核酸擴增分析法及裝置的制作方法

專利名稱：核酸擴增分析法及裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及靶核酸中DNA含有的特定序列的擴增、檢測、以及基因的多態性檢測、單堿基多態分析等。
背景技術：
作為分析基因多態的方法，包括Invader法(Lyamichev，et alScience260778-783(1993))、單鏈DNA構象多態性分析(SSCP法)。
Invader法是在二個不同等位基因上具有特異堿基序列的核酸片段上標記不同的熒光體，能夠檢測出與檢查對象的等位基因完全一致的核酸片段的熒光標記的檢測法。在第26屆日本分子生物學會年會要點集p778 2PC-104中，成功實現了本方法中反應槽的微小化和分析反應的微量化，反應使用的基因組DNA的量為0.2納克(約40拷貝)。
SSCP法是通過使擴增后的雙鏈核酸片段發生變性而成為單鏈，再進行電泳，從而以一個堿基的差異作為高級結構的差異來進行分離、分析的方法。另外，使用SSCP法，能夠測定含有基因多態的等位基因的量比、比較標準試料與檢查對象的試料中的二個不同等位基因量比的測定結果、也能檢測出染色體的缺失(LOH)。
另外，也可以使用單細胞提取系統(CLONIS/OL)(奧林巴斯公司)和LaserCapture Micro dissection(LCM)Systims(ビ-ェム儀器株式會社生產)，分取微量的癌細胞，再對從該細胞中抽提的微量核酸的基因進行擴增和分析。
另外，在Slebos et al，Laboratory Investigation(2004)84，649-657中公開的以往技術表明，當分析微衛星多態的等位基因時，在分取核酸后，根據概率現象，分取的拷貝數越少，則抽取所致的離散越大，染色體增減的分析結果的重復性越低。在該以往技術中，作為解決方法，提出了使用能擴增低拷貝的核酸的實時-釋放PCR，不用分取、分注微量核酸，而直接進行分析的方法。

發明內容
如果使用Slebos et al，Laboratory Investigation(2004)84，649-657公開的以往技術，確實有可能抑制分取、分注引起的重復性低下的誘因。但是，由于在此方法中不能抽取、分注，因而產生了如下問題針對同樣的待檢體，難于對多個基因進行分析；不能使用相同檢體進行再分析等。另外，本發明人通過實驗和統計理論公式已經發現，不僅在微衛星多態的情況下，在所有從含有二種或二種以上不同核酸的溶液中抽取、分注，然后分析的情況下，這樣的提取和分注造成的重復性下降都是會發生的問題。所以，本發明的課題是提供用于多個不同核酸的可信性高、具有重復性的核酸檢測方法或核酸分析方法以及在這些方法中有用的計算機程序和裝置。
針對上述問題，經過潛心研究，其結果是從統計學上證明了要解決上述課題，通過使從起始靶核酸試料中分取的靶核酸拷貝數大于等于統計學上確定的拷貝數，就可進行滿足必要精度的分析，進而完成了本發明。即，本發明的基本組成是從含有二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸試料中分取一部分該靶核酸，再對抽取的靶核酸試料進行檢測的方法，該方法包括以下工序由起始靶核酸試料的核酸濃度計算出起始靶核酸試料的拷貝數的工序，和從上述起始靶核酸試料中分取大于等于規定數目的拷貝數的靶核酸的工序。
本發明的核酸檢測或分析方法進一步提供包括，當從上述起始靶核酸試料中分取的靶核酸拷貝數超過所規定的數目時，稀釋上述起始靶核酸試料，而當該拷貝數未達到所規定數目時，濃縮上述起始靶核酸試料的工序。上述核酸檢測或分析方法還可以進一步包括在后面的工序中不使用提取的靶核酸拷貝數不能調整至所規定范圍的核酸試料，或者是即便使用也不采用其結果，或在結果附加表示警告的標記或記號的工序。
本發明還提供在分取靶核酸后，下一步工序是進行核酸擴增反應或分析反應的核酸檢測或分析方法。所述起始核酸試料是含有人基因組或植物基因組等基因組DNA時，本發明尤其有效。
本發明特別優選利用采用了二項分布的統計方法，由起始靶核酸的拷貝數確定應分取的的靶核酸拷貝數。但是，因為使用二項分布常常需要復雜而且龐大的準備和演算，所以實際中是使用近似二項分布的計算式確定拷貝數。關于此計算式在后面進行說明。
本發明是一種核酸檢測或分析方法，該方法使用二種或二種以上針對一個或一個以上堿基不同的堿基序列部位的特異性引物或二種或二種以上各自針對不同的堿基序列部位的特異性引物，同時擴增二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸試料，并分析該靶核酸中靶基因部位的擴增核酸量的比率，其包括以下工序a)使用含有上述靶核酸的擴增反應液進行核酸擴增的工序，b)由核酸擴增量或核酸擴增過程推測出擴增反應液中的靶核酸拷貝數和起始靶核酸拷貝數的工序，c)利用采用了二項分布的統計方法或近似二項分布的公式，由推測的起始靶核酸拷貝數確定擴增反應液中必要的靶核酸拷貝數濃度的工序，d)比較所確定的必要的拷貝數與所推測的擴增反應液中的靶核酸拷貝數的工序。
在上述方法中可以包括，分析上述靶核酸中靶基因部位的擴增核酸量的比率，比較作為標準試料進行分析的靶核酸和作為檢查對象進行分析的靶核酸的存在比率，以預先設定的閾值為基礎，判斷峰比率的變化是否存在差別的工序。在上述方法中利用采用泊松分布(Poisson Distribution)的統計方法由起始靶核酸拷貝數確定擴增反應液中的靶核酸拷貝數。
在上述方法中可以使用單鏈DNA構象多態性分析(SSCP法)。另外，在二種或二種以上不同靶核酸上，分別標記二種不同熒光，可以使用二色熒光微陣列作為通過這些熒光的發光量的差分析靶核酸擴增量差異的方法。
利用上述方法，能從含有二種或二種以上不同序列的起始靶核酸試料中分取與起始靶核酸的存在比成比例的靶核酸。還能確定在為了準確檢測出起始靶核酸試料中含有的微量核酸而進行的分析中使用的靶核酸的拷貝數。而且，對分析結果，通過求得統計學上的可信區間，能夠以更高精度判定分析結果。


