專利名稱：從實時核酸擴增數據中定量核酸初始濃度的方法
技術領域：
本發明涉及定量初始核酸濃度的方法，更具體的，涉及從通過聚合酶鏈式反應(PCR)，連接酶鏈式反應(LCR)，鏈置換擴增(SDA)，基于核酸序列的擴增(NASBA)，轉錄介導的擴增(TMA)，滾環擴增(RCA)等等得到的實時核酸擴增數據中定量初始核酸濃度的方法。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(PCR)在多種用于檢測和定量核酸的分析方法中是應用最為廣泛的。PCR的原理在美國專利4,683,195和4,683,202中公開。
常規PCR只能給出在端點擴增的DNA通過瓊脂糖凝膠的定性結果。然而，這樣的常規PCR有一個問題即它不能用于定量分析。為了解決這個問題，開發了實時PCR(real-time PCR)。實時PCR應用光學檢測系統實時檢測與擴增的DNA的濃度成比例的熒光強度，于是進行DNA的定量分析成為可能。
從核酸擴增數據中定量核酸初始濃度的常規方法在美國專利6,303,305和6,503,720中公開。在這些常規方法中，擴增了核酸而且得到了在每個擴增循環中表示核酸量的函數。然后，計算函數的第n階導數(n-th orderderivative of the function)并由結果計算核酸的初始濃度。而且，應用導數的最大值作為閾值循環(threshold cycle)(Ct)的定量分析方法在美國專利6,303,305中公開，而應用導數的最大、最小和零值作為Ct的定量分析方法在美國專利6,503,720中公開。
而且，從核酸擴增數據中定量核酸的初始濃度的另一種方法在出版編號為2002-0031768的美國專利申請中公開。由此，應用導數的特定值定量核酸的濃度。
發明內容
本發明提供了由實時核酸擴增數據不用微分或積分定量核酸初始濃度的方法。
根據本發明的一個方面，定量核酸初始濃度的方法包括擴增核酸；產生表示與核酸量成比例升高或降低的熒光強度和擴增循環數或擴增時間之間的相關性的函數；應用上述函數計算當核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度后為其最大值的一半時的特征擴增循環數或特征擴增時間；和由特征擴增循環數或特征擴增時間計算核酸的初始濃度。
根據本發明的另一方面，定量核酸初始濃度的方法包括擴增核酸；產生表示與核酸量成比例的熒光強度和核酸的擴增循環數或擴增時間之間的相關性的函數；應用上述函數計算擴增前核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度；和由算得的擴增前的熒光強度減去背景熒光強度計算核酸的初始濃度。
根據本發明的又一方面，定量核酸初始濃度的方法包括擴增核酸；產生表示核酸的擴增效率和核酸的擴增循環數或擴增時間之間的相關性的函數；應用上述函數計算擴增效率為最大值或最小值時的特征擴增循環數或特征擴增時間；和由特征擴增循環數或特征擴增時間計算核酸的初始濃度。
根據本發明，核酸的初始濃度可以不用微分或積分進行定量。
根據附圖，通過其詳細的代表性的實施方案中的描述，本發明的上述或其他特點和優點會更加明顯，其中圖1為顯示擴增的核酸的熒光強度與擴增循環數之間的相關性的數學模型的圖；圖2A至2F為顯示核酸的實時擴增數據和這些數據以圖1的數學模型進行最小二乘擬合(least-square