和75mM氯化鈉達成)下。使用5倍柱體積的洗滌劑。這兩個研究的柱尺寸和加載物攻擊為試驗1:7.0cm直徑x20.6cm床身高度(體積-793mL)，加載物濃度為11.9mg/mL;及試驗2:7.0cm直徑x13cm床身高度(體積-500mL)，加載物濃度為17.6mg/mL。這些加載條件在流通(FT)區域中(表13)。分批結合研究用于測量分配系數(Kp)，且通過使用UV吸收確定在柱蛋白吸收帶中的結合產物。此確定結合產物的方法通常會低估在加載期間結合產物的數量，此由在洗滌期間產物的等梯度洗脫造成的。測量在加載物和產物池中的蛋白A、HCP和高分子量聚集體(HMW)的含量且計算去除程度。結果呈現于表13中。蛋白A和HMW去除程度較差且HCP含量減少適中。表13:在FT條件下HCP、蛋白A和HMW去除<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>*雜質含量為38.5ppmProA和51,943ppmHCP(試驗1)、8.8ppmProA和25,398ppmHCP(試驗2)。實例7.3.在弱分配條件下柱試驗(高產物攻擊)TMAE(HiCapM)陰離子交換型色譜基本上按照在實例7.2中所述實施若干Mabselect蛋白A試驗以產生這些試驗的加載材料。經過TMAE柱進一步純化來自蛋白A步驟的部分純化抗體池。TMAE柱的加載物是在50mMTris，pH8.2中。柱直徑為0.5cm且床身高度為10cm床身高度(體積-2.0mL)。用500mg/mL樹脂加載物攻擊所述柱，其中加載物濃度為27.7mg/mL。用含有50mMTris,2MNaCl,pH7.5的溶液(5CV)使所述柱達平衡，然后以50mMTris，pH8.2溶液實施另一平衡步驟。隨后對所述柱加載500mg產物/ml樹脂，其中中和蛋白A峰值來自先前步驟且回收在加載循環期間存于柱流出物及某些柱體積洗滌部分中的產物。這些加載條件是在弱分配區中。使用分批結合研究來測量分配系數(Kp)及在高蛋白濃度下的產物結合。在pH8.2及約12mM氯離子含量下，分配系數Kp估計為1.9(通過HTS篩選求數據集的內插值)。在表示約250、375和500mg/ml樹脂加載物攻擊的加載階段期間測量三個部分的HCP和蛋白A的含量。實例7.3的結果呈現于表14中。這些結果表明在不漏過雜質的情況下可以弱分配模式達成極高產物攻擊。達成極好的HCP和蛋白A減少以及HMW含量減少50呢。與在表13中以流通模式作業的結果相比，弱分配模式的雜質去除更佳。表14:對于500mg/mlTMAE加載物攻擊來說，HCP、蛋白A和HMW的去除<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>*在加載物中的雜質是25,398ppmHCP、99.5ppm蛋白A和2.3%HMW實例7.4.在弱分配條件下的柱試驗(可靠性研究)為了進一步確實TMAE柱在弱分配區中的效能，設計若干試驗，改變加載物的pH和NaCl濃度以測試過程可靠性。所有試驗在250mg/ml樹脂加載物攻擊下進行。基本上按照在實例7.2中所述實施若干Mabselect蛋白A試驗以產生這些試驗的加載材料。在這些試驗中唯一改變的因數是蛋白A洗脫的氯化鈉濃度，改變所述氯化鈉濃度以與特定實驗的TMAE加載物的NaCl濃度匹配。所述柱借助Equil2緩沖劑達平衡且用洗滌緩沖劑洗滌，所述洗滌緩沖劑與加載物具有相同的pH和氯化鈉含量。這些加載條件是在弱分配區中。分批結合研究用于測量分配系數(Kp)。借助在表15中所列舉分配系數對所述試驗進行分級。結合產物是通過使用UV吸收測量柱帶的蛋白來確定且介于7.8mg/mL至25.3mg/mL之間。這些實驗的蛋白A、HCP和HMW結果也呈現于表15中。發現所有雜質能在作業范圍內被可靠去除，所述作業范圍涵蓋13.5-38.8mM氯離子總濃度和pH7.8-8.4。表15:對WP模式<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>*雜質含量為38.5ppmProA和51,943ppmHCP(試驗1)，8.8ppmProA和25,398ppmHCP(試驗2)。+包括來自NaCl、緩沖劑和滴定劑的Cl-離子貢獻實例7.5.內容從這些研究可見蛋白A去除(LRV)隨著Kp明顯地變化，而HCPLRV在等于或高于0.26時于所有Kp值下均為極好的，但在Kp二0.17下明顯降低(在流通條件下)。流通條件與弱分配條件相比，宿主細胞蛋白去除降低一個對數數量級以上，即使對于低加載物攻擊來說也是如此。當將這些弱分配條件施加于樹脂與單克隆抗體的此組合時，結合產物介于7.8mg/ml至25mg/ml之間。分配系數似乎最佳在0.41<Kp<5.4范圍內。在Kp=0.17及1.4-3.3mg/mL結合產物下，實例7.2的條件下似乎并非最佳。這些研究表明純化使用合理設計的培養基細胞培養物產生的多肽的替代模式，其會明顯地減少所存在雜質、高分子量聚集體、DNA、宿主細胞蛋白等。權利要求1、一種在細胞培養物中產生多肽的方法，所述方法包含(1)提供細胞培養物，其包含a.細胞，所述細胞包含編碼相關多肽的核酸；及b.期望細胞培養基，其包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸；和(2)將所述細胞培養物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。2、一種在細胞培養物中產生多肽的方法，所述方法包含(1)提供細胞培養物，其包含a.細胞，所述細胞包含編碼相關多肽的核酸；及b.期望細胞培養基，其包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸；兩種所述濃度均乘以基線因數；和(2)將所述細胞培養物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。3、一種在細胞培養物中產生多肽的方法，所述方法包含-(1)提供細胞培養物，其包含a.細胞，所述細胞包含編碼相關多肽的核酸；及b.