重組微生物及其使用方法

重組微生物及其使用方法
【專利摘要】本發明涉及用于通過微生物發酵產生化學化合物(特別是但不限于乙醇)的方法。還描述了經遺傳修飾的微生物，所述微生物能夠使用一氧化碳產生一種或多種產物(特別是但不限于乙醇)作為主要產物，并且能夠產生少量的或不產生2,3-丁二醇和/或其前體。
【專利說明】重組微生物及其使用方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于通過微生物發酵產生化學化合物，尤其是但不僅限于是己醇的方 法，W及用于該些方法的經遺傳修飾的微生物。

【背景技術】
[0002] 已知產己酸的微生物可用于通過底物（包括例如一氧化碳、二氧化碳、氨氣和甲 醇）發酵來生產燃料（例如己醇或下醇）和其它化學物質。很多該些微生物天然產生至少 兩種-如果不是更多的話-產物。但是，當將微生物用于產生產物時，尤其是用在工業規模 上時，不總是需要微生物產生多種產物。例如，多種產物的產生可能是W生產效率和特殊價 值的產品的產率為代價，因為副產物可能從參與產生主要需要產物的途徑中轉移出碳。另 夕F，副產物可能對微生物有毒，產生多種產物會使所需產物的回收和分離變得困難，并且難 W控制發酵條件W有利于使得一種產品的產生優于另一種產品。副產物也可能是發酵罐中 的潛在污染源，因為它們可能是有害生物的底物。
[0003]在通過含一氧化碳的底物的微生物發酵來產生己醇時，2, 3-下二醇通常作為副產 物產生。該可能降低己醇的生產效率和產率W及造成如上所述的其它問題。
[0004]本發明的目的是克服現有技術的一種或多種缺陷，或者至少為公眾提供有用的選 擇。


【發明內容】

[0005]本發明涉及，尤其是，新的經遺傳修飾的微生物，和親代微生物相比，所述微生物 能夠使用一氧化碳來產生一種或多種產物并且能夠產生降低量的2, 3-下二醇和/或其前 體。在一個實施方案中，和親代微生物相比，所述經遺傳修飾的微生物基本不產生2, 3-下 二醇和/或其前體。在一個具體實施方案中，所述微生物產生己醇作為主要產物。
[0006]在第一方面，本發明提供了一氧化碳營養型產己酸微生物，所述微生物被改造為 適于在發酵含一氧化碳的底物時產生一種或多種產物W及降低量的或基本不產生2, 3-下 二醇和/或其前體，和親代微生物相比，所述微生物包括破壞了 2, 3-下二醇生物合成途徑 的一種或多種遺傳修飾。
[0007]在一個具體實施方案中，本發明提供了一氧化碳營養型產己酸微生物，所述微生 物被改造為適于在發酵含一氧化碳的底物時產生己醇作為主要產物W及降低量的或基本 不產生2, 3-下二醇和/或其前體，和親代微生物相比，所述微生物包括破壞了 2, 3-下二醇 生物合成途徑的一種或多種遺傳修飾。
[0008]在一個實施方案中，所述微生物被改造為適于進一步產生甲酸、乳酸、丙麗酸、玻 巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸（fumerate)、2-麗戊二酸 (2-oxogluterate)、巧樣酸中的一種或多種。
[0009]在一個實施方案中，與親代微生物相比，所述微生物被改造為適于產生增加量的 己醇、甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、 2-麗戊二酸、巧樣酸中的一種或多種。
[0010] 在一個實施方案中，所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了一 種或多種能將丙麗酸轉化成己醜乳酸的酶的表達和/或活性。
[0011] 在一個實施方案中，所述一種或多種能將丙麗酸轉化成己醜乳酸的酶是己醜乳酸 合酶（als巧。
[0012] 在一個實施方案中，所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了一 種或多種能將己醜乳酸轉化成己偶姻的酶的表達和/或活性。
[0013] 在一個實施方案中，所述一種或多種能將己醜乳酸轉化成己偶姻的酶是己醜乳酸 脫駿酶（budA)。
[0014] 在一個實施方案中，所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了一 種或多種能將己偶姻轉化成2, 3-下二醇的酶的表達和/或活性。
[0015] 在一個實施方案中，所述一種或多種能將己偶姻轉化成2, 3-下二醇的酶選自 2, 3-下二醇脫氨酶（2, 3b化）、己偶姻還原酶、伯醇：仲醇脫氨酶。
[0016] 在一個實施方案中，所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了兩 種或多種酶的組合的表達和/或活性，所述酶能將丙麗酸轉化成己醜乳酸、將己醜乳酸轉 化成己偶姻、和/或將己偶姻轉化成2, 3-下二醇。
[0017] 在一個實施方案中，所述遺傳修飾破壞了一種或多種W下酶的表達和/或活性：
[0018] 己醜乳酸合酶（als巧；
[0019] 己醜乳酸脫駿酶炬udA);
[0020] 2, 3-下二醇脫氨酶（2, 3b化）；
[0021] 己偶姻還原酶；和
[0022] 伯醇：仲醇脫氨酶。。
[0023] 在一個實施方案中，所述遺傳修飾破壞了一種或多種W下酶的表達和/或活性：
[0024] 己醜乳酸合酶（als巧；
[00巧]己醜乳酸脫駿酶炬UdA);和
[0026] 2, 3-下二醇脫氨酶（2,抓化）。
[0027] 在一個實施方案中，所述一種或多種遺傳修飾破壞了一種或多種編碼一種或多種 上述酶的基因。在一個實施方案中，所述一種或多種遺傳修飾破壞了一種或多種上述酶的 表達和/或活性所需的化合物的活性。在一個實施方案中，所述一種或多種遺傳修飾增強 了一種或多種化合物的表達或活性，所述化合物抑制了一種或多種上述酶的表達或活性。
[0028] 在一個具體實施方案中，所述微生物選自自產己醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、揚氏梭菌（Clostridiumljungdahlii)、和拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)W及相關分離株。在另一個實施方案中，所述組也包括科斯卡培梭菌 (Clostridiumcoskatii)。
[0029] 在一個具體實施方案中，所述微生物是自產己醇梭菌DSM23693。
[0030] 在第二方面，本發明提供了用于產生一氧化碳營養型產己酸微生物的方法，所述 微生物被改造為適于在發酵含一氧化碳的底物時產生一種或多種產物W及降低量的或基 本不產生2, 3-下二醇和/或其前體，所述方法包括遺傳修飾一氧化碳營養型產己酸親代微 生物W破壞2, 3-下二醇生物合成途徑。
[0031] 在一個實施方案中，和親代微生物相比，所述方法導致了一種或多種產物的產生 增加。
[0032] 在一個具體實施方案中，本發明提供了用于產生一氧化碳營養型產己酸微生物的 方法，所述微生物被改造為適于在發酵含一氧化碳的底物時產生己醇作為主要產物W及降 低量的或基本不產生2, 3-下二醇和/或其前體，所述方法包括遺傳修飾一氧化碳營養型產 己酸親代微生物W破壞2, 3-下二醇生物合成途徑。
[0033] 本發明也提供了通過所述第二方面的方法產生的微生物。
[0034] 在一個實施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了編碼能將丙麗酸轉化成己醜乳酸的一種或多種酶的一種或多種基 因。在一個實施方案中，所述一種或多種能將丙麗酸轉化成己醜乳酸的酶是己醜乳酸合酶 (als巧。
[00巧]在一個實施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了編碼能將己醜乳酸轉化成己偶姻的一種或多種酶的一種或多種基因。 在一個實施方案中，所述一種或多種能將己醜乳酸轉化成己偶姻的酶是己醜乳酸脫駿酶 (budA) 〇
[0036] 在一個實施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了編碼能將己偶姻轉化成2, 3-下二醇的一種或多種酶的一種或多種基 因。在一個實施方案中，所述一種或多種能將己偶姻轉化成2, 3-下二醇的酶選自2, 3-下 二醇脫氨酶化3b化）、己偶姻還原酶、伯醇：仲醇脫氨酶。
[0037] 在一個實施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了兩種或多種基因的組合，所述基因編碼能將丙麗酸轉化成己醜乳酸、 將己醜乳酸轉化成己偶姻、和/或將己偶姻轉化成2, 3-下二醇的酶。
[0038] 在一個實施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了一種或多種基因，所述基因編碼己醜乳酸合酶（als巧、己醜乳酸脫駿 酶炬udA)和2, 3-下二醇脫氨酶化3b化）中的一種或多種。
[0039] 在一個實施方案中，所述方法包括引入遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了一種或多 種上述酶的表達或活性所需的化合物的活性。
[0040] 在一個實施方案中，所述方法包括引入增強了一種或多種化合物的表達或活性的 遺傳修飾，所述化合物抑制了一種或多種上述酶的表達或活性。
[0041] 在第H方面，本發明提供了用于產生一種或多種產物的方法。在一個實施方案中， 所述方法為用于產生己醇、甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醜乳 酸、蘋果酸、延胡索酸、2-麗戊二酸、巧樣酸中的一種或多種。