fitting)的結果的圖；圖3為顯示擴增效率與不同核酸初始濃度的擴增循環數之間關系的圖；圖4為顯示計算當擴增效率為圖3中的最大值時的特征循環數的計算方法的圖；圖5為顯示圖1的數學模型中核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度為熒光強度最大值的一半時的特征擴增循環數(n1/2)與核酸的初始濃度的關系，擴增效率為圖3的最大值時特征擴增循環數(nEmax)與核酸的初始濃度的關系，和當熒光強度的二階導數為最大值時的常規特征擴增循環數Ct與核酸的初始濃度的關系的圖；圖6為顯示R0(圖1的數學模型中擴增前核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度)與核酸的初始濃度之間關系的圖；圖7A至7C為顯示根據本發明計算核酸的初始濃度的方法和已有技術的結果的表；圖8為顯示核酸的熒光強度和擴增循環數之間的關系變化的圖和顯示擴增效率和核酸的不同初始濃度的擴增循環數之間的關系變化的圖；圖9為顯示當擴增效率為最大值時的特征擴增循環數和由圖8的測試結果得到的核酸初始濃度之間關系的圖；圖10為顯示采用不同的值作為核酸的背景熒光強度時，背景修正的擴增效率和擴增循環數之間關系的圖；圖11為顯示不同初始濃度下核酸的熒光強度的初始行為的變化的圖；圖12A和12B為顯示采用不同的值作為背景熒光強度時，不同的核酸初始濃度下背景修正的擴增效率曲線的變化的圖；圖12C為顯示核酸的初始濃度與當背景修正的擴增效率具有最大或最小值時的特征擴增循環數之間的關系變化的圖，和顯示核酸的初始濃度與圖12A和12B中不同的Rb值下，當背景修正的擴增效率具有最大或最小值時的特征擴增循環數的CV％之間的關系變化的圖；圖13為顯示對于不同背景熒光強度的采用方法，熒光強度與擴增循環數之間的關系變化的圖；圖14為顯示圖13中不同的背景熒光強度的采用方法下，背景修正的擴增效率與擴增循環數之間的關系變化的圖；圖15為顯示進行或不進行背景熒光強度修正時，核酸的初始濃度與當背景修正的擴增效率為最大值時的特征擴增循環數之間關系的圖；圖16顯示背景熒光強度修正對核酸初始濃度的定量方法精確度的影響，所述定量方法使用當背景修正的擴增效率為最大值時的特征擴增周期數，所述特征循環周期數是利用圖15的關系式得到的。
圖17為顯示一個實例以說明特征擴增循環數的CV％對于核酸初始濃度的定量的精確度的影響的圖。
具體實施例方式
現在根據附圖，對一種從實時核酸擴增數據，特別是PCR數據，定量核酸初始濃度的方法進行描述。
圖1為顯示擴增的核酸的熒光強度與擴增循環數之間的關系的數學模型的圖。
應用酶的核酸擴增通過需要熱循環的方法，諸如PCR、RT-PCR、嵌套PCR(nested PCR)和LCR或等熱的核酸擴增方法，諸如SDA、NASBA、TMA和RCA進行。這里，核酸可從生物體或病毒中提取。
在實時PCR實驗的每一個擴增循環中，核酸的熒光強度的測量結果可以圖1所示的圖作為模型。圖1的S型模型可由下面的式1表示。
R=Rb+Rmax1+en-n1/2k]]>其中，R核酸的熒光強度Rb核酸的背景熒光強度Rmax核酸的最大熒光強度n擴增循環數n1/2當核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度為其最大值的一半時的特征擴增循環數k擴增反應中與熒光強度的改變速率相關的參數數學模型與實際PCR數據的誤差可由下面的式2進行計算。
ϵ2=Σn[Rn-{Rb+Rmax1+en-n1/2k}]2]]>其中Rn表示實時PCR中第n個擴增循環時的核酸的實際熒光強度。
為了計算圖1數學模型中的參數Rb、Rmax、n1/2和k應用最小二乘法，得到了式3或式4a到4d的非線性方程組且該方程組可以應用Newton-Raphson方法解。
∂ϵ2∂Rb=0,∂ϵ2∂Rmax,∂ϵ2∂n1/2=0,∂ϵ2∂k=0]]>[式4a]Σn[Rn-{Rb+Rmax1+e-(n-n1/2)k}]2=0]]>[式4b]Σn[Rn-{Rb-Rmax1+e-(n-n1/2)k}×11+e-n-n1/2k]=0]]>[式4c]Σn[Rn-{Rb+Rmax1+e-(n-n1/2)k}×e-n-n1/2k{1+e-n-n1/2k}2]=0]]>[式4d]Σn[Rn-{Rb-Rmax1+e-(n-n1/2)k}×(n-n1/2)e-n-n1/2k{1+en-n1/2k}2]=0]]>當式1中n＝0，擴增反應前核酸的熒光強度減去背景熒光強度Rb可用式5定義。
