專利名稱：一種多食鞘氨醇桿菌及其轉化有效霉素的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種多食鞘氨醇桿菌 (i5>/ //2^^<3C"r2',^//〃ra/7/y77)及其轉化有效霉素的方法，具體涉及從土壤中篩選并分離出一株能夠降解有效霉素的鞘氨醇桿菌屬(的多食鞘氨醇桿菌，及利用該菌株轉化有效霉素為有效霉胺和有效霉烯胺的方法，以及有效霉胺和有效霉烯胺的分離及檢測方法。
背景技術：
本發明涉及有效霉胺(validamine)及有效霉烯胺(val iednmine )， 結構式如下HO OH HO OH有效霉胺(validamine) 有效霉烯胺(val ienamine ) 有效霉胺，分子式為C孔5N04,重要的基團有 一個伯氨基(-冊2), — 個羥甲基(-CH20H),三個羥基(-OH),其鹽酸鹽(C7H15N04 . HCI )的[ocL23 + 57.4° (IN - HCI )，熔點為229°C-232°C, [a]D21 + 60.6。
( H20 ),遇茚三酮顯色。有效霉烯胺，分子式為(MN04，重要的基團有: 一個伯氨基(-麗2), 一個碳碳雙鍵(C=C)，一個羥甲基(-CH20H),三個羥基(-OH),其鹽酸鹽 (C7H13N04 . HCI )的[a]D" + 68.6。
(IN - HCI ),五乙酸鹽的熔點為95 °C, [a]D21 + 30.2° ( CHCh ),遇茚三酮顯色。—有效霉胺和有效霉烯胺屬假氨基糖，對糖苷酶有競爭性抑制作用，同 時也是很多其它糖苷酶抑制劑的核心結構，可用于合成伏格列波糖 (vogl ibose )。有關有效霉胺和有效霉烯胺的生產方法的研究已經有30多年的歷史， 曰本龜田等人曾經釆用過的轉化有效霉素為有效霉胺及有效霉烯胺的菌包 括—.假單胞菌屬(尸^ewo^/z 。/ 叫1個種,/^ewoW /7a5" de/7/fW/7ca叫反 硝化假單胞菌)、黃桿菌(/^ra&"er/"/7z， 3個種)、嗜纖維菌屬(6yro/ 力a^， 1個種，3個菌株)、土壤菌屬(J^ro&Cer/腿，2個種， 其中 ^ro6a"eri咖 rao7o6ac,er 有 5 個菌株, /^ro6s"er/鵬 z^/z e/acye/^， 1個種)、氣單胞菌屬(Jero/ro/7M, 5個種)。內芽孢桿菌屬(Ae/7/^c/7/^)。浙江工業大學篩選出的轉化有效霉素為有效胺及有效 霉胺的菌株包括嗜麥芽寡氧單胞菌(We/^"^/ ,^^/^/"^/ //":^ 糞產堿菌(尸aeca/2's )、 熒光假單胞菌 (/^e油卿加i1/7"ore"e/7")。并未發現用多食鞘氨醇桿菌轉化有效霉素為有效霉胺和有效霉烯胺。
發明內容
本發明提供一種能夠轉化有效霉素為有效霉胺和有效霉烯胺的菌株，以 及利用該微生物裂解有效霉素生產有效霉胺和有效霉烯胺的方法，和產物 有效霉胺和有效霉烯胺的分離及檢測方法。本發明提供的新的微生物菌株屬于鞘氨醇桿菌屬(6^力//2^^^"/"/咖) 的多食鞘氨醇桿菌(^力M^/^"er/鵬/Z7W/〃F(9iT/7Z7)。本發明篩選到的菌株基本特征如下細胞形態短桿狀。菌落形態在LB培養基37。C培養2天，菌落粘液狀，乳白色。 生理生化特征革蘭氏陰性，硝酸鹽還原反應陽性，亞硝酸鹽還原反應 陽性，不產生吲哚，精氨酸水解酶陰性，尿酶陽性，(3糖苷酶陽性，液化 明膠，P半乳糖苷酶陽性，不發酵D-葡萄糖，能利用L-阿拉伯糖、D-甘露 糖、D-甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺、D-麥芽糖、葡萄糖酸鉀、癸酸、檸檬酸 鈉,..不能利用D-葡萄糖、己二酸、羥基丁二酸、苯乙酸。根據以上細菌學特征及16s rDNA序列對比，鑒定該菌為多食鞘氨醇桿 菌(i^W/^o&Wer/w/z /zw"/pw7//z7)。該菌具有轉化有效霉素產生有效霉 胺和有效霉烯胺的作用。本發明所用到的轉化底物是有效霉素，有效霉素目前在我國大量使用， 因其高效、無毒、價格低，已成為使用最廣泛的一類農用抗生素。