[0042] 在一個具體實施方案中，本發明提供了用于通過微生物發酵產生一種或多種產物 (在一個實施方案中包括己醇W及一種或多種其它產物）的方法，所述微生物發酵包括使 用本發明第一方面的和/或通過本發明第二方面的方法產生的一種或多種微生物發酵含 C0的底物。在一個實施方案中，所述一種或多種其他產物選自玻巧酸、乳酸、甲酸、額氨酸、 亮氨酸、丙麗酸、異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、2-麗戊二酸、巧樣酸。
[0043] 本發明也提供了用于降低來自工業過程的總的大氣碳排放的方法。
[0044] 在一個實施方案中，所述方法包括如下步驟：
[0045] (a)將含CO的底物提供給生物反應器，所述生物反應器含有本發明第一方面的和 /或通過本發明第二方面的方法產生的一種或多種微生物的培養物；和
[0046] 化）在所述生物反應器中厭氧發酵所述培養物W產生一種或多種上述產物，優選 包括己醇。
[0047] 在另一個實施方案中，所述方法包括W下步驟：
[0048] 在由工業生產過程產生的含C0的氣體釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲；
[0049] 通過培養物厭氧發酵所述含C0的氣體W產生一種或多種上述產物，優選包括己 醇，所述培養物含有一種或多種本發明第一方面的微生物和/或通過本發明第二方面的方 法產生的微生物。
[0050] 在所述方法方面的具體實施方案中，將所述微生物維持在水性培養基中。
[0051] 在所述方法方面的具體實施方案中，對所述底物的發酵發生在生物反應器中。
[0052] 優選地，所述含C0的底物是含C0的氣態底物。在一個實施方案中，所述底物包含 工業廢氣。在某些實施方案中，所述氣體是鋼鐵廠廢氣或合成氣。
[0053] 在一個實施方案中，所述底物通常會含有大比例的C0,例如至少約20體積％至約 100體積％的C0、20體積％至70體積％的C0、30體積％至60體積％的C0和40體積％至 55體積％的C0。在具體實施方案中，所述底物包含約25體積％、或約30體積％、或約35 體積％、或約40體積％、或約45體積％、或約50體積％的C0、或約55體積％的C0、或約60 體積％的〇)。
[0054] 雖然所述底物不必需含有任何氨氣，但是存在應該不會對依據本發明方法的產 物形成不利。在具體實施方案中，存在氨氣可獲得提高的醇產生的整體效率。例如，在具 體實施方案中，所述底物可包含約2:1、或1:1或1:2比例的&:0)。在一個實施方案中，所 述底物包含約30體積％或更低的&、20體積％或更低的&、約15體積％或更低的&、或者 約10體積％或更低的&。在其他實施方案中，所述底物流包含低濃度的&，例如小于5體 積％、或小于4體積％、或小于3體積％、或小于2體積％、或小于1體積％或者基本上不含 氨氣。例如，所述底物還可含有一些0)2,例如約1體積％至約80體積％的(?或1體積％ 至約30體積％的CA。
[00巧]在某些實施方案中，所述方法還包括從發酵液中回收一種或多種產物的步驟。在 一個實施方案中，從發酵液中回收己醇。在一個實施方案中，從發酵液中回收一種或多種 產物，所述產物包括甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果 酸、延胡索酸、巧樣酸和2-麗戊二酸。
[0056] 在第四方面，本發明提供了通過第H方面的方法產生的一種或多種產物。在一個 實施方案中，所述一種或多種產物選自己醇、甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、巧樣酸和2-麗戊二酸。在一個實施方案中，所述一 種或多種產物至少包括己醇。
[0057] 在第五方面，本發明提供了一氧化碳營養型產己酸微生物，和親代微生物相比，所 述一氧化碳營養型產己酸微生物中的一種或多種非必需基因已被破壞。
[0058] 在第六方面，本發明提供了產生其中一種或多種非必需基因已被破壞的一氧化碳 營養型產己酸微生物的方法，所述方法包括遺傳修飾親代微生物中的一種或多種非必需基 因。
[0059] 本發明也提供了通過第六方面的方法產生的微生物。
[0060] 在一個實施方案中，一種或多種非必需基因是編碼將己醜乳酸轉化成己偶姻的 酶、和/或編碼將己偶姻轉化成2, 3-下二醇的酶的基因。在一個實施方案中，所述酶是如 本文所述的酶。
[0061]在某些實施方案中，所述微生物選自自產己醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、科斯卡 培梭菌、齡泥下酸桿菌炬utyribacteriumlimosum)、甲基營養下酸桿菌炬utyribacterium meth}dot;ro地i州m)、伍氏醋酸桿菌（Acetobacteriumwoodii)、己氏嗜堿菌 (Alkalibaculumbacchii)、Blautiaproducta、齡泥真桿菌巧ubacteriumlimosum)、熱醋 穆爾氏菌（Moorellathermoacetica)、熱自養穆爾氏菌（Moorellathermautotrophica)、 普氏產醋桿菌（Oxobacterpfennigii)和凱伍熱厭氧菌（Thermoanaerobacterkiuvi)。
[0062] 在一些實施方案中，所述微生物選自自產己醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌。在另一 個實施方案中，所述組也包括科斯卡培梭菌。
[0063] 在一個具體實施方案中，所述微生物是自產己醇梭菌DSM23693。
[0064] 在第走方面，本發明提供了用于通過微生物發酵產生一種或多種產物的方法，所 述微生物發酵使用了一種或多種第五方面的微生物和/或通過第六方面的方法產生的微 生物。
[0065] 在一個具體實施方案中，本發明提供了用于通過微生物發酵產生己醇和一種或多 種其他產物的方法，所述微生物發酵包括使用第五方面的和/或通過第六方面的方法產生 的一種或多種微生物對含C0的底物發酵。
[0066] 在一個實施方案中，所述方法包括如下步驟：
[0067] (a)將含C0的底物提供給生物反應器，所述生物反應器含有第五方面的和/或通 過第六方面的方法產生的一種或多種微生物的培養物；和
[0068] 化）在所述生物反應器中厭氧發酵所述培養物W產生一種或多種產物。
[0069] 在另一個實施方案中，所述方法包括W下步驟：
[0070] (a)在由工業生產過程產生的含C0的氣體釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲；
[0071] 化）通過培養物厭氧發酵所述含C0的氣體W產生一種或多種產物，所述培養物含 有第五方面的和/或通過第六方面的方法產生的一種或多種微生物。
[0072] 在一個實施方案中，所述一種或多種產物是如本文所述的產物。
[0073] 在一個實施方案中，所述含C0的底物是如本文所述的底物。
[0074] 廣義上說，本發明還可單獨或綜合地包括本申請說明書中提及或指出的部分、要 素和特征，包括兩個或多個所述部分、要素或特征的任意或所有組合，并且當本文提及的具 體整數在本發明所涉及的領域具有已知的等價物時，所述已知的等價物如同單獨被提出一 樣納入本文。

【專利附圖】

【附圖說明】
[00巧]本發明的該些方面和其他方面一應該W其所有新的方面考慮一將通過后文 描述（僅作為示例）并參考附圖而變得清楚，其中：
[0076]圖1示出了產生2,3-下二醇的一氧化碳營養型產己酸菌（例如，自產己酸梭菌 DSM23693)中的C0的代謝途徑。
[0077] 圖化表明了在具有向己醇的碳通量再分配的產生2, 3-下二醇的一氧化碳營養型 產己酸菌中敲除2, 3-下二醇生物合成途徑的影響并且顯示了來自C0的新產物（例如，玻 巧酸、2-麗戊二酸、甲酸、額氨酸、亮氨酸）的產生。
[0078] 圖2示出了自產己酸梭菌DSM23693基因組上的budA基因和其5'和3'側翼區。 也顯示了用于PMTL85141質粒的側翼片段的PCR擴增和隨后的克隆的引物。
[0079] 圖3示出了用于自產己酸梭菌DSM23693中budA基因敲除的含有位于由lacZ基 因分開的DNA片段側翼的5'和3'budA基因的示例性pMTL85141-budA-ko質粒。
[0080] 圖4示出了用于本發明的示例性甲基化質粒。
[00引]圖5示出了（A) ;budA基因敲除后自產己酸梭菌DSM23693的基因組區域的圖形說 明并且也顯示了用于篩選自產己酸梭菌DSM23693budA基因敲除的引物位置W及來自野生 型自產己酸梭菌DSM23693和其相應的budA基因敲除菌株的PCR產物的預期大小。炬）：自 產己酸梭菌DSM23693budA基因敲除的PCR篩選的瓊脂糖凝膠電泳圖像。泳道1和9表示 GeneRuler?lk:bPlusDNALadder。泳道2-6顯不了使用引物0g09和Ogl化對從野生型 自產己酸梭菌DSM23693(+ve，2. 7化）和6個潛在的自產己酸梭菌DSM23693budA基因敲除 (1-6, 2. 2化）中分離的基因組DNA的budA祀區域進行的PCR擴增。泳道10-16顯示了使用 對budA基因273bp的內部區域特異的引物0g44f和0g45i對從野生型（+ve)自產己酸梭 菌DSM23693和6個潛在的自產己酸梭菌DSM23693budA基因敲除中分離的基因組DNA進 行的PCR(*)。
[0082] 圖6;使用引物0g44f/0g45i和0g42f/0g4化對自產己酸梭菌DSM23693budA和 2, 3b化基因中RAM插入進行的PCR確認。
[0083] 圖7示出了自產己酸梭菌DSM23693和A2, 3b化ClosTron突變體在發酵過程中 將己偶姻轉化為下二醇的速率。
[0084] 序列表的簡單描沐
[0085] 該說明書附帶序列表，其中列出下面的序列：