R0=Rmax1+en1/2/k]]>圖2A至2F為顯示HBV質粒DNA的實時擴增數據和這些數據以圖1的數學模型進行最小二乘擬合的結果的圖。
圖2A是當核酸的初始濃度為107拷貝/反應(反應體積中的拷貝數)時的結果，圖2B是當初始濃度為106拷貝/反應時的結果，圖2C是當初始濃度為105拷貝/反應時的結果，圖2D是當初始濃度為104拷貝/反應時的結果，圖2E是當初始濃度為105拷貝/反應時的結果，和圖2F是當初始濃度為2.5×106拷貝/反應時的結果。可以看出，當核酸的初始濃度增加時，核酸開始快速擴增時的循環數減少。
而且可以看出，核酸的熒光強度與擴增循環數之間的相關性的有關實驗結果的圖幾乎與應用式1的數學模型進行最小二乘擬合結果的圖相似。
擴增效率可以式6a和6b作為數學模型。
Rn＝(1+En)Rn-1其中，Rn第n個擴增循環中的熒光強度Rn-1第(n-1)個擴增循環中的熒光強度En第n個擴增循環的擴增效率式6a可以重寫為下面的式6b。
En=Rn-Rn-1Rn-1]]>圖3為顯示擴增效率與核酸不同初始濃度的擴增循環數之間關系的圖。關于圖3，可以看出在PCR循環中擴增效率不是不變的。
圖4為顯示當擴增效率為圖3中的最大值時的特征擴增循環數的判定方法的圖。
關于圖4，假定在最大值或最小值附近的三個點的x-y坐標已知。現在對應用拋物曲線擬合判定使y值最大或最小的x值的數學方法進行描述。
首先，對于三個坐標(x1，y1)，(x2，y2)，(x3，y3)建立下面的式7a。
y1=ax12+bx1+c,y2=ax22+bx2+c,y3=ax32+bx3+c]]>如果式7a重寫為矩陣格式，結果由式7b給出。
x12x11x22x21x32x31abc=y1y2y3]]>如果定義x12x11x22x21x32x31=det(A),]]>常數a，b和c可以由克菜姆法則(Cramer’srule)表示如下。
a=|y1x11y2x21y3x31|/det(A)]]>b=|x12y11x22y21x32y31/det(A)]]>c=x12x1y1x22x2y2x32x3y3/det(A)]]>然后，xmax可以由下面的式7d計算。
xmax=-b2a=y1(x22-x32)+y2(x32-x12)+y3(x12-x22)2[y1(x2-x3)+y2(x3-x1)+y3(x1-x2)]]]>至此，描述了應用數學模型實現核酸的熒光強度與擴增循環數之間的相關性的方法和數學模型參數的計算方法。現在，對數學模型中的具體參數與核酸的初始濃度之間的關聯進行描述。并且，基于這種關聯對核酸的初始濃度的定量方法進行描述。
圖5為顯示圖1的數學模型中核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度為其最大值的一半時的特征擴增循環數(n1/2)與核酸的初始濃度的關系，擴增效率為圖3的最大值時特征擴增循環數(nEmax)與核酸的初始濃度的關系，和當熒光強度的二階導數為最大值時的常規特征擴增循環數Ct與核酸的初始濃度的關系的圖。
關于圖5，當初始濃度(log[拷貝/反應])較高時，特征擴增循環數n1/2和nEmax都減少。而且可以看出，應用[a]二階導數[值value]計算核酸初始濃度的常規方法的斜率幾乎與本發明應用的采用n1/2和nEmax計算時一致。這里，應用nEmax的標準校正曲線位于應用n1/2的標準校正曲線之下。因此，當應用nEmax時，核酸的初始濃度相比應用n1/2的情況，可以在更少的擴增循環數下定量。