期望細胞培養基，其具有依據等式A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F計算的基線調整氨基酸濃度A，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價用于納入相關多肽中的氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，N是相關多肽的期望濃度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數；和(2)將所述細胞培養物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。4、如權利要求3所述的方法，其進一步包含自加載物流體回收經純化多肽的方法，所述回收方法包含如下步驟使所述加載物流體在作業條件下經過存于柱中的基質，所述作業條件可使所述基質結合至少2.8mg多肽/mL基質，其中所述基質選自由下述組成的群組帶電離子交換型基質、疏水作用色譜樹脂、及固定化金屬親和色譜樹脂；和從所述柱的流出物回收所述經純化多肽。5、如權利要求3所述的方法，其進一步包含自加載物流體回收經純化多肽的方法，所述回收方法包含如下步驟使所述加載物流體在由至少為0.1的分配系數界定的作業條件下經過存于柱中的基質；和從所述柱的流出物回收所述經純化多肽。6、一種在細胞培養物中產生多肽的方法，所述方法包含-(1)提供細胞培養物，其包含a.細胞，所述細胞包含編碼相關多肽的核酸；及b.起始細胞培養基，其中所述起始細胞培養基的體積占期望細胞培養基體積的約60-99%;(2)對步驟(l)的所述細胞培養物提供補加細胞培養基，其中所述補加細胞培養基的體積占所述期望細胞培養基體積的約1-40%，且其中所得期望細胞培養基包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸；和(3)將所述細胞培養物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。7、一種在細胞培養物中產生多肽的方法，所述方法包含(1)提供細胞培養物，其包含a.細胞，所述細胞包含編碼相關多肽的核酸；及b.起始細胞培養基，其中所述起始細胞培養基的體積占期望細胞培養基體積的約60-99%;(2)對步驟(l)的所述細胞培養物提供補加細胞培養基，其中所述補加細胞培養基的體積占所述期望細胞培養基體積的約1-40%，且其中所得期望細胞培養基具有依據等式A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F計算的基線調整氨基酸濃度A，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價用于納入相關多肽中的氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，N是所述相關多肽的期望濃度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數；和(3)將所述細胞培養物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。8、如權利要求7所述的方法，其中所述起始細胞培養基包含依據等式B=[A-(Z^^V)]/(1-V)計算的濃度B的氨基酸，其中Z是所述補加細胞培養基的氨基酸濃度，且V是占所述期望細胞培養基體積一定比例的所述補加培養基的體積。9、如權利要求3、4、5、7和8中任一權利要求所述的方法，其中Y為0至約1.5。10、如權利要求3、4、5、7禾Q8中任一權利要求所述的方法，其中F為約1至約1.5。11、如權利要求3、4、5、7和8中任一權利要求所述的方法，其中Y為0至約1.5且F為約1至約1.5。12、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中所述期望細胞培養基包含大于或等于約3mM的酪氨酸。13、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中所述期望細胞培養基包含介于約7mM與約30mM之間的亮氨酸。14、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中所述期望細胞培養基包含介于約7mM與約30mM之間的賴氨酸。15、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中所述期望細胞培養基包含介于約7mM與約30mM之間的蘇氨酸。16、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中所述期望細胞培養基包含介于約7mM與約30mM之間的脯氨酸。17、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中所述期望細胞培養基包含介于約7mM與約30mM之間的纈氨酸。18、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和纈氨酸在所述期望細胞培養基中的組合濃度介于約35mM與約150mM之間。19、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和纈氨酸在所述期望細胞培養基中的組合濃度是全部必需氨基酸在所述期望細胞培養基中濃度的約60%與約80%之間。20、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中所述必需氨基酸在所述期望細胞培養基中的組合濃度是全部氨基酸在所述期望細胞培養基中濃度的約30%與約50%之間。21、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中氨基酸在所述期望細胞培養基中的濃度介于約120mM與約350mM之間。22、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中將脯氨酸在所述細胞培養物中的濃度維持在大于約1mM。