[0086]Seq.ID1:自產己醇梭菌DSM23693budA基因的核巧酸序列。
[0087]Seq.ID2:自產己醇梭菌DSM23693budA蛋白的氨基酸序列。
[0088]Seq.ID3:自產己醇梭菌DSM23693budA基因的5'側翼區的核巧酸序列。
[0089]Seq.ID4:budA基因的3'側翼序列的核巧酸序列。
[0090] SeqID5-8和10和11:如下文表1中描述的。
[0091]Seq.ID9:大腸桿菌-梭菌穿梭載體-質粒PMTL85141的核巧酸序列。
[0092]Seq.ID. 12:pMTL85141-budA-ko的核巧酸測序結果，其表明該質粒上存在的側翼 DNA片段不含有突變。
[0093]SeqID13:自產己醇梭菌（Y18178, 01:7271109)的 16srRNA基因。
[0094]SeqID14:自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化體的克隆1的16srRNA 基因：（93% )的同一性。
[0095]Seq.ID15:自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化體的克隆2的16srRNA 基因；（94% )。
[0096]Seq.ID16:自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化體的克隆3的16srRNA 基因：（95% )。
[0097]Seq.ID17:自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化體的克隆4的16srRNA 基因：（93% )。
[0098]Seq.ID18:自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化體的克隆5的16srRNA 基因：（94% )。
[0099]Seq.ID19:自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化體的克隆6的16srRNA 基因：（92% )。
[0100]SeqID20.使用引物0g09f得到的自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化 體的克隆1的PCR產物的核巧酸測序結果（92% )。
[0101]SeqID21.使用引物Ogl化得到的自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化 體的克隆1的PCR產物的核巧酸測序結果（92% )。
[0102]SeqID22.使用引物Ogl化得到的自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化 體的克隆3的PCR產物的核巧酸測序結果（92% )。
[0103]SeqID23.使用引物Ogl化得到的自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化 體的克隆4的PCR產物的核巧酸測序結果（92% )。
[0104]SeqID24.使用引物Ogl化得到的自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化 體的克隆5的PCR產物的核巧酸測序結果。
[0105] SeqID25.使用引物0g09f得到的自產己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉化 體的克隆6的PCR產物的核巧酸測序結果。
[0106]SeqID26.使用引物Ogl化得到的克隆6的自產己醇梭菌DSM23693budA祀區域 的核巧酸測序結果。
[0107]SeqID27和28 ;在下文的表4中描述。
[0108]Seq29和30:在下文的表4中描述。
[0109]SEQID31:和誘導型lac啟動子融合的新的甲基轉移酶基因的核巧酸序列。
[0110] SEQID32:新的甲基轉移酶的蛋白序列。
[01川SEQID33:質粒PGS20的核巧酸序列。
[011引SEQ_IDNO34:自產己醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌的新的醇脫氨酶的氨基酸序 列。
[0113]SEQ_IDNO35:自產己醇梭菌的新的醇脫氨酶的核酸序列。
[0114]SEQ_IDNO36:揚氏梭菌的新的醇脫氨酶的核酸序列。
[0115]SEQ_IDNO37:拉氏梭菌的新的醇脫氨酶的核酸序列。
[0116]Seq.ID. 38:自產己醇梭菌的蘋果酸酶1的核巧酸序列。
[0117]Seq.ID. 39:自產己醇梭菌的蘋果酸酶1的氨基酸序列。
[0118]Seq.ID. 40:自產己醇梭菌的蘋果酸酶2的核巧酸序列。
[0119]Seq.ID. 41:自產己醇梭菌的蘋果酸酶2的氨基酸序列。
[0120]Seq.ID. 42:自產己醇梭菌的蘋果酸脫氨酶的核巧酸序列。
[0121]Seq.ID. 43:自產己醇梭菌的蘋果酸脫氨酶的氨基酸序列。
[0122] Seq.ID. 44:自產己醇梭菌的丙麗酸磯酸雙激酶的核巧酸序列。
[0123]Seq.ID. 45:自產己醇梭菌的丙麗酸磯酸雙激酶的氨基酸序列。
[0124]Seq.ID. 46:自產己醇梭菌的丙麗酸駿化酶的核巧酸序列。
[0125]Seq.ID. 47:自產己醇梭菌的丙麗酸駿化酶的氨基酸序列。
[0126]Seq.ID. 48:自產己醇梭菌的丙麗酸駿激酶的核巧酸序列。
[0127]Seq.ID. 49:自產己醇梭菌的丙麗酸駿激酶的氨基酸序列。
[012引 Seq.ID. 50:自產己醇梭菌的延胡索酸水合酶亞基A的核巧酸序列。
[0129]Seq.ID. 51:自產己醇梭菌的延胡索酸水合酶亞基A的氨基酸序列。
[0130]Seq.ID. 52:自產己醇梭菌的延胡索酸水合酶亞基B的核巧酸序列。
[0131]Seq.ID. 53:自產己醇梭菌的延胡索酸水合酶亞基B的氨基酸序列。
[0132]Seq.ID. 54:自產己醇梭菌的延胡索酸還原酶1的核巧酸序列。
[0133]Seq.ID. 55:自產己醇梭菌的延胡索酸還原酶1的氨基酸序列。
[0134]Seq.ID. 56:自產己醇梭菌的延胡索酸還原酶2的核巧酸序列。
[0135]Seq.ID. 57:自產己醇梭菌的延胡索酸還原酶2的氨基酸序列。
[0136]Seq.ID. 58:自產己醇梭菌的延胡索酸還原酶3的核巧酸序列。
[0137]Seq.ID. 59:自產己醇梭菌的延胡索酸還原酶3的氨基酸序列。
[013引 Seq.ID. 60:拉氏梭菌的蘋果酸酶1的核巧酸序列。
[0139]Seq.ID. 61:拉氏梭菌的蘋果酸酶1的氨基酸序列。
[0140]Seq.ID. 62:拉氏梭菌的蘋果酸脫氨酶的核巧酸序列。
[0141]Seq.ID. 63:拉氏梭菌的蘋果酸脫氨酶的氨基酸序列。
[0142]Seq.ID. 64:拉氏梭菌的丙麗酸磯酸雙激酶的核巧酸序列。
[0143]Seq.ID. 65:拉氏梭菌的丙麗酸磯酸雙激酶的氨基酸序列。
[0144]Seq.ID. 66:拉氏梭菌的丙麗酸駿化酶的核巧酸序列。
[0145]Seq.ID. 67:拉氏梭菌的丙麗酸駿化酶的氨基酸序列。
[0146]Seq.ID. 68:拉氏梭菌的丙麗酸駿激酶的核巧酸序列。
[0147]Seq.ID. 69:拉氏梭菌的丙麗酸駿激酶的氨基酸序列。
[014引 Seq.ID. 70:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亞基A的核巧酸序列。
[0149]Seq.ID. 71:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亞基A的氨基酸序列。
[0150]Seq.ID. 72:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亞基B的核巧酸序列。
[0151]Seq.ID. 73:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亞基B的氨基酸序列。
[0152]Seq.ID. 74:拉氏梭菌的延胡索酸還原酶1的核巧酸序列。
[0153]Seq.ID. 75:拉氏梭菌的延胡索酸還原酶1的氨基酸序列。
[0154]Seq.ID. 76:拉氏梭菌的延胡索酸還原酶2的核巧酸序列。
[0155]Seq.ID. 77:拉氏梭菌的延胡索酸還原酶2的氨基酸序列。
[0156]Seq.ID78:揚氏梭菌budA基因的5'上游序列或同源臂。
[0157]Seq.ID79:揚氏梭菌budA基因的3'下游序列或同源臂。
[0158]Seq.ID80:拉氏梭菌budA基因的5'上游序列或同源臂。
[0159]Seq.ID81:拉氏梭菌budA基因的3'下游序列或同源臂。
[0160]SeqID82:自產己醇梭菌DSM23693budA上ClosTron祀向區域的核巧酸序列。
[0161]SeqID83;自產己醇梭菌DSM23693 2, 3b化上ClosTron祀向區域的核巧酸序列。
[0162]SeqID84:用于篩選A2, 3b化ClosTron突變體的寡核巧酸0g42f。
[0163]SeqID85:用于篩選A2, 3b化ClosTron突變體的寡核巧酸0g43r。
[0164]Seq.ID86:使用引物fDl得到的從自產己醇梭菌DSM23693A2, 3b化ClosTron 克隆2擴增的16srRNAPCR產物的核巧酸序列。
[0165] SeqID87:使用引物rP2得到的從自產己醇梭菌DSM23693A2,3b化ClosTron 克隆2擴增的16srRNAPCR產物的核巧酸序列。