圖6為顯示式5中的R0與核酸的初始濃度之間關系的圖。關于圖6，可以看出，log(核酸初始濃度)與log(R0)成線性比例。
描述了應用圖5和6的比例關系得到核酸初始濃度的三種新方法。第一種方法是應用當核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度為其最大值的一半時的特征擴增循環數或時間n1/2，第二種方法是應用當核酸的擴增效率為最大值(nEmax)或最小值(nEmin)時的特征擴增循環數或特征擴增時間，第三種方法是應用R0，擴增前的熒光強度減去背景熒光強度。
現在，對關于應用上述新方法，定量其初始濃度未知的核酸的初始濃度的方法進行描述。
首先，核酸擴增反應(例如，PCR，LCR，SDA，NASBA，TMA，RCA等等)在預定的其初始濃度已知的標準核酸樣品中進行。然后，計算圖1或3所示的數學模型中的參數。然后，應用n1/2，nEmax和R0中的參數得到如圖5或6的標準校正曲線。
同時，在未知的樣品中進行同樣的核酸擴增反應并計算標準校正曲線中應用的同樣的參數(n1/2或nEmax或R0)。然后，未知核酸樣品的初始濃度由圖5或6所示的標準校正曲線得到。具體地，當應用nEmax時，可以花費非常少的數值計算的氣力，在實時得到并且顯示擴增效率。而且，核酸的初始濃度可以用非常簡單的計算進行定量，從而降低定量未知核酸樣品所需的擴增循環數。
圖7A至7C為顯示應用本發明的方法和由已有技術中的熒光強度的二階導數得到的Ct進行核酸定量的結果的實例的表。
圖7A顯示算得的用于核酸定量的參數值，核酸初始濃度為104，105，106和107拷貝/反應，以得到如圖5或6所示的標準校正曲線(重復6次)。圖7B和7C顯示應用根據本發明圖7A得到的標準校正曲線和應用已有技術得到的標準校正曲線，測試的核酸樣品的定量結果。關于圖7B和7C，替代Ct，n1/2、nEmax或R0可用作核酸定量分析的特征因子。在圖7B中，誤差為以[(用校正曲線算得的拷貝/反應值)-(實際拷貝/反應值)]的絕對值除以(實際拷貝/反應值)得到的值的百分數。例如，誤差(Ct)的第一個值計算為(5.4E+0.5-5.0E+05)/5.0E+05，即8.08％。在圖7C中，在5.0E05時的平均誤差代表圖7B中的重復6次實驗的誤差平均值。
圖8為顯示核酸的熒光強度和擴增循環數之間的關系變化的圖和顯示100，101，102，103，104，105，106，107和108拷貝/反應的不同初始核酸濃度下(重復9次)，擴增效率和擴增循環數之間的關系變化的圖。
關于圖8，顯示熒光強度與擴增循環數之間的關系的圖中減去了核酸的背景熒光信號。由圖11可以看出，熒光強度從一個正值開始，在初始階段減小而后又增加。這是由熒光染料的眾所周知的特征—光漂白效應造成的。圖11中所有的熒光強度的最小值均為0，因為減去了背景熒光強度。這引起擴增效率圖中出現如圖8的突出而尖銳的最大值。圖8中的最大效率大于1.0，這不能作為一個物理上的效率的概念被接受。
圖9為顯示特征擴增循環數nEmax和由圖8的測試結果得到的核酸初始濃度之間關系的圖。
關于圖9，核酸的初始濃度范圍為103-107時圖是線性的，所以該圖可以用作在此范圍內的標準校正曲線以根據本發明計算初始濃度。然而，當核酸的初始濃度低于103時，數據具有不規則的圖案。
為了防止擴增效率圖型具有突出而尖銳的大于1.0的最大值，表示擴增效率的式6b可以如下面重寫。
En=(Rn+Rb)-(Rn-1+Rb)Rn-1+Rb=Rn-Rn-1Rn-1+Rb]]>其中，Rn為第n個擴增循環的熒光強度，Rn-1為第(n-1)個擴增循環的熒光強度，Rb為表示背景熒光強度的任意常數，和En為第n個擴增循環的擴增效率。