圖1是表示本發明核酸檢測或分析法的主要部分的流程圖。
圖2是表示計算起始核酸拷貝數的方法的流程圖。
圖3是表示由靶核酸確定要提取的拷貝數的方法的流程圖。
圖4是表示起始核酸拷貝數的調整方法的流程圖。
圖5是表示本發明適用的核酸檢測或分析裝置的構成的概略圖。
圖6是表示本發明適用的核酸檢測或分析裝置的控制、解析部和其他結構的概略圖。
其中，1樣品分注臂部、2臂可動部、3濃度測定部、4基因擴增部、5原液樣品保持部、6調整試劑保持部、7分析用樣品保持部、9檢測部、10控制和解析部具體實施方式
下面參照附圖對上述以及其他的本發明的新型特征和效果進行說明。
首先，對本發明的概略進行說明。圖1是本發明的具有代表性的實施方式。如圖1的流程圖所示，測定起始核酸濃度，由其結果計算出或推測出起始核酸拷貝數，確定應分取的核酸拷貝數。在確定要抽取的拷貝數后，若起始核酸試料中的拷貝數大于所規定的值，則進行稀釋，若拷貝數小于所規定的值，則進行濃縮，以調整至利于抽取的濃度。從這樣調整過的試料中只分取所規定的拷貝數。將其添加到反應液中，調配反應液，擴增反應有必要時，進行擴增反應，沒有必要時，進行核酸檢測反應。利用反應得到的試料進行核酸檢測或分析。
圖2是表示計算起始核酸試料中的核酸拷貝數的方法，求得試料中的雙鏈核酸的長度(堿基數)、核酸濃度、核酸的總重量，按照圖2所示的要領計算起始核酸的拷貝數。
另外，圖3是例示確定每次分取的拷貝數的方法。(4)式、(5)式、(8)式、(9)式與在詳細說明中所示的相同，用這些公式表示在拷貝數不足100,000的情況下與大于等于100,000的情況下的計算方法。追求較為嚴謹的計算時，利用使用二項分布(1)式的方法進行計算。下面說明的(2)式～(14)式在本說明書中被定義為近似二項分布的公式。只要是基本上利用二項分布的思想，就可以，如果必要，也可以對(1)式～(14)式進行改動、修正。
圖4是表示當起始靶核酸的拷貝數與應提取的拷貝數的差為正或負或沒有差別時，與之相應的試料的調整方法如何進行。如果起始核酸試料中的拷貝數與應抽取的靶核酸的拷貝數幾乎相同，則可直接分取，并進行反應液的調配。起始核酸試料中的拷貝數比應分取的拷貝數小時，濃縮起始試料。起始核酸試料中的拷貝數比應抽取的拷貝數大時，稀釋起始靶核酸試料。
圖5是表示本發明中使用的核酸檢測或分析裝置的裝置構成的線條圖，在控制、解析部實施的是對濃度測定部、樣品臂注入臂部、基因擴增部和檢測部的控制，并具有其他樣品和試劑保持部。圖6表示本發明的核酸檢測或分析裝置的控制、解析部與其他部件的關系，利用控制、解析部接收濃度測定部測定的起始靶核酸的測定值，以測定值為基礎確定要分取靶核酸的拷貝數，操作樣品分注臂部分取確定值的靶核酸。后面的工序是對基因擴增部和檢測部進行控制。存儲器是能夠利用計算機進行讀取的媒體，記憶后述的程序，通過計算機對一系列的操作進行控制。操作者從輸入部輸入必要的指令、條件，在顯示部顯示操作結果和現狀、警告等。以這些結果為基礎，利用檢測部檢測核酸，并顯示必要的信息。所以，本發明提供一種核酸檢測或分析裝置，其包括以下部分樣品分注裝置，測定試料中核酸濃度的裝置，輸入輸出裝置，核酸檢測部，存儲程序的記憶裝置，以及讀取上述記憶裝置的程序、并控制檢測或分析裝置的計算機，和至少顯示演算結果的顯示裝置；在檢測二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸試料時，上述程序使電子計算機作為a)輸入用于由起始核酸濃度確定拷貝數的靶核酸的長度、或核酸的來源作為起始條件的措施、b)作為以測定的起始核酸濃度結果為基礎，計算出起始靶核酸中的拷貝數的措施、c)由計算出的起始靶核酸拷貝數確定分析反應液中必要的靶核酸拷貝數的措施發揮作用。
本發明的方法是使用二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸試料同時進行擴增，并分析該靶核酸中靶基因部位的擴增核酸量的比率，得到與起始靶核酸相同量比的擴增核酸量，該方法由圖1所示的以下步驟構成。
1)測定上述靶核酸的濃度，2)確定起始靶核酸拷貝數，3)使用統計理論公式確定從起始靶核酸分取并加入到擴增反應液中的靶核酸拷貝數，4)為了使擴增上述靶核酸時的反應液中的上述靶核酸拷貝數達到所規定的值，稀釋或濃縮起始靶核酸，調整核酸擴增反應液，5)進行核酸擴增，6)分析核酸，并在低拷貝數的試料中附加表示警告的標記或記號。
所謂本發明中的起始靶核酸試料是指從生物試料抽提的核酸或由包含從生物試料抽提的核酸的目的區間在內的一部分復制得到的核酸或人工合成的核酸。所謂生物試料是指所有生物細胞、正常組織、血液和尿中的細胞、也包含腫瘤組織自身。腫瘤組織也可以通過手術和活體檢查等獲得。
靶核酸的抽提方法，沒有特別限定，可以使用以往公知的方法，例如酚-氯仿抽提法或QIAamp DNA Blood小型試劑盒(キァゲン公司生產)等。另外，也可以從尿中存在的細胞抽提核酸，也可以從由其他檢查對象的組織獲得的細胞和尿中的細胞抽提核酸。若是從檢查對象采集組織，則只要是含有來源于從檢查對象本人獲得的細胞的核酸的組織，任何組織都可以，例如，即便使用用于病理學檢查的標本樣品的一部分也可以。若是從檢查對象采集尿，則只要是含有來源于排泄于尿的本人的細胞的核酸的物質，任何物質都可以，通常利用上述各種方法能有效抽提來源于排泄于尿的經過新陳代謝的正常細胞和/或癌細胞的核酸。
作為測定核酸拷貝數的裝置，具體可以舉出吸光波長測定裝置、熒光波長測定裝置、紫外可見波長測定裝置等，只要能測定核酸拷貝數，任何裝置都可以，并不限定于上述裝置。
作為擴增核酸的裝置，在擴增方法使用聚合酶鏈反應(PCR)時，具體可以舉出熱循環儀，更具體的可以舉出核酸擴增儀MJ Research(MJ Research公司生產)，但只要能利用PCR法進行核酸擴增，任何裝置都可以，并不限定于上述裝置。在利用PCR法的核酸擴增儀時，對裝滿核酸擴增用試劑調整液的微小容器反復進行升溫和冷卻，擴增核酸。在使用恒溫核酸擴增法時，具體可以舉出加熱器(thermoheater)、孵箱(incubator)等，但只要能進行核酸擴增，任何裝置都可以，并不限定于上述裝置。
下面對圖1所示的流程圖中的重要工序進行詳細說明。
工序1)是測定起始靶核酸濃度，以起始靶核酸的長度為基礎確定起始靶核酸的拷貝數。對于本工序，下面進行了詳細講述，但在本工序中只要能計算起始靶核酸拷貝數，并不限定后述的具體例子。
