專利名稱：食源性致病菌分子檢測標記的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種食源性致病菌分子檢測標記的建立方法。
背景技術：
食源性致病菌是引起食物中毒，危害人類健康的重要微生物，無論在發達國家還是 發展中國家，都是影響食品安全的最主要原因，其中金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特、 沙門氏桿菌和副溶血弧菌等是國際公認的危害廣泛的四大致病微生物。近年來全球多個 國家多次爆發由上述致病菌引起的食源性疾病。金黃色葡萄球菌(5Ya/7/y^^o"^ s"re"s)是引起人類感染和細菌性食物中毒的一種重要致病菌，由它引起的食物中毒發 生頻率極高。在我國由金黃色葡萄球菌引起的中毒病例占食物中毒總數的20% 25%，是 僅次于沙門氏菌和副溶血性弧菌的第三大致病菌。據國外疾病控制中心報道，在美國由 金黃色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則高 達45 %。據報道，我國細菌性食物中毒中70 % 80 %是由沙門氏菌引起的。
目前，食源性病原微生物快速檢測的方法是基于核酸的分子生物學的方法，主要有 核酸探針法和聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)法。PCR檢測方法存 在著檢測準確性高(105Cfu/mL)和檢測時間短(8h)等優勢，其準確度主要取決于使用 的檢測標記的特異性。目前已報道的食源性致病菌分子檢測標記有幾十多種，這包括金 黃色葡萄球菌腸毒素基因(eWA、 e/ ffi、 e"rt:i、 e/7rf)和e"tE)、耐熱核酸酶基因(/wc)、 表皮剝脫毒素(ete和"扮基因和中毒性休克綜合癥毒素基因(t")、耐甲氧西林基因 (7Z ecA和/eM)、 16S-23S rRNA、沙門氏菌的i/7yA、 i/ W、 j'; pC、 i/ ④、i/ ^、 / WA、 fiM、 r/S、 ag/A、 w'aB、 5"尸K、單核增生李斯特菌的/ 7yA、 iap、 Y/l/A、 j'/77B、 priA、 WcA、 aZcB、卿厶志賀氏菌的&7和w'/A、副溶血性弧菌的t必、tr力和腸出血性大腸 埃希氏菌的Wy、 s"、朋連因等。但是越來越多的研究表明，現有的致病菌的檢測標 記都是通過比較繁瑣和較長時間的研究工作而獲得的，其數量少、特異性低，而且利用 己有的分子檢測標記建立的檢測方法在實際檢測出現了假陽性和假陰性的錯誤結果，這 就要求人們建立一種新的分子檢測標記的發掘方法，以便發掘特異性更高的分子檢測標 記，以解決食源性致病菌分子檢測方法的不足。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中存在的食源性致病菌分子檢測標記特異性不高、 檢測方法存在誤檢等問題而提供一種食源性致病菌分子檢測標記的建立方法。
為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
一種食源性致病菌分子檢測標記的建立方法，其特征在于該方法的具體步驟為
a. 收集一種食源性致病菌的所有基因組序列；
b. 選取步驟a中獲得的基因組序列中的任一基因組切分成長度為500 1000bp的片 段，將每個切分片段與其余的基因組序列進行比對，保留相似性達到98%以上的 切分片段，得到保守序列片段；
c. 將步驟b獲得的保守序列片段中的任一片段與其他微生物基因組序列進行比對， 剔除保守序列片段中與其他微生物基因組序列相同的片段，則保留下來的序列片 段即為該食源性致病菌的特異性標記群；
d. 將步驟c獲得的特異性標記群中的數據信息進行篩選，得到食源性致病菌分子檢 測標記。
與現有技術相比，本發明的方法具有如下顯而易見的突出特點和顯著優點
1、 本發明首次提出了利用生物信息學和微生物基因組學相結合發掘食源性致病菌 分子檢測標記的方法。
2、 本發明方法獲得的食源性致病菌分子檢測標記的特異性比現有的分子檢測標記 的特異性要高。
3、 本發明不需要進行分子克隆、基因測序、PCR等分子生物學實驗，可以節約財力。
4、 本發明獲得的分子檢測標記數量大，可以進一步深入研究和利用。
5、 本發明獲得分子檢測標記能夠滿足生物芯片對檢測標記的要求。
6、 本發明方法同樣適合于其他微生物的分子檢測標記的發掘。
圖1本發明方法的實施例流程圖
具體實施例方式
下面以金黃色葡萄球菌分子檢測標記的建立方法為具體實施例，進一步闡述本發 明。應理解，本實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在 閱讀了本發明的內容之后，本領域技術人員可以對本發明做各種改動或修改，這些等價 形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例一 具體步驟如下