圖10為顯示根據在六次重復實驗中當核酸的初始濃度為107拷貝/反應時四種不同的背景熒光強度Rb的定義的背景修正的擴增效率圖型的圖。當Rb為0時，即，當擴增反應中熒光強度的最小值Rmin為0，擴增效率的圖型具有突出(pointed)而尖銳的形狀，如圖8。雖然當Rb為0時，出現最大擴增效率的擴增循環數看起來幾乎為不變，但是當重復6次后，它出現在更早的循環數并且它的值也不是常數。
相反地，當Rb為非零(即R1，0.01，-(Rb)S型(sigmoidal))，出現最大擴增效率的擴增循環數看起來幾乎為不變且重復6次的擴增效率的最大值也不變。
現在根據圖15-17，描述了可接受作為常數Rb的常數和當Rb以擴增效率的定義加以考慮時的改進。
首先，由所有擴增循環的熒光強度數據以式1中的S型模型進行最小二乘擬合得到的-(Rb)S型，可以用作式8中的Rb。
第二，當熒光強度在擴增反應的初始階段自非零開始，減少到0然后又增加(參考圖11)，對應于初始熒光強度的值可以用作Rb的值。例如，參考圖11，雖然初始熒光強度與不同的核酸初始濃度有微小的不同，它平均為0.01。因此，0.01的值可以用作Rb的值。如果擴增條件，諸如試劑、熒光染料和視覺曝光時間不改變，初始熒光強度就不會顯著變化。因此，一旦與初始熒光強度對應的值由實驗確定，它可以從那時起被用作Rb。相反，如果擴增條件，諸如試劑、熒光染料和視覺曝光時間改變，對應于初始熒光強度的值就必須由實驗重新確定。
第三，第一個擴增循環的熒光強度R1，可以用作Rb的值。即使擴增條件，諸如試劑、熒光染料和視覺曝光時間改變，這種方法具有的優勢為使用者不需要多花費額外氣力來確定Rb，因為每次實驗時第一個擴增循環的熒光強度總是要進行測定的。雖然這種方法比第二種方法具有這個優勢，但是當第一個擴增循環的熒光強度非常接近0時，定量誤差會增加第四，式8的擴增效率函數中使最大擴增效率為“1”(單位)的值可以用作Rb的值。為了獲得最大擴增效率為1的Rb，Rb的值必須以迭代法(iterativemethod)如在每輪擴增實驗進行連續的置換得到。雖然此法在原則上是理想的，但迭代計算是復雜或耗費時間的。
如上所述，背景熒光強度Rb可以設為下列的值之一1)由所有擴增循環的熒光強度數據以式1中的S型模型進行最小二乘擬合得到的-(Rb)S型；2)對應于初始熒光強度的值(圖11中大約0.01)；3)第一個擴增循環的熒光強度[的R1強度]，R1；和4)使擴增效率的最大值為“1”的值。
這里，背景熒光強度-(Rb)S型的應用是不方便的，因為它必須通過S型模型的非線性曲線擬合計算得到。然而，本發明的其他方法(初始熒光強度R1，和使最大擴增效率為“1”的值)則不需要用曲線擬合。
為了計算背景修正的擴增效率，甚至更大的正值或負值可以用作Rb的值。這將根據圖12A至12C進行描述。
圖12A和12B為顯示應用如圖8中同樣的實驗數據，在背景熒光強度的不同值下，背景修正的擴增效率的變化的圖。
當Rb為正值0.01、0.1、1、10、100和1000時的情況如圖12A所示。由于各個情況下背景修正的擴增效率具有可很好地辨別的正峰，并根據核酸初始濃度在擴增循環數有幾乎相等的間隔，根據本發明，它們可以用于定量核酸的初始濃度。然而，當Rb的值大于0.1時，背景修正的擴增效率的最大值變得遠小于1，這在擴增效率的意義上沒有物理意義。但是，如圖12A可以看出，各個背景修正的擴增效率圖型具有最大值時的擴增循環nEmax位于幾乎相等的區間。這樣，它們所有都可用于定量核酸的初始濃度。但是，優選應用背景修正的擴增效率在0-1的范圍內的情況，即Rb的值為0.01(此值對應于核酸的初始熒光強度)的情況。