[0166]Seq.ID88:使用引物fDl得到的自產己醇梭菌DSM23693A2, 3b化ClosTron克 隆4的16srRNAPCR產物的核巧酸序列。
[0167] SeqID89:使用引物rP2得到的自產己醇梭菌DSM23693A2,3b化ClosTron克 隆4的16srRNAPCR產物的核巧酸序列。
[0168]Seq.ID90:使用引物fDl得到的自產己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron克隆1 的16srRNAPCR產物的核巧酸序列。
[0169]SeqID91:使用引物rP2得到的自產己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron克隆 1的16srRNAPCR產物的核巧酸序列。
[0170]Seq.ID92:使用引物fDl得到的自產己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron克隆 3的16srRNAPCR產物的核巧酸序列。
[0171]SeqIDand93:使用引物rP2 得到的自產己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron 克隆3的16srRNAPCR產物的核巧酸序列。
[0172]SeqID94 ;自產己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0173]SeqID95:自產己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0174]Seq.ID96和97:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的5'同源臂的引 物和。
[01巧]Seq.ID98和99:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的3'同源臂的引 物。
[0176]Seq.ID100和101:可用于確認自產己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因敲除的側翼 引物。
[0177]SeqID102:自產己醇梭菌DSM23693SecA化基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0178]SeqID103:自產己醇梭菌DSM23693SecA化基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0179]Seq.ID104和105:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的5'同源臂的 引物。
[0180]Seq.ID106和107 ;用于擴增自產己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的3'同源臂的 引物。
[0181]Seq.ID108和109:可用于確認自產己醇梭菌DSM23693SecA化基因敲除的側翼 引物。
[0182]SeqID110:自產己醇梭菌DSM23693SecA化基因的II類內含子祀向盒的核巧酸 序列。
[0183]Seq.ID111和112:可用于確認自產己醇梭菌DSM23693SecA化基因插入失活的 側翼引物。
[0184]SeqID113:自產己醇梭菌DSM23693alsS基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0185]SeqID114:自產己醇梭菌DSM23693alsS基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0186]Seq.ID115和116:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693alsS基因的5'同源臂的引 物序列。
[0187]Seq.ID117和118:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693alsS基因的3'同源臂的引 物序列。
[0188]Seq.ID119和120:可用于確認自產己醇梭菌DSM23693alsS基因敲除的側翼引 物的序列。
[0189]SeqID120:自產己醇梭菌DSM23693ilvC基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0190]SeqID121:自產己醇梭菌DSM23693ilvC基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0191]Seq.ID123和124:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693ilvC基因的5'同源臂的引 物序列。
[0192]Seq.ID125和126:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693ilvC基因的3'同源臂的引 物序列。
[0193]Seq.ID127和128:可用于確認自產己醇梭菌DSM23693ilvC基因敲除的側翼引 物的序列。
[0194]SeqID129:自產己醇梭菌DSM23693ilvl基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0195]SeqID130:自產己醇梭菌DSM23693ilvl基因的3'（Seq.ID130)同源臂的核 巧酸序列。
[0196]Seq.ID131和132:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693ilvl基因的5'同源臂的引 物序列。
[0197]Seq.ID133和134:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693ilvl基因的3'同源臂的引 物序列。
[0198]Seq.ID135和136:可用于確認自產己醇梭菌DSM23693ilvl基因敲除的側翼引 物的序列。
[0199]SeqID137:自產己醇梭菌DSM23693ilvB基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0200]SeqID138:自產己醇梭菌DSM23693ilvB基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0201] Seq.ID139和140:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693ilvB基因的5'同源臂的引 物序列。
[0202] Seq.ID141和142:用于擴增自產己醇梭菌DSM23693ilvB基因的3'同源臂的引 物序列。
[020引 Seq.ID143和144:可用于確認自產己醇梭菌DSM23693ilvB基因敲除的側翼引 物的序列。
[0204]SeqID145:alsS的ClosTron內含子祀向核巧酸序列的實例。
[0205]SeqID146:ilvC的ClosTron內含子碑1向核巧酸序列的實例。
[0206]SeqID147:ilvl的ClosTron內含子祀向核巧酸序列的實例。
[0207]SeqID148:ilvB的ClosTron內含子祀向核巧酸序列的實例。
[020引 SeqID149和150:可用于篩選alsSClosTron突變體的寡核巧酸。
[0209]SeqID151和152:可用于篩選ilvCClosTron突變體的寡核巧酸。
[0210] SeqID153和154:可用于篩選ilvlClosTron突變體的寡核巧酸。
[0211] SeqID155和156:可用于篩選ilvBClosTron突變體的寡核巧酸。
[021引 所有的序列都使用標準的IUPAC縮寫，參見ht化://en.m.W化ipedia.org/w化i/ Nucleic_acid_notation#section_l。例女口 ：
[0213] A腺嘿嶺核巧
[0214] C胞嚼巧核巧
[0215] G鳥嘿嶺核巧
[0216]T 胸腺嚼巧
[0引7] WAorT
[0引引 SC或G
[0引引 MA或C
[0220] KG或T
[022。 RA或G
[022引 YC或T
[022引 BC、G或 T
[0224] DA、G或 T
[022引 HA、C或 T
[022引 VA、C或 G
[0227]N或-任何堿基（不是缺口）、A、C、G、T【具體實施方式】
[022引 W下是在廣義上給出的對本發明（包括其優選的實施方案）的說明。下文在標題 "實施例"下給出的公開內容進一步解釋本發明，其提供了支持本發明的實驗數據、本發明 多個方面的具體實例W及實施本發明的方法。
[0229] 本發明提供了能夠通過發酵含C0的底物產生一種或多種產物的微生物。在一個 具體實施方案中，本發明提供了能夠通過發酵含C0的底物產生己醇，或己醇和一種或多種 其他產物的微生物。和親代微生物相比，所述重組微生物至少產生減少量的2, 3-下二醇和 /或其前體。在一種實施方案中，和親代微生物相比，所述微生物基本不產生2, 3-下二醇或 其前體。