23、如權利要求1至11中任一權利要求所述的方法，其中將脯氨酸在所述細胞培養物中的濃度維持在大于約2mM。24、如權利要求1至23中任一權利要求所述的方法，其中所述細胞培養物是大規模細胞培養物。25、如權利要求1至23中任一權利要求所述的方法，其中所述細胞是動物細胞。26、如權利要求1至3及6至25中任一權利要求所述的方法，其中所述多肽是經純化的。27、如權利要求1至26中任一權利要求所述的方法，其中所述培養基是確定成份培養基。28、一種多肽，其按照如權利要求1至27中任一權利要求所述的方法產生。29、一種醫藥組合物，其包含如權利要求28中所述的多肽及醫藥上可接受的載劑。30、一種細胞培養方法，所述方法包含(1)提供細胞培養物，其包含a.細胞；及b.期望細胞培養基，其包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸及用于細胞維持的計算濃度的氨基酸；和(2)將所述細胞培養物維持在容許所述細胞在所述細胞培養物中生長和復制的條件下。31、一種細胞培養方法，所述方法包含(1)提供細胞培養物，其包含a.細胞；及b.期望細胞培養基，其具有依據等式A'=[(M*X)+(Y*M*X)]*F計算的基線調整氨基酸濃度A'，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，Y是細胞維持因數，且F是基線因數；和(2)將所述細胞培養物維持在容許所述細胞在所述細胞培養物中生長和復制的條件下。32、如權利要求30或31所述的方法，其中所述細胞培養物是大規模細胞培養物。33、如權利要求30或31所述的方法，其中所述細胞是動物細胞。34、一種細胞培養基，其具有介于約120mM與約350mM之間的氨基酸總濃度。35、一種用于生產相關多肽的細胞培養基，其包含介于約120mM與約350mM之間的氨基酸總濃度。36、一種用于生產相關多肽的細胞培養基，其包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸。37、一種細胞培養基，其具有依據等式A'4(M+X)+(YfMfX)PF計算的基線調整氨基酸濃度A'，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，Y是細胞維持因數，且F是基線因數。38、一種用于生產相關多肽的細胞培養基，其具有依據等式A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F計算的基線調整氨基酸濃度A，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價用于納入相關多肽中的氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，N是所述相關多肽的期望濃度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數。39、如權利要求34至38中任一權利要求所述的細胞培養基，其中所述細胞培養基是大規模細胞培養基。40、如權利要求34至38中任一權利要求所述的細胞培養基，其中所述細胞培養基是動物細胞培養基。41、如權利要求34至40中任一權利要求所述的細胞培養基，其中所述細胞培養基是確定成份培養基。42、一種確定在細胞培養物中產生相關多肽的細胞培養基中所用氨基酸的優化濃度的方法，所述方法包含-(1)確定所述細胞在目標細胞密度下的細胞群細胞群所需的氨基酸濃度；(2)確定在目標多肽效價下產生所述相關多肽所需的氨基酸濃度；(3)確定所述細胞的細胞維持所需的氨基酸濃度；和(4)加合從步驟(l)、步驟(2)和步驟(3)所獲得的所述濃度以提供在所述產生相關多肽的細胞培養基中所用氨基酸的優化濃度。43、一種確定在細胞培養物中產生相關多肽的細胞培養基中所用氨基酸的優化氨基酸濃度A的方法，所述方法包含(1)確定所述細胞在設定細胞密度下的細胞群細胞群所需的氨基酸濃度X;(2)確定在設定多肽效價下產生所述相關多肽所需的氨基酸濃度P;及(3)依據等式A=[(M*X)+(N*P)+(M*Y*X)]*F確定所述優化氨基酸濃度A，其中M是所述細胞培養物的期望目標細胞密度的乘數，N是所述相關多肽的期望目標濃度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數。44、如權利要求42或43所述的方法，其中所述細胞培養物是大規模細胞培養物。45、如權利要求42或43所述的方法，其中所述細胞培養物是動物細胞培養物。全文摘要本發明涉及合理設計用于細胞培養(例如，應用于多肽生產的細胞培養)的細胞培養基的方法；用所揭示方法設計的細胞培養基；使用所述培養基產生相關多肽(例如，抗體)的方法；使用本文所揭示的方法和培養基產生的多肽；及含有所述多肽的醫藥組合物。所述合理設計的培養基含有用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、和納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸。所述合理設計的培養基可含有基線調整濃度A的至少一種氨基酸，所述基線調整濃度A依據等式A＝[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F計算，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價用于納入相關多肽中的氨基酸濃度，M是所述細胞培養物的期望峰值細胞密度的乘數，N是相關多肽的期望濃度的乘數，Y是細胞維持因數；且F是基線因數。此合理設計的培養基還可用于產生起始細胞培養基，其包含依據等式B＝[A-(Z*V)]/(1-V)計算的濃度B的至少一種氨基酸，其中Z是補加細胞培養基的氨基酸濃度，且V是占期望細胞培養基體積一定比例的補加培養基體積。文檔編號C12N5/00GK101535469SQ200780041158公開日2009年9月16日申請日期2007年11月7日優先權日2006年11月8日發明者丹尼斯·德拉波,欒嚴同,王文格,瑞安·諾蘭申請人:惠氏公司