當Rb為負值-0.01、-0.1、-1、-10、-100和-1000時的情況如圖12B所示。當Rb的值為-0.01和-0.1，背景修正的擴增效率函數(式8)的除數(divisor)非常接近0，這樣背景修正的擴增效率圖型具有突出而尖銳的峰且不呈現當Rb的絕對值大時的常規區間圖樣，背景修正的擴增效率圖型具有可很好地辨別的負峰，并根據核酸初始濃度在擴增循環數有幾乎相等的間隔。具體地，當Rb小于-1時，背景修正的擴增效率值為負值。由于擴增效率只在從0到1的范圍內具有物理意義，雖然核酸的初始濃度可以用圖12B給出的值進行定量，但是擴增效率沒有物理意義。但是，如圖12B可以看出，當Rb的值小于-1(例如-1、-10、-100、-1000)時，各自的背景修正的擴增效率圖型具有最小值時的擴增循環nEmin位于幾乎相等的區間。這樣，它們所有都可用于定量核酸的初始濃度。
圖12C為顯示核酸的初始濃度與當背景修正的擴增效率具有最大或最小值時的特征擴增循環數nEmax或nEmin之間的關系變化的圖，和顯示核酸的初始濃度與圖12A和12B中不同的Rb值下nEmax或nEmin的CV％之間的關系變化的圖。
關于圖12C，當Rb的值增加到正值(圖12A)或減小到負值(圖12B)時，核酸的初始濃度和nEmax或nEmin之間的關系的圖分別收斂到曲線(converge toa curve)。除去Rb的值為0和-0.01的情況之外，當核酸的初始濃度在103-108拷貝/反應的范圍內時，nEmax的CV％不超過5％。核酸初始濃度的定量誤差與nEmax或nEmin的CV％之間的關系將根據圖17進行描述。
當Rb的值大于某些值，CV％的值幾乎不改變。這樣，這些值除去圖10中Rb＝0即，R1，0.01之外，-(Rb)S型可以優選作為Rb的值以在擴增效率在0-1的范圍內改善nEmax的CV％。
圖13為顯示對于不同的背景熒光強度的采用方法，熒光強度與擴增循環數之間的關系變化的圖。
圖14為顯示圖13中不同的背景熒光強度的采用方法下，背景修正的擴增效率與擴增循環數之間的關系變化的圖。
關于圖13和14，當Rb的值為0，該值是熒光強度圖型的最小值(即，Rb＝Rbmin＝0)，所以式8中的除數(Rn-1+Rb)接近0。這樣，擴增效率En增加太大，Emax峰變得突出而尖銳。而且，擴增效率容易被噪音影響。當Rb的值為非零，擴增效率圖型具有可完全辨別的峰，并根據核酸初始濃度在擴增循環數有幾乎相等的間隔。然而，在圖14中，如果Rb＝R1，背景修正的擴增效率的最大值在擴增循環的初始階段(循環數＝5)大于1而且峰型非常尖銳而突出。在擴增核酸的常規方法中，在這一早期階段通常不發生這樣的快速擴增而且大于1的擴增效率沒有物理意義。因此，必須忽視這些峰而且應用第二大的峰值定量核酸的初始濃度。
圖15為顯示核酸的初始濃度與進行(Rb＝0.01)或不進行(Rb＝0)背景熒光強度修正時的特征擴增循環數nEmax之間的標準校正曲線的圖。
關于圖15，進行和不進行背景熒光修正時的標準校正曲線在核酸初始濃度范圍從103到108下均為線性。[后圖置于前圖之上。]可以看出，進行背景熒光修正的標準校正曲線位于不進行背景熒光修正的標準校正曲線之上。
圖16顯示背景熒光強度修正對使用特征擴增循環數nEmax定量核酸初始濃度的方法的精確度的影響，所述特征擴增循環數nEmax是應用利用圖15的標準校正曲線得到的。
由圖16可以看出，應用背景熒光修正(Rb＝0.01)，nEmax的CV％(＝St.Dev(標準偏差)/Avg(平均值))明顯地減小。
圖17為顯示實例以說明特征擴增循環數的CV％對于核酸初始濃度的定量的精確度的影響的圖。
關于圖17，當特征擴增循環數的CV％從0.5變到5.0，誤差(拷貝誤差)發生很大變化，從6.85％變到48.5％。即，即使是特征擴增循環的誤差輕微地增加，也會引起核酸初始濃度的定量結果產生大的誤差。由于這些原因，非常精確的定量方法是不可缺少的。如圖16所示，應用背景熒光校正(Rb＝0.01)，nEmax的CV％極大地減少，所以與不應用背景熒光修正的情況(Rb＝0)比較，定量精確度得到了極大地改進。