[0230] 通過多種基因敲除研究，本發明人意外地鑒定出如果在一氧化碳營養型產己酸微 生物中破壞2, 3-下二醇生物合成途徑，則與親代微生物相比，所述微生物能夠產生增加水 平的甲酸、乳酸、玻巧酸、2-麗戊二酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和己醇。本發明人也認為所 述微生物產生了增加水平的丙麗酸和TCA循環中間體化合物己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、 巧樣酸，因為它們是玻巧酸、2-麗戊二酸和額氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生產的前體。該有很 多顯著的優勢。一個主要的優勢是己醇生產的效率的提高，包括產生的更高水平的己醇。不 希望園于任何具體理論，本發明人認為額氨酸、亮氨酸、甲酸、乳酸和丙麗酸的水平的增加 使得微生物可用更多該些化學物質來供給己醇產生。另外，必須經常用氨基酸和其他化學 物質補充發酵液W確保發酵過程中微生物的生存能力和生產效率。通過本發明重組微生物 產生額氨酸、亮氨酸、甲酸、乳酸和丙麗酸可W不再需要用該些化學物質補充發酵液，節約 了成本。另外，本發明的微生物中降低或去除2, 3-下二醇產生也具有優勢。2, 3-下二醇可 能對微生物有毒并因此可對發酵和生長產生負面影響。降低或去除發酵液中的2, 3-下二 醇也使得更容易從發酵液中回收己醇；通常必須一起回收己醇和2, 3-下二醇并且接著將 它們在隨后的步驟中分離。因為2, 3-下二醇是很多有害生物的底物，因此它也是發酵罐中 的潛在的微生物污染源。另外，由于玻巧酸、2-麗戊二酸、甲酸、乳酸、丙麗酸、額氨酸、亮氨 酸和異亮氨酸可用于很多商業過程并且可在下游化學產物生產中用作中間體化合物，因此 它們具有獨立的經濟價值。
[0231] 本發明人已經首次證明了在一氧化碳營養型產己酸微生物中非必需基因的破壞 或敲除。相應地，在另一方面，本發明也提供了一氧化碳營養型產己酸微生物W及產生該些 微生物的方法和使用該些微生物的方法，其中和親代微生物相比，所述微生物的一種或多 種非必需基因已被破壞。"非必需基因"是編碼該樣一種蛋白的基因，所述蛋白不是微生物 生存所必需的，因此不補充該蛋白微生物也能生存。非必需基因的實例包括編碼己醜乳酸 脫駿酶和2, 3-下二醇脫氨酶的那些基因。技術人員能夠使用本領域的標準技術（包括破 壞基因（如本文所述）的重組技術W及測試該些遺傳修飾是否對微生物的生存產生影響的 標準測定法）鑒定非必需基因。
[0232] 雖然下文本發明的描述將重點放在通過遺傳修飾對2, 3-下二醇生物合成途徑的 破壞上，應理解如果需要的話本發明的微生物也可包括一種或多種其他的遺傳修飾（包括 破壞一種或多種與2, 3-下二醇生物合成途徑無關的非必需基因）。對于涉及破壞非必需基 因的本發明方面，應理解包括對編碼不是2, 3-下二醇途徑中的酶的基因的遺傳修飾。
[0233] 另外，盡管下文的描述可能將重點放在作為主產物的己醇的產生和回收上，應理 解本發明可用于提高一種或多種非己醇的產物的產生水平或者除了己醇之外還同時提高 一種或多種產物的產生水平。
[0234] 定父
[0235] 本文中提到的"發酵液"是包含至少一種營養培養基和細菌細胞的培養基。
[0236] 本文中提到的穿梭微生物是其中表達甲基轉移酶的微生物，并且其不同于目標微 生物。
[0237] 本文中提到的目標微生物是其中表達包括在表達構建體/載體上的基因的微生 物，并且其不同于所述穿梭微生物。
[023引術語"主要發酵產物"意指W最高的濃度和/或產率產生的那種發酵產物。
[0239]當用于發酵過程時，術語"提高效率"、"提高的效率"等包括但不限于提高如下中 的一個或多個：催化所述發酵的微生物的生長速率、生長和/或產物產生速率、產生的所需 產物（例如醇）的體積/消耗的底物的體積、所需產物的產生速率或產生水平、W及產生的 所需產物與所述發酵的其他副產物相比的相對比例。
[0240] 短語"含一氧化碳的底物"及類似術語應被理解為包括任意底物，其中一氧化碳可 被一種或多種細菌菌株用于例如生長和/或發酵。
[0241] 短語"含一氧化碳的氣態底物"及類似短語和術語包括含有某一水平一氧化碳的 任意氣體。在某些實施方案中，所述底物含有至少約20體積％至約100體積％的C0、20體 積％至70體積％的C0、30體積％至60體積％的C0、和40體積％至55體積％的C0。在具 體實施方案中，所述底物包含約25體積％、或約30體積％、或約35體積％、或約40體積％、 或約45體積％、或約50體積％的C0、或約55體積％的C0、或約60體積％的C0。
[0242] 雖然所述底物不必需含有任何氨氣，但是存在&應該不會對本發明方法的產物不 利。在具體實施方案中，存在氨氣可獲得提高的醇產生的整體效率。例如，在具體實施方案 中，所述底物可包含約2:1、或1:1或1:2比例的CO。在一個實施方案中，所述底物包含 約30體積％或更低的&、20體積％或更低的&、約15體積％或更低的&、或者約10體積％ 或更低的&。在其他實施方案中，所述底物流包含低濃度的&，例如小于5體積％、或小于4 體積％、或小于3體積％、或小于2體積％、或小于1體積％或者基本上不含氨氣。例如，所 述底物還可含有一些CA，例如約1體積％至約80體積％的0)2、或1體積％至約30體積％ 的CA。在一個實施方案中，所述底物包含小于或等于約20體積％的0)2。在具體的實施方 案中，所述底物包含小于或等于約15體積％的C〇2、小于或等于約10體積％的C〇2、小于或 等于約5體積％的(?或者基本上不含〔化。
[0243] 在W下的說明書中，從遞送和發酵"含C0的氣態底物"的方面描述本發明的實施 方案。但是，應理解，所述氣態底物可W其他形式提供。例如，所述含C0的氣態底物可W溶 解于液體中的形式提供。實質上，將液體用含一氧化碳的氣體飽和，然后將所述液體加入 生物反應器中。該可使用標準的方法學實現。例如，可使用微泡分散發生器化ensirisak et.al.Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation； AppliedBiochemistryandBiotechnologyVolume101，Number3/〇ctober，2002)。又例 女口，可將所述含CO的氣態底物吸附到固態支持物上。該些替代方法被術語"含CO的底物" 等所涵蓋。
[0244] 在本發明的具體實施方案中，所述含C0的氣態底物是工業排氣或廢氣。"工業廢 氣或工業排氣"應被廣義地認為包括工業過程產生的任何含C0的氣體，并且包括鐵金屬產 品生產、有色金屬產品生產、石油精煉過程、煤的氣化、生物質的氣化、電力生產、炭黑生產 和焦炭生產所產生的氣體。本文其他部分還提供了另外的實例。
[0245] 除非另有說明，否則本文所用的短語"發酵"、"發酵過程"或"發酵反應"等意圖包 括所述過程的生長階段和產物生物合成階段。如下所述，在一些實施方案中，所述生物反應 器可包括第一生長反應器和第二發酵反應器。因此，向發酵反應中加入金屬或組合物應被 理解為包括加入到該些反應器之一或兩個中。
[0246] 術語"生物反應器"包括由一個或多個容器和/或培或管道排布組成的發酵裝置， 其包括連續攬拌蓋反應器（CSTR)、固定化細胞反應器（ICR)、滴流床反應器（TBR)、鼓泡培、 氣升式發酵罐、靜態混合器或適用于氣-液接觸的其他容器或其他裝置。如下所述，在一些 實施方案中，所述生物反應器可包含第一生長反應器和第二發酵反應器。因此，當提到向所 述生物反應器或發酵反應中加入底物時，如果合適，應該理解為加入到該些反應器之一或 兩個中。
[0247]當用于依據本發明的發酵產物時，"一種或多種產物"等類似的短語意指包括例如 己醇、玻巧酸、丙麗酸、乳酸、額氨酸、甲酸、異亮氨酸和亮氨酸。在一個實施方案中，"一種或 多種產物"也可包括己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、巧樣酸、和2-麗戊二酸中的一種或多種。 應理解本發明的方法適用于意在用于己醇（單獨或與其他產物結合）的產生和回收或除了 己醇之外的產物的產生和回收的方法。
[024引所述術語"己酸鹽"包括單獨的己酸鹽，W及分子或游離己酸與己酸鹽的混合物， 例如存在于如本文可能描述的所述發酵液中的己酸鹽和游離己酸的混合物。所述發酵液中 的分子己酸與己酸鹽的比例取決于所述系統的抑。術語玻巧酸、丙麗酸、乳酸、甲酸、己醜乳 酸、蘋果酸、延胡索酸、巧樣酸、和2-麗戊二酸應被相似地理解。
[0249] 除非另有說明，提到本文任何可W-種或多種異構形式（例如，D、L、內消旋、S、R、 順式或反式形式）的化合物，應通常被認為包括提到所述化合物的任何一種或多種該樣的 異構體。例如，提到"己偶姻"應被認為包括提到其D和L異構體之一或兩者。
[0250] "外源核酸"是源自待引入其的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任意適合的來 源，包括但不限于待引入它們的微生物、與待引入它們的生物不同的微生物菌株或種，或者 它們可通過人工或重組方法形成。所述外源核酸可被改造為適于整合到待引入其的微生物 的基因組中，或者保持染色體外狀態。
[0巧1] 所述"2, 3-下二醇生物合成途徑"是一種反應途徑，所述反應包括將丙麗酸轉化成 己醜乳酸、將己醜乳酸轉化成己偶姻、和將己偶姻轉化成2, 3-下二醇。
[0巧2] 如本文使用的，"破壞所述2, 3-下二醇生物合成途徑"等類似的短語意指降低 2, 3- 了二醇的產生，或在一種實施方案中基本消除（eliminated) 2, 3- 了二醇的產生。 [0253] "2, 3- 了二醇的前體"意指涵蓋己偶姻和己醜乳酸。
[0巧4] 酶"能夠轉化"第一化合物或底物為第二化合物或產物，如果W其活性形式存在， 酶能夠催化其中至少一部分第一化合物被轉化為第二化合物的反應。