(1) 金黃色葡萄球菌與對比菌株基因序列的收集；從GenBank (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/genomes/Bacteria/)收集所有已經公布14株金
黃色葡萄球菌基因組序列(5Y邵/u^ococc"s a"re"s NCTC 8325、 USA300、 RF122、 C0L、 Mu50、 N315、 MRSA252、 JH1、 JH9、 MSSA476和MW2)及其他所有完成測序的微生物基因 組序列。
(2) 分析獲得金黃色葡萄球菌保守序列片段將5Y邵/^ococmsa"re"sATCCN315 基因組按照500bp的長度進行切分，將每個切分片段和其他金黃色葡萄球菌的基因組利 用BLASTN進行逐一比對分析，保留相似性達到98%以上的序列片段。
(3) 食源性致病菌種特異性的核酸序列片段群的獲得將上述獲得的金黃色葡萄 球菌核酸保守片段中任一片段和其他微生物與病毒的基因組序列進行比對分析，剔除其 中與其他微生物基因組片段相同的片段，經過篩選保留下來的1371個核酸序列片段就 是金黃色葡萄球菌特異性標記群。
(4) 食源性致病菌分子檢測標記的獲得基于(3)所獲得特異性檢測標記群中的 數據信息，結合引物設計、PCR反應條件等生物學原理，篩選適合于進行分子生物學檢 測的序列片段作為檢測標記，列舉其中4個作為代表，結果見序列表序列表
〈110〉上海大學
〈120〉食源性致病菌分子檢測標記的建立方法
〈160〉 4
〈210〉 1
<211> 500
<212〉 DNA
〈213〉 金黃色葡萄球菌(5"帥/ /iococctw 3"re〃51)
〈400〉 1
aaatgatgat aaagtgaatc aagtatgcga ctatatcgag ttacattttc atgaagattt 60
aagcctttca gaattaagcg aatacgttgg gtggtcagag agccatctgt ctaaaaagtt 120
tacagaatcg ctaggtgtag gattccaaca tttcttaaat acgacgcgaa ttgagcatgc 180
gaaactcgat ttaacataca cagatgaaac gattactgat attgcattgc aaaatggctt 240
ttcaagtgca gcgagctttg cgagaacatt taaacacttt acgcatcaaa cgcctaaaca 300
atatcgaggt gatcgtccag caatcactga aaatcaacaa tcggcacaac ataattatca 360 cgaccgtgaa ttgatattac ttttaaatga ctacattgaa gaaatgaatc atttcattga 420 agatattgaa aagatgaact ataaagagat tgcctttaaa ccaactaatc aacaactaaa 480 tcaatttaat catattattc 500
〈210〉 1
〈211〉 500
<212> DNA
<213〉 金黃色葡萄球菌(5Y3p/ y/ococctw sorei/s)
〈400> 2
aagtgggcta tttgaggaat ttgctcaata cacagtatca atcacagttg cttacatgtc 60
atcatgattt tcaagtcaat gaagtattag catatgatgt gatgccatat attatgaaaa 120
agctcaatgc gccattcacg tatgatgcag agatttcgaa tatattttat gatatcgatt 180
tgtgtttaga ctttttatta gatcataact ttagtctaac catgcatttg aatcagtatg 240
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gtcatagaaa agatttgaag ttcaacttgt atgtgacgac attgcacacg tctttaattg 360
aaatgattga ttattttaaa gcattattcc ctaatggtgg cttgtacatt cacttagatc 420
aagctacgga aagacatcta ccattgttga aacgacttga gccacacatc aaccattttg 480
tatttgatgc caattcaaat 500
〈210〉 1 〈211〉 500 〈212〉 DNA〈213〉 金黃色葡萄球菌(5"帥/ j^c^cc〃5" s"reiAS)
〈400> 3
gatgctgttg attttaataa aatgaatgat gatgaattta aaaccgcgag tcaaatgatt 60
attaataaaa cgaattacct tatcgactta atgcatcgcc ataacctaaa gcgtccactc 120
a加actca attggaatac attgacgggt gatacattta ttacaaacgg cgaatatttt 180