有效霉 素是氨基糖苷類農用抗生素，成分包括A、 B、 C、 D、 E、 F等，主要成份是 A,結構式如下本發明的種子培養基配方如下(g/L):葡萄糖IO.O，酵母粉IO, K2HP04 7.0 , KH2P04 3.0 , MgS04 0.01，自來水配制，121。C滅菌30分鐘。轉化 培養基配方如下(g/L):有效霉素20. 0,酵母粉IO. 0, K2HP04 7.0 ， KH2P04 3.0 , MgS04 0.01,自來水配制，12rC滅菌30分鐘。固體培養基即種子 培養基加入2%的瓊脂。種子培養基接入微生物CGMCCNO. 2341進行培養，培養溫度25°C — 37°C, pH6. 8-7. 2,培養24小時得到種子液，種子液按5%轉種量接入轉化培養基中，培養溫度"。C 一 37°C, pH6. 8-7.2,在通風攪拌條件下培養,培養時間48-168小時。在種子培養基中接入微生物CGMCC N0 . 2341進行培養，培養溫度25 °C 一 37°C， pH6. 8-7. 2,培養菌體到對數生長期，然后離心分離，得到菌 體；將分離得到的菌體，加入含底物有效霉素的濃度為1.0% — 10. 0%的 溶液中進行反應，反應溫度25°C — 37°C ,反應時間24h — 168h 。本發明的培養方法如下菌種CGMCCNO. 2341,經過固體培養基活化， 接入種子培養基，在通風攪拌條件下培養，培養時間24小時，培養后的種 子培養基轉入至轉化培養基中，在通風攪拌條件下培養。本發明的產物檢測方法如下HPLC法檢測，用離子對試劑和磷酸鹽作 為流動相。本發明的產物分離方法如下培養液去除菌體，根據其水溶性強及含有 氨基的性質，用離子樹脂法分離并做脫色處理，最后用有機溶劑脫水的方 法將產物以結晶的形式沉淀。本發明使用的菌種多食鞘氨醇桿菌(5>力//^<^3""/咖M7/〃p^r歴) 在含有有效霉素的培養基上生長良好，液體培養轉化效果較好，培養基碳 源即為有效霉素，氮源可使用多種無機或有機氮源如蛋白胨、酵母粉、 牛肉膏、硫酸銨、醋酸銨等，且該菌株具有無毒、無致病性、性能穩定、 不易染菌等優點。本發明所用的多食鞘氨醇桿菌Y07B-0134已保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo. : 2341，保藏曰為2008 年l月15曰。
具體實施方式
下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何 方式限制本發明。 實施例1種子培養基配方如下(g/L):葡萄糖IO. 0,酵母粉IO. 0, K2HP04 7.0 , KH2P04 3.0 ， MgS04 0.001,自來水配制，121。C滅菌30分鐘。轉化培養基 配方如下(g/L):有效霉素20. 0,酵母粉IO. 0， K2HP04 7.0 , KH2P04 3. 0 ， MgS04 0.01，自來水配制，121。C滅菌30分鐘。固體培養基即種子培養基 加入2%的瓊脂。培養方法菌種CGMCCNO. 2341，經過固體培養基37。C培養2天活化， 接入種子培養基，培養溫度25°C — 37°C, pH6. 8-7. 2,在通風攪拌條件 下培養，培養時間24小時，培養后的種子培養基按5%的轉種量轉入至轉 化培養基中，溫度25'C — 37°C°C, pH6. 8-7.2，在通風攪拌條件下培養， 培桌時間48-168小時。產物檢測方法HPLC法檢測，流動相0. 05mol/LSDS, 1%磷酸鈉，pH2. 8, 流速0. 5ml/min,檢測波長210nm。產物分離方法培養液經離心或過濾除去菌體，調節pH為6. 0上721 型強酸性陽離子樹脂，用水沖洗雜質，用1%的氨水洗脫，分步收集流出液， 收集含有效霉胺和有效霉烯胺的洗脫液升溫減壓濃縮，再上732型陰離子 樹脂，升溫減壓濃縮，加入5倍體積的乙醇，再加總體積3倍體積的丙酮 析出結晶，將結晶過濾干燥得成品。該菌株或該菌株菌體經種子培養基培養后接入含底物有效霉素的轉化 培養基中進行分解底物，或種子培養基培養后分離得到菌體，將得到的菌 體加入有效霉素的溶液中進行反應分解底物；轉化結束后，離心去除菌體， 將轉化液上陽離子交換樹脂，用氨水洗脫，再用陰離子樹脂脫色，加入有 機溶劑沉淀，得到有效霉胺和有效霉烯胺。