使用上述核酸測定儀測定起始靶核酸的濃度。作為測定方法，可以舉出紫外吸光測定法、熒光測定法等。并不限于這些方法，只要能測定起始靶核酸的濃度，可以使用任何方法。
在工序2)中，作為利用測定所得的濃度計算拷貝數的方法，如果給出起始靶核酸的堿基數，可以利用生物實驗說明3(バィオ実験ィラスレィテッド)(p26-33)中所示的公知方法計算。測定起始靶核酸的拷貝數有困難時，例如，特開2001-314194號公報中所示的，可以使用公知方法從核酸擴增的過程或核酸擴增后的核酸擴增量推斷擴增前擴增反應液中的靶核酸拷貝數，但作為測定起始靶核酸拷貝數的方法，并不限定于這些例子，只要能測定起始靶核酸的拷貝數，可以使用任何方法。
工序3)是利用統計理論公式從起始靶核酸拷貝數確定分析反應或擴增反應中所必要的最低限度的拷貝數(決定應抽取的拷貝數)的工序。具體地說，是利用統計理論公式，使用由起始靶核酸測定的、或由上述的核酸擴增量或核酸擴增過程推斷出的起始靶核酸拷貝數，確定擴增或分析反應中所必要的最低限度的上述靶核酸拷貝數。下面利用統計理論公式，對擴增或分析反應液中的靶核酸拷貝數的確定方法進行詳細闡述。
本發明的原理是在抽取含有低拷貝數的二種或二種以上的靶核酸的溶液、調配擴增反應液時，利用分取或稀釋來避免各靶核酸的存在比發生變化的情況。所以，在起始靶核酸中的核酸總量為1、用于核酸分析的核酸的存在比為p的情況下，其他核酸的比率用1-p表示，這遵循二項分布。由此，抽取n個拷貝時，抽取液中含有b個拷貝的概率P(b)，可以用(1)式表示。
數1P(b)=n!b!(1-b)!pb(1-P)n-b---(1)]]>P(b)抽取液中含有b個拷貝的概率P起始靶核酸中某一種靶核酸的比例
n從起始靶核酸中抽取的拷貝數b抽取液中含有的供分析的核酸拷貝數另外，當抽取核酸的拷貝數為n，且滿足np＞5并且n(1-p)＞5時，近似遵循平均值p、離散度為p(1-p)/n的正態分布。因而，如下從統計學上能求出應分取的靶核酸的拷貝數值。
起始靶核酸N具有充分大的拷貝數，優選N＞100,000拷貝數的多種靶核酸溶液含有以p比例存在的某一種靶核酸時，從該靶核酸溶液分取n個拷貝的情況下，抽取靶核酸中的某一種該靶基因的比例R，在統計學上滿足np＞5并且n(1-p)＞5時，在某可信度的可信區間采用統計量T，能得到(2)式所表示的范圍。優選采用95％的可信度，采用統計量T為1.96，更優選采用99％的可信度，采用的統計量T為2.58。另外，設定其他可信度的情況下，也能從正態分布表求出統計量T。
數2P-TP(1-P)/n<R<P+TP(1-P)/n---(2)]]>P起始靶核酸中某一種靶核酸的比例n從起始靶核酸中抽取的拷貝數Tn取正態分布時的統計量Rp的可信區間(能取的值的范圍)此外，不滿足np＞5并且n(1-p)＞5時，R的可取區間使用t分布的統計量tn-1可以以(3)式表示，但更優選使用為二項分布的(1)式計算。
數3P-tn-1P(1-P)/n<R<P+tn-1P(1-P)/n---(3)]]>p、n、R與(2)式的定義相同tn-1n取t分布時的統計量起始靶核酸充分大時，利用(2)和(3)式以95％的可信度將由拷貝數決定的R的可取值換算成％，如表1所示。
表1 95％可信區間內n值與可信區間的關系 表1顯示在95％的可信度中，上、下限之間的區間在統計學上不可能找到有統計學意義的差異。因此，此區間越窄，得到與起始靶核酸相同量比的擴增核酸的統計學上的概率就越高。由此，在某可信度的可信區間，滿足np＞5并且n(1-p)＞5時，經常允許只k比例的可信區間時，所規定的值n，如果用統計量T，則可用(4)表示。優選使用可信度為95％、統計量T為1.96，較優選使用可信度為99％、統計量T為2.58。另外，設定其他可信度的情況下，也能從正態分布表查出統計量T。
數4n>T2P(1-P)K2---(4)]]>p、n、T與(2)式的定義相同k提取液中允許的靶核酸比率的可信區間另外，不滿足np＞5并且n(1-p)＞5時，采用t分布的統計量tn-1優選用(5)式表示，更優選使用(1)式計算，(1)式是二項分布。
數5n>(tn-1)2p(1-p)k2---(5)]]>
p、n與(2)式的定義相同tn-1與(3)式的定義相同k與(4)式的定義相同另外，起始靶核酸的拷貝數少的情況下，如果此起始靶核酸的拷貝數用N表示，則用(2)和(3)乘以有限母集團修正項，從而(2)式可以用(6)式表示，(3)式可以用(7)式表示。
數6p-TP(1-P)/n×N-nN-1<R<p+TP(1-P)/n×N-nN-1---(6)]]>p-tn-1P(1-P)/n×N-nN-1<R<p+tn-1P(1-P)/n×N-nN-1---(7)]]>p、n、T、R與(2)式的定義相同tn-1與(3)式的定義相同N起始靶核酸的拷貝數因此，起始靶核酸的拷貝數為統計學意義上的小、優選小于100,000時，如果起始靶核酸的拷貝數用N表示，在某可信度的可信區間，滿足np＞5并且n(1-p)＞5時，本發明中所規定的值n可以用下面的(8)式表示，其中X表示(4)式中所示的右邊。優選使用可信度為95％、統計量T為1.96，更優選使用可信度為99％、統計量T為2.58。另外，設定其他可信度的情況下，也能從正態分布表查出統計量T。
數7n>NXN+X-1---(8)]]>X(4)式的右邊N與(6)式、(7)式的定義相同在某可信度的可信區間，不滿足np＞5并且n(1-p)＞5時，如果將(5)式中所示的右邊用Xt表示，則可以用下面的(9)式表示，但更優選使用二項分布(1)式計算。
數8n>NXtN+Xt-1---(9)]]>Xt(5)式的右邊N與(6)式、(7)式的定義相同另外，也可以計算出確實擴增靶核酸中存在比率小的靶基因所需的最低拷貝數。例如，根據表1，擴增以10％的比例存在于具有大于等于100,000拷貝數的多種靶核酸中的某一種靶基因的情況下，在統計學上，在95％的可信度時，拷貝數不足35時有可能不能檢出。所以，在某一可信度的可信區間，為了確實擴增以p比例存在的靶核酸所應分取的規定值n，希望用泊松分布的(10)式進行推導，其中，p(b)表示分取液中含有b拷貝的概率。
數9p(b)=(np)bb!e-np---(10)]]>p(b)、p、n、b與(1)式的定義相同e自然對數的底數但是，由于(10)式復雜而且難解，因而，將二項分布近似為正態分布，在某一可信度的可信區間，能確實擴增以p比例存在的靶核酸的規定值n，可以用統計量T以(11)式表示。優選使用可信度為95％、統計量T為1.96，更優選使用可信度為99％、統計量T為2.58。另外，設定其他可信度的情況下，能從正態分布表查出統計量T，但更優選使用泊松分布。