agaggtggta tcatcattga gcaattatta aaattaagta ctaaagtaga gggtatcggg 240
tattggttga attatgattt gcacgtcagt cattgtagaa atgaacggga ttatatgaat 300
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gattcaaatt ttcaaatatt gttatatgat gcaaagcatt ttaatccgta cttagcgttg 480
gacaatcaaa tgaatatgcg 500
〈210〉 1
〈211〉 500
〈212〉 DNA
〈213〉 金黃色葡萄球菌(5Yap力y7ococc〃s 3"_raAs)
〈400〉 4
tgcaacggaa atgatccatt tgaacattaa tgccctagaa gacggtatgt ataagattaa 60
acattttacc ttagataaag aaaatggtgc gttatttaat ctttggcgca aacatcatac 120
gatacatggc atggacaagg actctataga ttacgttaat cgaatgagtt ttccgaaatt 180
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tgggattcac ttaattgaag taaaacgtta cccaagttca taaaatgatc acaaatcaca 300
aattttgata tacataattt gtgatttttt atattcaaag ctaaaattgc aaaaaattaa 360
tggttaacat ctctgttgtt ggcaatataa ataatgatta atcatttatg atgtaactaa 420
ggagatgaag gatatgaatc aacaattaat tgaagcttta aaatctaaag aagacaaaat 480
gattgagatc agacgttatt 500
權利要求
1、一種食源性致病菌分子檢測標記的建立方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.收集一種食源性致病菌的所有基因組序列；b.選取步驟a中獲得的基因組序列中的任一基因組切分成長度為500～1000bp的片段，將每個切分片段與其余的基因組序列進行比對，保留相似性達到98％以上的切分片段，得到保守序列片段；c.將步驟b獲得的保守序列片段中的任一片段與其他微生物基因組序列進行比對，剔除保守序列片段中與其他微生物基因組序列相同的片段，則保留下來的序列片段即為該食源性致病菌的特異性標記群；d.將步驟c獲得的特異性標記群中的數據信息進行篩選，得到食源性致病菌分子檢測標記。
2、 根據權利要求1所述的食源性致病菌分子檢測標記的建立方法，其特征在于所述的食源 性致病菌是指經食品引起人類患病的細菌、真菌、病毒或類病毒。
3、 根據權利要求1或2所述的食源性致病菌分子檢測標記的建立方法，其特征在于所述的 食源性致病菌為金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特、沙門氏桿菌、副溶血弧菌、耐熱核 酸酶基因、表皮剝脫毒素基因、中毒性休克綜合癥毒素基因、耐甲氧西林基因、16S-23S rRNA或腸出血性大腸埃希氏菌的hly,slt、 eae基因。
4、 根據權利要求1所述的食源性致病菌分子檢測標記的建立方法，其特征在于所述的食源 性致病菌的所有基因組序列是從DDBJ、 EMBL、 NCBI以及TIGR的數據庫中獲得。
5、 根據權利要求1所述的食源性致病菌分子檢測標記的建立方法，其特征在于基因組序列 進行比對采用的比對軟件為BLAST。
全文摘要
本發明涉及一種食源性致病菌分子檢測標記的建立方法。該方法的具體步驟為收集一種食源性致病菌的所有基因組序列；選取基因組序列中的任一基因組切分成長度為500～1000bp的片段，將每個切分片段與該種食源性致病菌其他的基因組序列進行比對，保留相似性達到98％以上的切分片段，得到該種食源性致病菌保守序列片段；將保守序列片段中的任一片段與其他微生物基因組序列進行比對，剔除保守序列片段中與其他微生物基因組序列相同的片段，則保留下來的序列片段即為該種食源性致病菌的特異性標記群；將特異性標記群中的數據信息進行篩選，得到該食源性致病菌分子檢測標記。本發明首次提出了利用生物信息學和微生物基因組學相結合發掘食源性致病菌分子檢測標記的方法，所得到的檢測標記的特異性比現有的分子檢測標記的特異性要高，且本發明不需要進行分子克隆、基因測序、PCR等分子生物學實驗，可以節約財力。
文檔編號C12Q1/04GK101343662SQ20081003239
公開日2009年1月14日 申請日期2008年1月8日 優先權日2008年1月8日
發明者劉戰民, 尹京苑 申請人:上海大學