權利要求
1. 一種多食鞘氨醇桿菌，其特征在于菌株屬于鞘氨醇桿菌屬的多食鞘氨醇桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2341，保藏日為2008年1月15日，該菌株能夠轉化有效霉素為有效霉胺和有效霉烯胺。該菌株或該菌株菌體具有裂解底物有效霉素為有效霉胺和有效霉烯胺的能力。
2、 一種多食鞘氨醇桿菌轉化有效霉素的方法，其特征在于該菌株 或該菌株菌體經種子培養基培養后接入含底物有效霉素的轉化培養基中 進行分解底物，或種子培養基培養后分離得到菌體，將得到的菌體加入有 效霉素的溶液中進行反應分解底物；轉化結束后，離心去除菌體，將轉化 液上陽離子交換樹脂，用氨水洗脫，再用陰離子樹脂脫色，加入有機溶劑 沉淀，得到有效霉胺和有效霉烯胺。
3、 根據權利要求2所述的一種多食鞘氨醇桿菌轉化有效霉素的方 法,—其特征在于種子培養基的配方為(g/L):葡萄糖IO. 0,酵母粉IO. 0， K2HP04 7.0 , KH2P04 3. 0 ， MgS04 0. 01，自來水配制，121。C滅菌30分鐘。
4、 根據權利要求2所述的一種多食鞘氨醇桿菌轉化有效霉素的方 法，其特征在于所述的轉化培養基的配方為(g/L):有效霉素20.0, 酵母粉IO. 0， K2,4 7.0 ， KH2P04 3. 0 ， MgS04 0. 01,自來水配制，121 X:滅菌30分鐘。
5、根據權利要求2或3或4所述的一種多食鞘氨醇桿菌轉化有效霉 素的方法，其特征在于種子培養基接入微生物CGMCC NO . 2341進行培 養，培養溫度25°C -37°C, pH6.8-7.2,培養24小時得到種子液，種子 液按5%轉種量接入轉化培養基中，培養溫度25。C-37。C, pH6. 8-7. 2,在 通風攪拌條件下培養，培養時間48-168小時。
6、 根據權利要求2或3或4所述的方法，其特征是在種子培養基中 接入微生物CGMCC NO . 2341進行培養，培養溫度25°C — 37°C , pH6. 8-7. 2， 培養菌體到對數生長期，然后離心分離，得到菌體；將分離得到的菌體， 加入含底物有效霉素的濃度為1.0% — 10. 0%的溶液中進行反應，反應溫 度25°C- 37°C ,反應時間24h - 168h 。
7、 根據權利要求2所述的一種多食鞘氨醇桿菌轉化有效霉素的方法， 其特征在于將轉化液離心去除菌體，將轉化液上陽離子交換樹脂，用氨 水洗脫，再用陰離子樹脂脫色，加入有機溶劑沉淀。
8、 根據權利要求l所述的一種多食鞘氨醇桿菌，其特征在于所述 的有效霉胺和有效霉烯胺產物用HPLC法檢測。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，公開了一種多食鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium multivorum)及其轉化有效霉素的方法。該菌株或該菌株菌體可以轉化有效霉素為有效霉胺和有效霉烯胺將該菌株或該菌株菌體經種子培養基培養后接入含底物有效霉素的轉化培養基中進行分解底物，或種子培養基培養后分離得到菌體，將得到的菌體加入有效霉素的溶液中進行分解底物，然后對分解液進行分離、提純，得到有效霉胺和有效霉烯胺。本發明還公開了有效霉胺和有效霉烯胺的檢測和分離方法。菌種多食鞘氨醇桿菌在含有有效霉素的培養基上生長良好，液體培養轉化效果較好，且該菌株具有無毒、無致病性、性能穩定、不易染菌等優點。
文檔編號C12P13/00GK101260374SQ20081001114
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月22日 優先權日2008年4月22日
發明者吳春福, 張怡軒 申請人:沈陽藥科大學