數10n>T2(1-p)p---(11)]]>p、n、T與(2)式的定義相同另外，不滿足np＞5并且n(1-p)＞5時，使用t分布的統計量tn-1優選用(12)式表示，更優選使用泊松分布。
數11
n>(tn-1)2(1-p)p---(12)]]>p、n、T與(2)式的定義相同起始靶核酸的拷貝數小的情況下，若此起始靶核酸的拷貝數用N表示，(11)式中所示的右邊用Y表示，則可以用下面的(13)式表示。
數12n>NYN+Y-1---(13)]]>Y(11)式的右邊N與(6)式、(7)式的定義相同另外，不滿足np＞5并且n(1-p)＞5時，如果將(12)式中所示的右邊用Yt表示，則可以用下面的(14)式表示，但較優選使用泊松分布。
數13n>NYtN+Yt-1---(14)]]>Yt(12)式的右邊N與(6)式、(7)式的定義相同優選使用可信度為95％、統計量T為1.96，更優選使用可信度為99％、統計量T為2.58。另外，設定其他可信度的情況下，能從正態分布表查出統計量T。
在使用引物同時擴增二種或二種以上具有各自一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸時，利用上面的方法，能得到與該靶核酸量成比例的擴增核酸量。另外，本發明(4)、(5)、(8)、(9)式中的p值和k值，根據本發明適用的檢測法或檢測裝置的不同而有所不同，在使用定量性低的分析法和裝置的情況下，優選設定較高的k值，在使用定量性高的分析法和裝置的情況下，優選設定較低的k值。P值設定為要檢測的靶核酸的存在比率。但是，不知道存在比率的情況下，p值優選使用0.5，更優選設定為所能推斷的存在比率。在后述的工序5)中，對有可能適用本發明的檢測法和裝置、p值和k值的設定進行更詳細地闡述。
工序7)是調整擴增反應液或分析反應液中的靶核酸的拷貝數的工序。關于使擴增反應液或分析反應液中的該靶核酸的拷貝數達到利用上述方法確定的值的方法，在下面進行詳細闡述，但只要本工序中擴增或分析反應液中的該靶核酸的拷貝數達到用上述方法確定的值就可以，并不限定于下面的詳細闡述。
就測定起始靶核酸的拷貝數后的結果而言，若起始靶核酸的拷貝數充分多時，有必要首先稀釋起始靶核酸。稀釋方法可以是分取一部分起始靶核酸，再在溶劑中混合。作為稀釋用的溶劑，只要能溶解核酸片段、并且不影響后面工序中的核酸擴增反應或核酸分析反應，可以使用任何溶劑。另外，起始靶核酸拷貝數小于被確定的靶核酸的拷貝數時，可以使用醇沉淀法等公知的方法濃縮起始靶核酸。
在下面的工序中，擴增核酸時，分取一部分起始靶核酸溶液經上述的稀釋或濃縮后的拷貝數調整液，調配核酸擴增試劑，向該調整液中加入稀釋或濃縮核酸，以達到由上述方法確定的值。另外，就測定起始靶核酸的拷貝數后的結果而言，若起始靶核酸拷貝數低，可直接調配，則可以分取一部分該靶核酸，在核酸擴增試劑和引物經過調配后的調整液中調配入該靶核酸，以達到利用上述方法確定的值。在起始靶核酸拷貝數不能達到所確定的值時，可以追加試料、或濃縮試料、也可以不用于分析。或者，在分析后附加表示警告的標記或記號。
不進行核酸擴增而直接分析的情況下，分取一部分如上使用起始靶核酸溶液經稀釋或濃縮后的拷貝數調整液，加入到分析用反應液中即可，另外，就測定起始靶核酸的拷貝數的結果而言，若起始靶核酸拷貝數低，可直接調整時，可以分取一部分該靶核酸，并該靶核酸調配入分析反應液中，使其達到利用上述方法確定的值。關于分析反應液的組成，只要是能由起始靶核酸進行直接目的分析，則可以使用任何組成。
工序8)是核酸擴增工序。不擴增核酸直接進行分析反應的時，不必進行此工序，而移至工序9)。對于進行核酸擴增的情形，對本工序的核酸擴增將進行詳細說明，但只要是能進行核酸擴增，本工序并不限于下面的詳細舉例。
核酸擴增的方法沒有特別限定，例如，包括PCR法、鏈取代擴增法(SDA法)、恒溫基因擴增法(ICAN法)、LAMP法等。在任一種方法中，只要使用引物能同時擴增二種或二種以上具有一個或一種以上不同堿基的堿基序列的靶核酸就可以，但更優選使用PCR法。使用PCR法擴增核酸時，有必要確定循環數。本發明中的循環數只要能確認核酸片段的擴增，可以使用任何循環數，優選20～40左右的循環數。
本發明中使用的核酸擴增試劑沒有限定，只要能進行核酸擴增，任何試劑都可以使用。另外，引物是針對檢出的核酸序列部位而設計成特異的基因序列。只要能利用核酸擴增法擴增，可以任意設計引物。而且，出于容易檢測后述的擴增核酸片段等目的，還可以標記引物。利用在核酸擴增時使用標記后的堿基成分(例如，磷的放射性標記堿基)的方法、或核酸擴增后再標記的方法，可以對核酸片段進行標記。作為標記處理方法，只要檢測容易，就沒有特別限定，可以舉出使用放射性物質、熒光物質、化學發光物質、生物素(用酶標記抗生物素蛋白檢測)的標記方法。對于引物，例如，可以使用預先用A.L.F red(Cy5、注冊商標)amidite試劑(pharmacia公司生產)熒光標記引物末端而得的物質。另外，作為熒光標記可以使用applied biosystems公司的FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX(以上為注冊商標)等。使用這些標記物的情況下，可以在引物的5’末端或3’末端的任一端標記都可以，優選標記引物5’末端。
工序10)是分析靶核酸、測定二種不同靶核酸的量比的工序。作為檢測擴增或分析反應液中的二種或二種以上具有不同序列的核酸的方法，具體可以舉出單鏈DNA構象多態性分析(SSCP法)、二色熒光DNA陣列法、Mass Array法、Invader法、Bamper法等。但是，在本工序中，只要能從含有SNPs和/或二個不同等位基因、多個不同核酸的溶液中檢出靶核酸，并不限定于這些具體例子。
所謂單鏈DNA構象多態性分析(SSCP法)是指對靶核酸中相同的、但含有一個或一個以上不同堿基的序列的部位進行擴增，再使所得的擴增核酸變性，由于堿基序列的不同而使高級結構不同，從而進行分離，通過電泳以兩個不同峰的量比進行檢測的方法。作為使用此分析法的臨床檢測法可以舉出LOH法、MSI法等。
像這樣能夠以兩個不同的峰的面積比和高度比等的量比進行檢測和測定的分析法的情況下，檢測和測定的量比與起始核酸一致率高，分析時高定量性也是有必要的。因此，在這樣的情況下，通常要求可信區間(上限和下限的差)10％以內的定量性，此時k為0.05。