[0巧5] 提到"醇脫氨酶"應被認為包括能夠催化麗（例如己偶姻）轉化為仲醇（例如 2, 3-下二醇）的醇脫氨酶，或者反之亦然。該樣的醇脫氨酶包括仲醇脫氨酶和伯醇脫氨酶。 "仲醇脫氨酶"是可將麗（例如己偶姻）轉化為仲醇（例如2, 3-下二醇）的醇脫氨酶，或 反之亦然。"伯醇脫氨酶"是可將酵轉化為伯醇的醇脫氨酶，或反之亦然；但是，許多伯醇脫 氨酶也能夠催化麗轉化為仲醇，或反之亦然。該些醇脫氨酶也可稱為"伯醇-仲醇脫氨酶"。 因此，在本發明的某些實施方案中，提到"2, 3-下二醇脫氨酶"應被認為包括提到可能被歸 類為伯醇、仲醇或伯醇-仲醇脫氨酶的2, 3-下二醇脫氨酶。
[0巧6]"遺傳修飾"一所述遺傳修飾破壞了 2, 3-下二醇生物合成途徑或破壞了依據本 發明的一種或多種酶的表達或活性一應被廣義地認為包括任何該樣的遺傳修飾，所述遺 傳修飾至少降低了 2, 3-下二醇的生物合成、一種或多種酶的表達或活性或者在一些實施 方案中基本抑制了一種或多種酶的表達或活性或基本阻止了 2, 3-下二醇的產生。所述短 語應被認為包括，例如：對編碼一種或多種所述酶的基因的修飾（包括對參與基因表達的 基因調節元件的修飾）；核酸的引入，所述核酸產生降低或抑制了一種或多種所述酶活性 的蛋白、或者降低或阻止了一種或多種所述酶表達的蛋白；核酸的引入，所述核酸表達被改 造為適于阻斷基因表達的核酸（例如，反義RNA、siRNA(小干擾RNA)、CRISPR(成簇的規律 間隔的短回文重復序列））；通過將修飾引入到編碼蛋白的基因中來降低或抑制所述蛋白， 所述蛋白是一種或多種所述酶的表達或活性所必需。應理解一種或多種所述酶的表達或活 性所需的蛋白可直接作用于一種基因或一種或多種酶，或可間接通過其他化合物起作用。 相似地，降低或抑制一種或多種所述酶的活性或表達的蛋白可直接作用于所述基因或所述 一種或多種酶，或可間接通過其他化合物起作用。
[0巧7]"基因修飾"應被廣義地認為并且意指包括，例如，將一種或多種外源核酸引入到 微生物中、將突變引入基因位點上、添加或從基因組中移除一種或多種核巧酸、用不同的核 巧酸置換一種或多種核巧酸、置換基因、移除基因、添加基因等等。
[0巧引"親代微生物"是用于產生本發明的重組微生物的微生物。在一種實施方案中，所 述親代微生物可W是天然存在的微生物（即野生型微生物）或之前曾被修飾過的微生物 (遺傳修飾的或重組微生物）。在本發明涉及產生降低量的或基本不產生2, 3-下二醇的微 生物的實施方案中，所述親代微生物是含有功能性的2, 3-下二醇途徑的微生物（包括天然 存在的微生物或之前曾被修飾過的微生物）。含有功能性的2, 3-下二醇生物合成途徑的親 代微生物的實例包括自產己醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、科斯卡培梭菌W及相關分離株。
[0巧9]"功能性"的2, 3-下二醇生物合成途徑是其中微生物能將丙麗酸轉化成2, 3-下二 醇的途徑。在一個具體實施方案中，所述途徑包括將丙麗酸轉化成己醜乳酸、將己醜乳酸轉 化成己偶姻、和將己偶姻轉化成2, 3-下二醇。在一個具體實施方案中，丙麗酸轉化成己醜 乳酸是由己醜乳酸合酶催化的、己醜乳酸轉化成己偶姻是由己醜乳酸脫駿酶催化的、己偶 姻轉化成2, 3-下二醇是由2, 3-下二醇脫氨酶或己偶姻還原酶催化的。
[0260] 術語核酸"構建體"或"載體"及類似術語應被廣義地認為包括適合用作載體將遺 傳物質轉移到細胞中的任意核酸（包括DNA和RNA)。該術語應被認為包括質粒、病毒（包 括瞻菌體）、粘粒和人工染色體。構建體或載體可包括一種或多種調節元件、復制起點、多克 隆位點和/或選擇標記。在具體的實施方案中，所述構建體或載體被改造為適于破壞親代 微生物中天然存在的基因。在另一個實施方案中，所述構建體或載體被改造為適于使得由 所述構建體或載體編碼的一種或多種基因表達。核酸構建體或載體包括裸露核酸，W及用 一種或多種可幫助向細胞遞送中的試劑配制的核酸（例如脂質體綴合的核酸、其中含有所 述核酸的有機體）。
[0261] 在說明書通篇中，提供了適用于本發明的酶的示例性序列信息（例如，己醜乳酸 合酶、己醜乳酸脫駿酶、2, 3-下二醇脫氨酶、己偶姻還原酶）。提供該信息用來鑒定適用于 本發明的示例性酶并且使得技術人員能夠實施本發明的具體實施方案而無需過多實驗。應 理解酶的核酸序列和氨基酸序列可根據微生物的不同而不同。因此，本發明不應被理解為 僅限于該些具體的實施方案，而是應被理解為延伸到對該樣的酶的破壞，即所述酶具有不 同的序列但是能夠催化丙麗酸轉化成己醜乳酸、己醜乳酸轉化成己偶姻和/或己偶姻轉化 成2, 3-下二醇。通常，所述酶具有和本文示例性的酶至少約75%的氨基酸序列同一性。在 具體實施方案中，所述酶具有和本文示例性的酶至少約80%、85%、90%、95%或99%的序 列同一性。在所述核酸水平上，編碼該些變體酶的基因具有和編碼本文示例性的酶的核酸 至少約75%的序列同源性。在具體實施方案中，該些核酸具有和編碼本文示例性的酶的核 酸至少約80 %、85 %、90 %、95 %或99 %的序列同源性。
[0262] 也應理解所述變體酶不需要具有和本文具體示例性的酶相同的活性水平。只 需要所述酶在催化目的轉化時具有某些活性水平。技術人員會容易理解其他該樣的酶， 尤其是考慮到本文所包含的信息。用于評估所述2, 3-下二醇途徑的酶的活性的酶測定 法包括例如由SpeckmanandCollins(SpecificityoftheWesterfeldAdaptationof theVoges-ProskauerTest, 1982,Appl.Environ.Microbiol. 44:40-43)或Dulieuand Poncelet(Spectrophotometricassayofaacetolactatedecarboxylase,1999,Enzy andMicrobiolTechnol, 25, 537-42)記載的Voges-Proskauertest測定法。
[026引微牛物
[0264] 如上文所述，本發明提供了重組微生物，所述重組微生物能夠使用一氧化碳產生 一種或多種產物（在一個具體實施方案中，己醇作為主要產物）并且與親代微生物相比能 夠產生減少量的或基本不產生2, 3-下二醇和/或其前體。所述微生物包含破壞了 2, 3-下 二醇生物合成途徑的一種或多種遺傳修飾（和親代微生物相比）。
[0265] 如上所述，在一個實施方案中，所述微生物產生己醇作為主要產物。在一個實施方 案中，所述微生物也產生甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸中的一種或 多種。在一個實施方案中，所述微生物被改造為適于產生與親代微生物相比的增加量的己 醇、甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸中的一種或多種。在某些實施方 案中，所述微生物產生己醜乳酸、蘋果酸、巧樣酸、延胡索酸、2-麗戊二酸中的一種或多種。 在一個具體實施方案中，所述微生物被改造為適于產生增加量的己醜乳酸、蘋果酸、延胡索 酸、2-麗戊二酸中的一種或多種。
[0266] 所述一種或多種遺傳修飾優選破壞能夠將丙麗酸轉化成己醜乳酸、將己醜乳酸轉 化成己偶姻、將己偶姻轉化成2, 3-下二醇的一種或多種酶的表達和/或活性。在某些實施 方案中，所述一種或多種遺傳修飾僅破壞丙麗酸到己醜乳酸的轉化、僅破壞己醜乳酸到己 偶姻的轉化或僅破壞己偶姻到2, 3-下二醇的轉化。在其他實施方案中，所述一種或多種遺 傳修飾破壞了該些轉化中的兩種或H種。
[0267] 在一個實施方案中，所述一種或多種能將丙麗酸轉化為己醜乳酸的酶是己醜乳酸 合酶（als巧。
[026引己醜乳酸合酶活性能夠將丙麗酸轉化成己醜乳酸并且是支鏈氨基酸（包括額氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸）產生所必需的（圖1)。可在親代微生物中表達具有己醜乳酸合 酶活性的一種或多種酶。可從GenBank中獲得自產己醇梭菌（AEI90719. 1、AEI90730. 1、 AEI90731. UAEI90713. UAEI90714. 1)、揚氏梭菌（ADK15104. UADK15104. UADK15105. 1、 ADK15400. 1、ADK15400. 1)和拉氏梭菌（AEI90734. 1、AEI907：M. 1、AEI90735. 1、 AEI90727. 1、AEI90727. 1)的示例性氨基酸序列W及自產己醇梭菌（冊876013. 1、 冊876023. 1、冊876021. 1)、揚氏梭菌（CP001666. 1-化JU_c38920、化JU_c32420、化JU_ C20420-30)和拉氏梭菌（冊876014. 1、冊876024. 1、冊876022. 1)的各自核酸序列。但是，女口 上文所述，編碼所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根據微生物的不同而變化。
[0269] 在某些實施方案中，親代微生物可包含一種W上能夠將丙麗酸轉化成己醜乳酸的 酶。當親代微生物含有一種W上能夠將丙麗酸轉化成己醜乳酸的酶時，可引入一種或多種 基因修飾W使得破壞兩種或多種所述酶的表達和/或活性。當親代微生物中存在一種W上 酶時，破壞一種W上所述酶可能產生W下作用：將玻巧酸、一種或多種TCA循環中間體和/ 或己醇的產生增加到高于僅破壞單個酶時可達到的水平。可通過破壞存在于所述親代微生 物中的每一個額外的酶來進一步提高產生水平。雖然破壞所有所述酶的表達和/或活性可 在所需產物的產生方面提供一些優勢，本發明人認為不必破壞所有所述酶的表達和/或活 性即可獲得本發明的有益效果。
[0270] 在一個實施方案中，至少兩種、H種、四種或五種能夠將丙麗酸轉化為己醜乳酸的 酶被破壞。