根據本發明，描述了從實時核酸擴增(PCR、LCR、SDA、NASBA、TMA、RCA等)的數據中得到核酸的初始濃度的三種新方法，應用當核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度為其最大值的一半時的特征擴增循環數或時間，當擴增效率為最大值或最小值時的特征擴增循環數或時間，和擴增前的熒光強度減去背景熒光強度，基于關于核酸的擴增量與擴增循環之間的相關性的數學模型，不用進行微分或積分。
具體地，當應用擴增效率為最大值或最小值時的特征擴增循環時，可以花費較少的數值計算的氣力從實時核酸擴增數據中，得到并且在實時顯示擴增效率。因此，可以比其他方法更快地得到核酸的初始濃度。
本發明也可以具體體現為計算機可讀的記錄介質上的計算機可讀的編碼。計算機可讀的記錄介質為任何數據存儲設備，該設備可以存儲此后可被計算機系統讀取的數據。計算機可讀的記錄介質的實例包括只讀存儲器(ROM)、隨機存取存儲器(RAM)、CD-ROM、磁帶、軟盤、光學數據存儲設備，和載波(諸如通過Internet的數據傳輸)。計算機可讀的記錄介質也可散布于網絡連接的計算機系統中，使得計算機可讀的編碼也以散布的方式被存儲和執行。
當具體顯示和以其例證性的實施方案描述本發明時，本領域的普通技術人員理解可以在其中的形式和細節上產生的而不脫離如下面的權利要求所定義的本發明的精神和范圍的各種變化。
權利要求
1.定量核酸初始濃度的方法，包含擴增核酸；產生表示與核酸量成比例升高或降低的熒光強度與核酸的擴增循環數或擴增時間之間的相關性的函數；利用所述函數計算當核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度后為熒光強度最大值的一半時的特征擴增循環數或特征擴增時間；和由特征擴增循環數或特征擴增時間計算核酸的初始濃度。
2.權利要求1的方法，其中核酸是用酶擴增的。
3.權利要求1的方法，其中核酸是利用需要熱循環的核酸擴增方法擴增的。
4.權利要求1的方法，其中核酸是利用等溫的核酸擴增方法擴增的。
5.權利要求1的方法，其中表示相關性的函數是利用S型模型產生的。
6.權利要求5的方法，其中當核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度后為熒光強度最大值的一半時的特征擴增循環數或特征擴增時間是采用關于利用S型模型的函數的非線性最小二乘擬合法計算的。
7.權利要求1的方法，其中核酸的初始濃度是由特征擴增循環數或特征擴增時間通過使用標準校正曲線計算的，該標準校正曲線表示核酸的初始濃度和核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度后為其最大值的一半時的特征擴增循環數或特征擴增時間之間的關系。
8.定量核酸初始濃度的方法，包含擴增核酸；產生表示與核酸量成比例升高或降低的熒光強度與核酸的擴增循環數或擴增時間之間的相關性的函數；利用所述函數計算擴增前核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度；和由算得的擴增前核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度計算核酸的初始濃度。
9.權利要求8的方法，其中核酸是用酶擴增的。
10.權利要求8的方法，其中核酸是利用需要熱循環的核酸擴增方法擴增的。
11.權利要求8的方法，其中核酸是利用等溫的核酸擴增方法擴增的。
12.權利要求8的方法，其中表示相關性的函數是利用S型模型產生的。