使用二色熒光DNA陣列法的情況下，由于通過熒光色素變成紅或綠的變化來檢測DNA的不同，所以原理上講，難于進行定量性高的檢測，通常能進行粗略的檢測。作為使用此分析法的檢測法可以舉出CGH法、各種SNP檢測法等。在這樣的情況下，通常要求可信區間30％左右的定量性，此時k為0.15。用這些分析法分析靶核酸為雜合體的情況下，起始核酸中的二種不同靶核酸的比例為1∶1。所以，p可以為0.5。
檢測并分析擴增的核酸的裝置，具體可以舉出毛細管電泳儀、凝膠電泳儀、質量分析儀、核酸微陣列等。更具體地可以舉出確定核酸堿基序列的genetechanalyzer(ABI公司生產)、能夠利用電泳分析金屬離子、核酸、蛋白質等各種物質的毛細管電泳系統(Agilent Technologies公司生產)、毛細管與質量分析系統相結合的CE/MS系統(Agilent Technologies公司生產)、用凝膠板確定核酸序列的BaseStation(注冊商標)100DNA片段分析儀(MJ Research公司生產)、利用基因多態中堿基的不同引起的質量不同而能夠進行分析的microflex(BrukerDaltonics公司生產)、使根據待檢測的基因區域的堿基序列合成的探針排列在芯片上，使待檢測的核酸與芯片反應的核酸微陣列等，但只要能檢測核酸，任何裝置都可以，并不限于上述的分析裝置。
作為具體的分析方法，闡述了使用16根毛細管電泳儀、利用單鏈DNA構象多態性分析的雜合性缺失(以下稱LOH)的測定法，但在本發明中，只要使用(4)、(5)、(8)、(9)式來確定該規定值，并能確認在該靶核酸的比例中作為目標的可信區間的擴增，并不限定于后述的測定方法。使用該分析方法時，作為擴增核酸的電泳結果，能得到1個或2個峰。在LOH的測定方法中，分別擴增作為標準的靶核酸和作為檢查對象的靶核酸，針對各核酸測定2個峰的高度，計算其比率，求出一方的峰的減少率，比較作為標準的靶核酸和作為檢查對象的靶核酸的峰比率的差，差值小則判斷為陰性，差值大則判斷為陽性。另外，差值在判斷閾值附近時，認為判斷無效。
可以在核酸擴增前測定靶核酸拷貝數，或在擴增過程中或擴增后測定靶核酸拷貝數，下面對低拷貝數下進行分析的情形進行詳細闡述，但在本工序最終的測定結果中，并不限定于測定的靶核酸為低拷貝的下面的具體例子。
擴增小于等于統計學理論公式所確定的值的靶核酸，并進行LOH檢查的情況下，由測定的起始靶核酸拷貝數和擴增反應液中靶核酸拷貝數以及所得的峰比率，利用(2)、(3)、(6)、(7)式能得出所得峰的可信區間。若所得可信區間達到包含閾值在內的范圍，則此時的檢查結果由于既可判定為陽性也可判定為陰性，因此，優選此檢查結果附加表示低拷貝數解析警告的標記和記號。更優選將此檢查結果作為因低拷貝數解析的判斷保留或判斷無效進行處理。另外，所得可信區間在不含有閾值的范圍的情況下，表示陽性或陰性的判定結果。更優選合并起來附加表示在低拷貝數下進行擴增、解析的警告的標記或記號。如上所述使低拷貝數所致的可信區間的擴展反映在測定結果中，能得到精度更高的測定結果。
在本發明中，提供一種程序，該程序用于檢測二種或二種以上具有一個或一個以上不同堿基的堿基序列的靶核酸。即，使用二種或二種以上針對一個或一個堿基不同的堿基序列部位的特異性引物或二種或二種以上各自針對不同堿基序列部位的特異性引物，分析二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸時，該程序含有為了使計算機起作用的以下措施a)以為了從起始核酸濃度確定拷貝數的靶核酸的長度、或核酸的由來作為起始條件輸入的措施、b)以測定起始核酸濃度的結果為基礎，計算起始靶核酸中的拷貝數的措施、c)由計算出的起始靶核酸拷貝數確定分析反應液中必要的核酸拷貝數的措施、和d)比較起始靶核酸拷貝數和進行擴增反應所必要的靶核酸拷貝數，不在分析中使用分析反應液中的該靶核酸拷貝數不能調整至大于等于所規定的值的起始靶核酸，或即使進行分析也不使用其數據，或在分析數據中附加表示警告的標記或記號的措施。
另外，作為其他程序的例子，是使用二種或二種以上針對一個或一個以上堿基不同的堿基序列部位的特異性引物或二種或二種以上各自針對不同的堿基序列部位的特異性引物同時擴增、分析二種或二種以上各自具有一個或一個以上不同堿基的堿基序列的靶核酸時，含有以下措施的程序。
a)以為了從起始核酸濃度確定拷貝數的靶核酸的長度、或核酸的由來作為起始條件輸入的措施、b)以測定的起始核酸濃度的結果為基礎，計算起始靶核酸中的拷貝數的措施、c)由計算的起始靶核酸拷貝數確定分析反應液中必要的核酸拷貝數的措施、和d)比較起始靶核酸拷貝數和進行擴增反應所必要的靶核酸拷貝數的措施。
進一步，在使用二種或二種以上針對一個或一個以上堿基不同的堿基序列部位的特異性引物或二種或二種以上各自針對不同的堿基序列部位的特異性引物同時擴增二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸，并分析該靶核酸中靶基因部位的擴增核酸量的比率，比較作為標準試料進行分析的靶核酸和作為檢查對象進行分析的靶核酸的存在比率，以預先設定的閾值為基礎，判斷峰比率的變化是否存在差別的方法中，提供使計算機作為以下手段起作用的程序。
a)以為了從起始核酸濃度確定拷貝數的靶核酸的長度、或核酸的由來作為起始條件輸入的手段、b)用核酸濃度測定裝置測定起始核酸濃度，或以從擴增過程及核酸擴增量推測的結果為基礎，計算起始靶核酸中的拷貝數的手段、c)使用二項分布或其近似公式，由分析該靶核酸的存在比率的結果計算此結果的可信區間的手段，和d)如果存在差別，檢查判斷的閾值與可信區間的重疊情況，如果閾值與可信區間不重疊則判斷有差別，或無差別，如果閾值與可信區間重疊，則判斷無效的手段。
另外，進一步提供能記錄上述程序并能從計算機讀出該程序的記錄介質。
(實施例1)使用SSCP解析法的低濃度核酸的雜合體等位基因的存在比率1.試料的調配與單堿基多態部位的擴增對于從血液中提取的人核酸中的等位基因的存在比，對于起始靶核酸中的等位基因的相對比率和擴增后的二種不同的等位基因的相對比率，在A)要求2％以內的精度的情況下、B)要求5％以內的精度的情況下、C)要求15％以內的精度的情況下、D)要求40％以內的精度的情況下的必要拷貝數示于圖2。針對分注到各拷貝數的四種靶核酸擴增液，分別以表3所示的組成進行調配。即，越是希望高精度的情況下，拷貝數越大。這些調配要進行8次試行。
表2各起始靶核酸的拷貝數