[0271] 在本發明的實施方案中，當丙麗酸到己醜乳酸的轉化基本或全部被阻斷時，微生 物的生長和通過微生物的發酵可能需要補充一種或多種氨基酸（包括，例如，額氨酸、亮氨 酸和異亮氨酸）。該可通過任何使氨基酸能夠被微生物利用的方法來實現。例如，可將一 種或多種氨基酸加入到培養、生長或發酵培養基中、微生物的培養物中、和/或發酵液中。 在某些實施方案中，可將氨基酸直接加入到培養基或發酵液中或W提取物（例如酵母提取 物）的形式加入。
[0272] 在一個實施方案中，所述一種或多種能將己醜乳酸轉化為己偶姻的酶是己醜乳酸 脫駿酶（budA)。
[0273] 己醜乳酸脫駿酶活性能夠將己醜乳酸轉化為己偶姻（圖1)。可在親代微生物中表 達具有己醜乳酸脫駿酶活性的一種或多種酶。可從GenBank中獲得自產己醇梭菌、揚氏梭 菌和拉氏梭菌的己醜乳酸脫駿酶的示例性氨基酸（AEI90717. 1、ADK13906. 1、AEI90718. 1) 和核酸（冊876011. 1、CP001666. 1-化JU_c08380、冊876012. 1)序列信息。但是，如上文所 述，編碼所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根據微生物的不同而變化。
[0274] 在某些實施方案中，親代微生物可包含一種W上能夠將己醜乳酸轉化為己偶姻的 酶。當親代微生物含有一種W上該類酶時，可引入一種或多種基因修飾W使得破壞兩種或 多種所述酶的表達和/或活性。當親代微生物中存在一種W上所述酶時，破壞一種W上所 述酶可能產生W下作用：將額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醇、乳酸、甲酸和玻巧酸、和/或一 種或多種TCA循環中間體的產生增加到高于僅破壞單個酶時可達到的水平。可通過破壞存 在于所述親代微生物中的每一個額外的酶來進一步提高產生水平。雖然破壞所有所述酶的 表達和/或活性可在所需產物的產生方面提供一些優勢，本發明人認為不必破壞所有所述 酶的表達和/或活性即可獲得本發明的有益效果。
[0275] 在一個實施方案中，所述一種或多種能將己偶姻轉化為2, 3-下二醇的酶選自 2, 3-下二醇脫氨酶（2, 3-b化）和己偶姻還原酶。
[0276] 2, 3-下二醇脫氨酶活性是能夠將己偶姻轉化為2, 3-下二醇（圖1)。可從 GenBank中獲得自產己醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌的己醜乳酸脫駿酶的示例性氨基酸 (AEI90715. 1、ADK15380. 1、AEI90716. 1)和核酸（冊876009. 1、CP001666.l-CLJU_c23220、 冊876010. 1)序列信息。可在親代微生物中表達具有己醜乳酸合酶活性的一種或多種酶。 例如，本發明人已經鑒定出自產己醇梭菌、拉氏梭菌和揚氏梭菌含有其他能夠將己偶姻轉 化為2,3-下二醇的伯醇；仲醇脫氨酶。569 1〇11〇334、35、36和37中提供了該酶的示例性 序列信息。但是，如上文所述，編碼所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根據微生 物的不同而變化。
[0277] 在某些實施方案中，親代微生物可包括一種W上能夠將己偶姻轉化為2, 3-下二 醇的酶。當親代微生物含有一種該類酶時，可引入一種或多種基因修飾W使得破壞兩種或 多種所述酶的表達和/或活性。當親代微生物中存在一種W上該類酶時，破壞一種W上該 類酶可能具有W下作用：將額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醇、乳酸、甲酸和玻巧酸、和/或一 種或多種TCA循環中間體的產生增加到高于僅破壞單個酶時可達到的水平。可通過破壞存 在于所述親代微生物中的每一個額外的酶來進一步提高產生水平。雖然破壞所有所述酶的 表達和/或活性可在所需產物的產生方面提供一些優勢，本發明人認為不必破壞所有所述 酶的表達和/或活性即可獲得本發明的有益效果。
[027引在一個實施方案中，至少兩種或H種能夠將己偶姻轉化為2, 3-下二醇的酶被破 壞。
[0279] 在一個實施方案中，所述微生物選自產己酸一氧化碳營養型生物，包括自產己醇 梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌（Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium化akei)、糞味梭菌（Clostridiumscatologenes)、醋酸梭菌（Clostridium aceti州m)、蟻酸醋酸梭菌（Clostridiumformicoaceti州m)、大梭菌（Clostridium ma即um)、伍氏醋酸桿菌（Acetobacteriumwoodii)、己氏嗜堿菌（A化aliba州lum bacchii)、熱醋穆爾氏菌（Moorellathermoacetica)、卵形鼠抱菌（Sporomusaovate)、甲 基營養下酸桿菌炬utyribacteriummeth}dot;ro地i州m)、Blautiaproducta、齡泥真桿菌 (Eubacteriumlimosum)、凱伍熱厭氧菌（Thermoanaerobacterkiuvi)。
[0280] 該些一氧化碳營養型產己酸菌由它們在形成己醜-CoA、己酸鹽和其他產物的 厭氧條件下利用并W氣態一碳（C1)來源（例如一氧化碳（C0)和含有C0和/或氨氣 化）的二氧化碳（C〇2))作為能源而進行化能自養生長的能力定義。所述一氧化碳營養 型產己酸菌具有相同的發酵模式，Wood-Uungd址1或還原性己醜-CoA途徑，并且由W 下酶組的存在定義，所述酶組包括一氧化碳脫氨酶（C0DH)、氨化酶、甲酸脫氨酶、甲醜四 氨葉酸合成酶、亞甲基四氨葉酸脫氨酶、甲醜四氨葉酸環水解酶、亞甲基四氨葉酸還原 酶和一氧化碳脫氨酶/己醜-CoA合酶（C0DH/ACS)，該組合是該類細菌特征性的和特有 的值rake,肺sel,Matthies,Wood, &Ljungd址1,2006)。與糖發酵細菌的化能自養生長 相比一所述糖發酵細菌能將底物轉化為生物質、次級代謝產物和從其形成產物（通過 己醜-CoA或直接形成）的丙麗酸，在產己酸菌中底物被直接輸送（channel)轉化為己 醜-CoA，從己醜-CoA形成產物、生物質和次級代謝產物。
[0281] 在一個實施方案中，所述微生物選自一組一氧化碳營養型梭菌，所述梭菌包括 自產己醇梭菌、揚氏梭菌、和拉氏梭菌W及相關分離株。該些包括但不限于自產己醇梭 菌JAI-IT值SM10061) (Abrini,化veau，&Nyns, 1994)、自產己醇梭菌LBS1560(DSM19630) (W0/2009/064200)、自產己醇梭菌LBS1561 (DSM23693)、揚氏梭菌陽TCT值SM13528 = ATCC55383) (Tanner，Miller，&Yang, 1993)、揚氏梭菌邸I-2(ATCC55380)(美國專利 5,593,886)、揚氏梭菌〇01(410： 55988)(美國專利 6,368,819)、揚氏梭菌0-52(410： 55989)(美國專利6, 368, 819)、或"拉氏梭菌PllT"(ATCCBAA-622) (W0 2008/028055)、和 相關分離株例如"科斯卡培梭菌"扣S專利2011/0229947)、W及其突變株（例如，揚氏梭 菌 0TA-1)(Tirado-Acevedo0.ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsing Clostridium1jungdahlii.PhDthesis,NorthCarolinaStateUniversity, 2010)。
[028引 該些菌株形成梭菌rRNAI群內的亞群（Collinsetal.，1994)，盡管如DNA-DNA 再結合和DM指紋印跡實驗所測定的，所述菌株是不同的種屬，但是它們在16SrRNA基因 水平上具有至少99%的同一性（W0 2008/028055,美國專利2011/02299470)。
[0283] 該群的菌株由共有的特征定義，它們有著類似的基因型和表型，同時它們均具有 相同的保存能量的模式和發酵代謝模式。該群菌株缺少細胞色素并通過Rnf復合體保存能 量。
[0284]該組的所有菌株的基因組大小為約4. 2MBp(K坤keetal.，2010)和GC組成 為約 32 %mol(Abrinietal. , 1994;Kiipkeetal. , 2010;Tanneretal. , 1993)(WO 2008/028055;美國專利2011/0229947)并具有保守的必要關鍵基因操縱子，所述操縱子編 碼Wood-Uungd址1途徑的酶（一氧化碳脫氨酶、甲醜-四氨葉酸合成酶、亞甲基-四氨葉酸 脫氨酶、甲醜-四氨葉酸環水解酶、亞甲基-四氨葉酸還原酶和一氧化碳脫氨酶/己醜-CoA 合酶）、氨化酶、甲酸脫氨酶、化f復合體（rnfCDGEAB)、丙麗酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶、 酵：鐵氧還蛋白氧化還原酶（K6pkeetal. , 2010, 2011)。已經發現所述Wood-Ljungd址1 途徑基因（負責氣體攝取）的結構和數目在所有種屬中都是一樣的，盡管在核酸和氨基酸 序列上不同（K6pkeetal.，2011)。