13.權利要求12的方法，其中擴增前核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度采用關于利用S型模型的函數的非線性最小二乘擬合法計算。
14.權利要求8的方法，其中核酸的初始濃度是由擴增前核酸樣品的熒光強度通過使用標準校正曲線計算的，該標準校正曲線表示核酸的初始濃度與擴增前核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度之間的關系。
15.定量核酸初始濃度的方法，包含擴增核酸；產生表示核酸的擴增效率和核酸的擴增循環數或擴增時間之間的相關性的函數；利用所述函數計算擴增效率為最大值或最小值時的特征擴增循環數或特征擴增時間；和由特征擴增循環數或特征擴增時間計算核酸的初始濃度。
16.權利要求15的方法，其中核酸是用酶擴增的。
17.權利要求15的方法，其中核酸是利用需要熱循環的核酸擴增方法擴增的。
18.權利要求15的方法，其中核酸是利用等溫的核酸擴增方法擴增的。
19.權利要求15的方法，其中表示擴增效率的函數表達為En=Rn-Rn-1Rn-1]]>其中，Rn為第n個擴增循環的熒光強度，Rn-1為第(n-1)個擴增循環的熒光強度，而En為第n個擴增循環的擴增效率。
20.權利要求15的方法，其中表示擴增效率的函數表達為En=Rn-Rn-1Rn-1+Rb]]>其中，Rn為第n個擴增循環的熒光強度，Rn-1為第(n-1)個擴增循環的熒光強度，Rb為表示核酸的背景熒光強度的非零常數，而En為第n個擴增循環的經過背景校正的擴增效率。
21.權利要求20的方法，其中Rb的值為相應于核酸的初始熒光強度的值。
22.權利要求20的方法，其中Rb的值為第一個擴增循環的熒光強度值，R1。
23.權利要求20的方法，其中Rb的值為核酸的背景熒光強度，其由表示熒光強度和核酸的擴增循環數或擴增時間之間的相關性的函數得到。
24.權利要求23的方法，其中Rb的值為-(Rb)S型，其是從在所有擴增循環中核酸的熒光強度數據以S型模型進行最小二乘擬合得到的。
25.權利要求20的方法，其中Rb的值是使擴增效率(En)的最大值為1的值。
26.權利要求15的方法，其中擴增效率為最大值或最小值時的特征擴增循環數或特征擴增時間通過最大或最小效率點附近函數的曲線擬合計算。
27.權利要求26的方法，其中曲線擬合使用第n次多項式，其中n為大于2的整數。
28.權利要求26的方法，其中曲線擬合使用正弦或余弦函數。
29.權利要求26的方法，其中曲線擬合使用Gaussian分布函數。
30.權利要求26的方法，其中曲線擬合使用Cupic樣條插值方法(splineinterpolation method)。
31.權利要求15的方法，其中核酸的初始濃度是由特征擴增循環數或特征擴增時間通過使用標準校正曲線計算的，該標準校正曲線表示核酸的初始濃度與擴增效率為最大或最小值時的擴增循環數或擴增時間之間的關系。
全文摘要
本發明提供了一種從實時核酸擴增數據中定量核酸初始濃度的方法。從生物體或病毒中提取的核酸(DNA或RNA)應用酶進行擴增。然后核酸的初始濃度通過計算當核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度后為最大值的一半時的特征擴增循環數或特征擴增時間，或者擴增效率為最大或最小值時的特征擴增循環數或特征擴增時間，或者擴增前核酸的熒光強度減去核酸的背景熒光強度的方法獲得。因此，核酸的初始濃度可不用微分或積分進行計算。
文檔編號G01N21/78GK1769494SQ200510098030
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月1日 優先權日2004年9月1日
發明者南宮桷, 金珍泰, 李英善, 金玲雅 申請人:三星電子株式會社