表3核酸擴增試劑的組成

針對各調整液，以雜合等位基因的單堿基多態部位為靶點，進行PCR擴增。PCR擴增的條件是95℃2分鐘的初次變性后，以95℃30秒、57℃30秒和72℃30秒為1個循環，進行30個循環后，再在72℃延伸7分鐘。
2.SSCP解析上述擴增反應以后，用Klenow片段(KaKaRaBio公司生產)并利用表4的組成，在37℃反應30分鐘，進行末端平滑處理。
表4末端平滑處理試劑組成

使用末端平滑處理后的試料和TAMRA Size Standard(ABI公司生產)和Formamid(ABI公司生產)按照表5所示的組成調配SSPC解析用試劑，然后在92℃2分鐘熱變性后按照表6所示的條件進行SSCP解析。
表5SSCP解析試劑的組成

表6SSCP解析條件

3.等位基因的相對比率在SSCP解析中，由色譜中的2個波形能檢出雜合體等位基因的擴增量。通過求出這2個波形的相對比率，能檢測出原來等量含有的等位基因進行核酸擴增后的變化。在本實驗中檢查8次試行中的峰比率的變化比例。結果示于表7。
表7
2個等位基因中的1個的存在比率的變化

一未見核酸擴增在表7的結果中，由于試行次數少，散亂的范圍小，但確實隨著拷貝數的減少散亂的范圍有增大的趨勢。根據此結果調節從起始靶核酸中抽取的核酸量，從而能進行要求精度范圍內的解析。
(實施例2)使用SSCP解析的LOH檢查1.測定條件的確定所謂LOH檢查，是利用核酸中一個堿基的不同，測定核酸中二個不同等位基因的量比，與標準的靶核酸的該量比進行比較，檢測檢查對象的該量比的變化。所以，二個不同等位基因的量比，通常在動物基因組核酸為1∶1，檢測二個不同等位基因中的1個時，由于該要檢測的起始靶核酸的比例為50％，所以p為0.5。與此相對，等位基因的量比是否變化要進行檢查的檢查對象的該量比由于解析時還不知道，暫且使其與標準相同，p為0.5，解析后補正。另外，由于本解析法需要檢出大于等于10％的核酸，由于有必要在95％可信度時抑制可信區間在10％(±5)以內，所以T為1.96、k為0.05。
在本實施例中，從患者的血液中提取的核酸作為標準的起始靶核酸，從患者的癌組織和尿等提取的核酸作為檢測對象的起始靶核酸，擴增10種基因檢測區域進行檢查。
2.起始靶核酸的拷貝數的確定和擴增反應液中的拷貝數的確定將利用酚-氯仿提取法從人血液中提取的膀胱癌患者的人血來源的核酸作為標準的起始靶核酸使用，將按照上述方法從該患者的尿中提取的人尿來源的核酸作為檢查對象的起始靶核酸使用。利用紫外吸光測定裝置測定這些起始靶核酸，假設每一個細胞的基因組DNA的長度為4.0×106kbp，由此換算的拷貝數示于表8。
表8各起始靶核酸的濃度與拷貝數

由于來源于血液和組織的基因組DNA具有大于等于100,000的拷貝數，所以擴增反應液中的靶核酸拷貝數的計算式使用母集團充分大的(4)、(5)式。另外，在本實施例中，由于來源于尿的基因組DNA的起始拷貝數小，起始拷貝數N為1575，利用(8)、(9)式求得。根據以上的條件，給出表8所示的擴增反應液中必要的拷貝數。
表9各靶核酸擴增時必要的拷貝數

由于在本檢測中有必要擴增10種基因檢測區域，所以準備10種反應液。因此，向各反應液中每次加入1μl擴增所必要的拷貝數濃度的起始靶核酸時，至少要準備10μl的起始靶核酸。但是，在基因組DNA的總拷貝數非常少，不能滿足分析時的必需量的情況下，就認為不能得到可信的檢查結果。此種情況下，在本實施例中進行分析，并在最終結果的判斷中附加表示警告的標記或記號。
3.核酸擴增反應液的調配和核酸擴增反應液中的靶核酸的拷貝數只要是大于等于表9中確定的值的濃度(拷貝/μl)，在起始靶核酸拷貝數充分存在的情況下，優選調整至10,000拷貝左右。所以，如表10中稀釋來源于血液和組織的基因組DNA，調配10,000拷貝/μl的稀釋液，為了稍微提高來源于尿的基因組DNA，用乙醇沉淀法處理總量為15μl的起始靶核酸溶液，濃縮至10μl，使起始靶核酸濃度為157拷貝數/μl。
表10各靶核酸反應液中的拷貝數

并且在這些實施例中使用PCR法作為核酸擴增法，核酸擴增試劑的組成如表11中所示的組成和濃度，調配10種擴增反應液。
表11核酸擴增試劑的組成

向這些調整液中加入1.0μl稀釋或濃縮的起始靶核酸，除來源于尿的靶核酸以外，擴增反應液中的靶核酸中的拷貝數都大于等于表2所示的值，按照下面的條件進行PCR擴增。PCR擴增的條件是95℃2分鐘的初次變性后，以95℃30秒、57℃30秒和72℃30秒為1個循環，30個循環后在72℃延伸7分鐘。
4.使用SSCP解析法的峰比率的測定在調配分析用樣品時，按照下面所示的順序添加試劑和樣品，但添加順序并不限定于這個例子。在分析用微量容器中，向36μl DNA變性劑Formamid中添加1.0μl作為大小標準marker的4nM TAMRA Size Standard(ABI公司生產)、3.0μl DNA擴增產物的原液，調整至總量為40μl。對調整樣品，樣品導入條件為電壓20kV、時間5秒，以電壓15kV、時間70分鐘為電泳條件進行SSCP電泳。此時，由針對擴增的A～J這10種基因檢測區域所得的2個峰，測定二種等位基因中要檢測的靶核酸的存在比率，其結果示于表12。
表12各基因檢測區域的峰比率

5.峰比率的可信區間的再檢測與LOH判定表12的結果和(2)、(6)式表示了各基因檢測區域的判定閾值與可推斷各基因檢測區域中組織和尿的比率的上限值和下限值，再參考這些值進行判斷。此種情況下，作為判斷的判斷方法是，如果比率上限比判定閾值低則判定為陽性，如果比率下限比判定閾值高則判定為陰性，判定閾值在上限和下限之間的情況下則判斷為判定無效。結果示于表13。
表13可信區間的再檢測與以判定域值為基礎的判斷結果

+陽性 -陰性 ×判定無效這樣，以通過檢測測定的比率為基礎，利用(2)、(3)、(6)、(7)式進行再檢測，能得到具有統計學上95％可信區間的檢測結果。本實施例是以統計學上95％可信區間為基礎進行判斷的，但更優選使用99％。
(實施例3)血液中病毒核酸的檢測1.確定測定條件作為檢測血液中含有的微量的病毒核酸的方法，針對從患者血液中提取的起始核酸，可以使用病毒具有的基因序列中的特異性引物，通過基因擴增可以檢測出病毒核酸。在本實施例中，進行基因擴增時，對于從該起始核酸中分取一部分核酸加入到擴增試劑中的情況，下面對確定在起始核酸中含量大于等于0.01％的病毒核酸的核酸拷貝數的實施例進行闡述，該核酸拷貝數是能以99％的可信度分取的病毒核酸拷貝數。此時，要檢測到大于等于0.01％的病毒核酸，p為0.0001，99％的可信度的統計量T為2.58。
2.起始靶核酸拷貝數的確定和擴增反應液中拷貝數的確定將利用酚-氯仿提取法從人血液中提取的患者的人血來源的核酸作為標準的起始靶核酸使用，利用紫外吸光測定裝置測定這些起始靶核酸，假設每一個細胞的基因組DNA的長度為4.0×106kbp，由此換算的拷貝數示于表14。但是，由于不知道病毒核酸的拷貝數，所以通過基因組核酸的拷貝數確定。
表14各起始靶核酸的濃度與拷貝數

此時，由于來源于血液的基因組核酸的拷貝數大于等于100,000，擴增反應液中靶核酸拷貝數的計算式使用母集團充分大的(11)式。根據以上條件，給出表15所示的擴增反應液中必要的核酸量或拷貝數。
表15各靶核酸擴增時必要的核酸量或拷貝數

該結果是，對于患者A，通過部分稀釋起始靶核酸，再分取，可以進行檢測。但是，對于患者B，由于基因組核酸的總拷貝數少，未達到分析所必需的量，因而認為不能得到可信的檢測結果。此種情況下，或者不用于分析，或者在分析后的最終結果的判定中附加表示警告的標記或記號。
權利要求
1.一種核酸檢測或分析方法，其是從二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸試料中，分取一部分靶核酸，并對分取的核酸試料進行檢測或分析的方法；該方法包括以下工序由起始靶核酸試料的核酸濃度，計算出起始靶核酸試料的拷貝數的工序，和從上述起始靶核酸試料中，分取出大于等于規定數目的拷貝數的靶核酸的工序。
2.如權利要求1所述的核酸檢測或分析方法，其中進一步包括，當從上述起始靶核酸試料中分取的靶核酸拷貝數超過規定數目時，稀釋上述起始靶核酸試料，而當該拷貝數未達到規定數目時，濃縮上述起始靶核酸試料的工序。
3.如權利要求1所述的核酸檢測或分析方法，其中進一步包括，在后面的工序中對分取的靶核酸的拷貝數不能夠調整至規定范圍的核酸試料不予使用，或者是即便使用也不采用其結果，或者是在結果中附加表示警告的標記或記號的工序。
4.如權利要求1所述的核酸檢測或分析方法，其中在分取靶核酸后，接著進行如下工序，即，核酸擴增反應或分析反應。
5.如權利要求1所述的核酸檢測或分析方法，其中所述起始靶核酸試料包含有基因組DNA。
6.如權利要求1所述的核酸檢測或分析方法，其中包括對分取的核酸試料進行核酸分析反應，并利用所希望的方法檢測靶核酸的工序。
7.如權利要求1所述的核酸檢測或分析方法，其中包括利用采用了二項分布的統計方法或近似二項分布的公式，由靶核酸的拷貝數確定應分取的靶核酸的拷貝數的工序。
8.如權利要求1所述的核酸檢測或分析方法，其特征在于一個或一個以上堿基不同的堿基序列部位是基因多態。
9.如權利要求1所述的核酸檢測或分析方法，其特征在于一個或一個以上堿基不同的堿基序列部位是單堿基多態。
10.如權利要求1所述的核酸檢測或分析方法，其特征在于一個或一個以上堿基不同的堿基序列部位是微衛星多態。
11.一種核酸檢測或分析方法，其特征在于，其是使用二種或二種以上針對一個或一個以上堿基不同的堿基序列部位的特異性引物，或者二種或二種以上各自針對不同的堿基序列部位的特異性引物，同時擴增二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸試料，并分析該靶核酸中靶基因部位的擴增核酸量的比率的核酸檢測或分析方法；其包括以下工序a)使用含有該靶核酸的擴增反應液進行核酸擴增的工序，b)由核酸擴增量或核酸擴增過程推測出擴增反應液中的靶核酸拷貝數和起始靶核酸拷貝數的工序，c)利用采用了二項分布的統計方法或近似二項分布的公式，由推測的起始靶核酸拷貝數確定擴增反應液中必要的靶核酸拷貝數濃度的工序，d)對所確定的必要的拷貝數和所推測的擴增反應液中的靶核酸拷貝數進行比較的工序。
12.如權利要求11所述的核酸檢測或分析方法，其特征在于使用單鏈DNA構象多態性分析作為定量兩種不同核酸的擴增量的檢測或分析方法。
13.如權利要求11所述的核酸檢測或分析方法，其特征在于對二種或二種以上不同靶核酸，分別標記二種不同顏色的熒光，并使用二色熒光核酸微陣列作為由這些熒光的發光量的差分析靶核酸的擴增量的差異的方法。
14.如權利要求11所述的核酸檢測或分析方法，其中包括分析上述靶核酸中靶基因部位的擴增核酸量的比率，并比較作為標準試料進行了分析的靶核酸和作為檢查對象進行了分析的靶核酸的存在比率，以預先設定的閾值為基礎，判斷峰比率的變化是否存在差別的工序。
15.如權利要求11所述的核酸檢測或分析方法，其中包括利用采用了二項分布的統計方法，計算出所測定的該靶核酸的存在比率的可信區間的工序。
16.如權利要求11所述的核酸檢測或分析方法，其中包括如下工序，即，當判定為存在差別時，檢查閾值與可信區間重合情況，如果閾值與可信區間不重合，則認為存在差別；或判定為沒有差別時，在閾值與可信區間重合的情況下，則認為判定無效。
17.如權利要求11所述的核酸檢測或分析方法，其中包括使用二種或二種以上針對一個或一個以上堿基不同的堿基序列部位的特異性引物，或者二種或二種以上各自針對不同堿基序列部位的特異性引物，在二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸中擴增所含靶核酸中比率最少的靶核酸的工序。
18.如權利要求11所述的核酸檢測或分析方法，其中包括利用采用了泊松分布(Poisson Distribution)的統計方法由起始靶核酸拷貝數確定擴增反應液中的靶核酸拷貝數的工序。
19.如權利要求11所述的核酸檢測或分析方法，其中包括為了使擴增或分析反應液中的靶核酸拷貝數大于等于所規定的值，稀釋、濃縮起始靶核酸試料，調整擴增或分析反應液的工序；對擴增或分析反應液中的該靶核酸拷貝數不能調整至大于等于上述所規定的值的起始靶核酸試料在分析中不予使用，或者是即便進行分析也不使用其數據，或在分析數據中附加表示警告的標記或記號的工序。
20.核酸檢測或分析程序，該程序能使核酸檢測或分析裝置的計算機具有以下功能a)在使用二種或二種以上針對一個或一個以上堿基不同的堿基序列部位的特異性引物或二種或二種以上各自針對不同堿基序列部位的特異性引物，檢測或分析二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的靶核酸試料時，作為以供于由起始核酸濃度確定拷貝數的靶核酸的長度或核酸的來源作為起始條件進行輸入的手段，b)作為以測定的起始核酸濃度結果為基礎，計算出起始靶核酸中的拷貝數的手段，c)作為由計算出的起始靶核酸拷貝數確定分析反應液中必要的靶核酸拷貝數的手段。
21.核酸檢測或分析裝置，其包括以下部分樣品分注裝置，測定試料中核酸濃度的裝置，輸入輸出裝置，核酸檢測部，存儲程序的記憶裝置，以及讀取上述記憶裝置的程序并控制檢測或分析裝置的計算機，和至少顯示演算結果的顯示裝置；在檢測二種或二種以上各自具有一個或一個以上堿基不同的堿基序列的起始靶核酸試料時，上述程序使電子計算機作為a)以供于由起始核酸濃度確定拷貝數的靶核酸的長度或核酸的來源作為起始條件進行輸入的手段，b)作為以測定的起始核酸濃度結果為基礎，計算出起始靶核酸中的拷貝數的手段，c)由計算出的起始靶核酸拷貝數確定分析反應液中必要的靶核酸拷貝數的手段發揮作用。
全文摘要
本發明提供核酸檢測或分析方法，該方法能從含有二種或二種以上不同序列的起始靶核酸中分取與起始靶核酸的存在比成比例的靶核酸，并且該方法可信性高、具有重復性。本發明是關于從二種或二種以上各自具有一個或一個以上不同堿基的堿基序列的靶核酸試料中分取該靶核酸的一部分，并對分取的核酸試料進行檢測或分析的方法，該方法包括以下工序由起始靶核酸試料的核酸濃度計算出起始靶核酸試料的拷貝數的工序和由上述起始靶核酸試料中分取大于等于所規定數目的拷貝數的靶核酸的工序。
文檔編號G01N21/78GK1769496SQ200510105079
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月26日 優先權日2004年9月27日
發明者前田耕史, 福薗真一, 菅野康吉 申請人:株式會社日立高新技術, 栃木縣政府