[0285] 所述菌株都有著類似的形態和大小（對數生長細胞為0.5-0. 7X3-510ym)，是 嗜溫的（最適生長溫度為30-37°C)并且為嚴格厭氧菌（Abrinietal. , 1994;Tanneret al.，1993)(WO2008/028055)。而且，它們都具有相同的主要系統發育特征，例如相同的pH 范圍（pH4-7. 5,最適的初始抑為5. 5-6)、依賴含CO的氣體W類似的生長速率進行強的 自養生長、W及代謝譜一W己醇和己酸作為主要發酵終產物并且在某些條件下形成的少量 2, 3-了二醇和乳酸（Abrinietal., 1994;Kiipkeetal., 2010;Tanneretal., 1993) (WO2008/02805W。所有的種都發現有巧隙產生。但是，所述種在對不同糖（例如鼠李糖、 阿拉伯糖）、酸（例如葡萄糖酸、巧樣酸）、氨基酸（例如精氨酸、組氨酸）、或其它底物（例 如甜菜堿、下醇）的底物利用上是不同的。發現一些種是某些維生素（例如硫胺素、生物 素）的營養缺陷型而其它種則不是。在該些生物范圍內已經顯示出駿酸被還原成它們對應 的醇（Perez,Richter,Lof1:us, &Angenent, 2012)。
[0286]因此所述特征不是一種生物（如自產己醇梭菌或揚氏梭菌）所特有的，而是一氧 化碳營養型的且能夠合成己醇的梭菌屬的一般特征。因此，可預期本發明可用于該些菌株， 盡管表現上可能會有不同。
[0287] 在某些實施方案中，所述親代微生物選自自產己醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌。在 一個實施方案中，該組也包括科斯卡培梭菌。在一個具體實施方案中，所述親代微生物是自 產己醇梭菌DSM23693。
[028引可使用任意數量的已知的轉化和重組核酸技術修飾親代微生物W得到本發明 的微生物。該些技術記載于例如Sambrooketal, (Mole州larCloning:A1油oratory manual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY, 1989)中。又例 女口，可使用下文實施例部分描述的方法。
[0289] 一般舉例來說，在將突變引入基因、或破壞或敲除基因的情況下，可設計合適的核 酸構建體或載體W整合到親代微生物的基因組中W破壞所述基因。該些構建體通常包括和 待破壞的基因內區域或側翼區域同源的核酸序列（同源臂），該樣使得能夠發生同源重組， 并且能夠發生突變的引入、該基因的一個核酸區域的切除、或用不同的核酸對一個基因區 域的置換。雖然優選的是所述構建體的同源臂和他們祀向的基因組上的區域具有100%的 互補性，但是該也不是必須的，只要序列足夠互補W使得能夠和目的基因區域祀向重組。通 常，如Sambrooketal1989中所定義的，同源臂具有能夠使得在嚴格條件下與祀向區域雜 交的同源性水平。
[0290] 考慮到參與2, 3-下二醇生物合成途徑的酶的可用序列信息，技術人員會了解足 W允許將外源基因祀向同源重組和整合到親代微生物基因組中的核酸序列。但是，例如，在 budA的例子中，可使用本文描述的側翼同源臂（例如，SeqID3、4和78-81)，或者在揚氏梭 菌的例子中，可從GenBank上的核酸序列信息設計本文描述的側翼同源臂（CP000166. 1)。 又例如，可從相關微生物的基因組序列信息中確定依據本發明的待破壞的編碼酶的基因的 側翼序列。具體舉例來說，可從GenBankCP001666.1上的信息中確定揚氏梭菌中的側翼序 列。
[0291]W其他一般實例來說，當將核酸引入到親代微生物W用來表達抑制2, 3-下二醇 生物合成途徑的酶的表達和/活性的蛋白或核酸時、或用來表達提高抑制2, 3-下二醇生物 合成途徑的酶的表達和/活性的化合物表達的蛋白時，可設計構建體W使得所述蛋白在微 生物中表達。通常，構建體包括合適的調節元件（包括啟動子）。可使用組成型或誘導型啟 動子。
[0292] 當本發明采用通過引入突變等對基因的直接破壞時，如上所述，用于轉化所述親 代微生物的構建體或載體會被改造為適于整合到微生物的基因組中。在表達蛋白或核酸的 情況下一所述蛋白或核酸被改造為適于破壞2, 3-下二醇生物合成途徑的酶的表達或活 性、或者適于提高參與該途徑的酶的抑制劑的表達或活性，所述構建體在轉化親代微生物 時可保持染色體外狀態或可被改造為適于整合到所述微生物的基因組中。因此，用于本發 明的構建體可包括核巧酸序列，所述核巧酸序列被改造為適于幫助整合（例如可允許同源 重組并祀向整合到宿主基因組中的區域）或幫助染色體外構建體的表達和復制（例如復制 起點、啟動子和其他調節元件或序列）。
[0293] 可使用任意數量的本領域的標準技術構建用于本發明的核酸構建體。例 女口，可使用化學合成或重組技術。該類技術記載于例如，Sambrooketal(Mole州lar Cloning:Alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring Harbor,NY, 1989)。其他示例性技術記載于下文的實施例部分。實質上，所述個體基因、調節 元件、同源臂等等將被可操作地相互連接W使得它們能夠執行它們的所需功能。本領域普 通技術人員會了解用于本發明的適當載體。但是，舉例來說，下述載體可能是適合的；pMTL、 pIMP、pJIR和下文實施例部分所示例的質粒。
[0294] 應理解，用于產生本發明的微生物的核酸可W是任何適合的形式，包括DNA、RNA 或cDNA(包括雙鏈和單鏈核酸）。
[0295] 可將所述一種或多種外源核酸W裸露核酸形式遞送到親代微生物或可將其用一 種或多種可促進轉化過程的試劑配制（例如脂質體綴合的核酸、其中含有所述核酸的有機 體）。合適時，所述一種或多種核酸可W是DNA、RNA或其組合。
[0296] 可使用任意數量的本領域中已知用于產生重組微生物的技術由親代微生物和一 種或多種外源核酸制備本發明的微生物。僅舉例來說，轉化（包括轉導或轉染）可通過電 穿孔、接合（con化gation)、原瞻菌體誘導、或化學感受態或天然感受態來實現。適合的轉化 技術記載于例女口SambrookJ,FritschEF,ManiatisT:Mole州larCloning:Alaboratory Manual,ColdSpringHarbourLabrotaryPress,ColdSpringHarbour, 1989。
[0297]又例如，可使用記載于Ko邱keetal. 2010,Poc.Nat.Acad.Sci. U.S.A. 107:13087-92 ；PCT/NZ2011/000203 ；W02012/053905；Straetzetal.,1994,Appl. Environ.Microbiol. 60:1033-37;Mermelsteinetal.，1992,Biotechnology, 10, 190-1 95 ;Jenne:rtetal.，2000,Microbiology, 146:3071-3080;Tyurinetal.，2004,Appl. Environ.Microbiol. 70:883-890中的電穿化技術。又例如，可使用記載于化asanna TamarapuParthasarathy, 2010,DevelopmentofaGeneticModificationSystemin ClostridiumscatologenesATCC25775forGenerationofMutants,MastersProject WesternKen化ckyUniversity中的原瞻菌體誘導技術。又例如，可使用記載于Herbert etal.,2003,FEMSMicrobiol.Lett. 229:103-110 或Williamsetal.,1990,J.Gen.Microbiol. 136:819-826 中的接合方法。
[029引在某些實施方案中，由于在要轉化的微生物中具有活性的限制性系統，必須將要 引入所述微生物的核酸甲基化。該可使用多種技術進行，所述技術包括下文描述的那些，其 在下文實施例部分進一步示例說明。
[0299] 舉例來說，在一個實施方案中，通過包括如下步驟的方法產生本發明的重組微生 物：
[0300] 將（i)本文描述的待引入到親代微生物的構建體/載體和（ii)包含甲基轉移酶 基因的甲基化構建體/載體引入穿梭微生物；
[0301] 表達所述甲基轉移酶基因；
[0302] 從所述穿梭微生物分離一種或多種構建體/載體；和，
[0303] 將所述一種或多種表達構建體/載體引入目標微生物。
[0304] 在一個實施方案中，步驟B的甲基轉移酶基因是組成型表達的。在另一個實施方 案中，步驟B的甲基轉移酶基因的表達是誘導的。
[0305] 所述穿梭微生物是可促進組成所述表達構建體/載體的核酸序列的甲基化的微 生物，優選限制性酶陰性（restrictionnegative)的微生物。在具體實施方案中，所述 穿梭微生物是限制性酶陰性的大腸桿菌、枯草桿菌炬acillussubtillis)或乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)。
[0306] 所述甲基化構建體/載體包含編碼甲基轉移酶的核酸序列。
[0307] -旦所述表達構建體/載體和甲基化構建體/載體被引入所述穿梭微生物，存 在于所述甲基化構建體/載體上的甲基轉移酶基因就被誘導。可通過任意適合的啟動子 系統進行誘導，但在本發明一個具體的實施方案中，所述甲基化構建體/載體包含誘導型 lac啟動子（例如，在SEQ_IDNO31中）并且可通過加入乳糖或其類似物，更優選異丙 基-目-D-硫代-半乳糖巧（IPTG)來誘導。其他適合的啟動子包括ara、tet或T7系統。 在本發明另一個實施方案中，所述甲基化構建體/載體啟動子是組成型啟動子。
[030引在一個具體的實施方案中，所述甲基化構建體/載體具有對所述穿梭微生物的種 類特異性的復制起點，W使存在于所述甲基化構建體/載體上的任意基因均可在所述穿梭 微生物中表達。優選地，所述待引入到親代微生物的構建體/載體具有對所述目標微生物 的種類特異性的復制起點。
[0309] 所述甲基轉移酶的表達可導致存在于所述待引入到親代微生物的構建體/載體 上的基因的甲基化。然后，可根據許多已知方法中的任一種將所述構建體/載體從所述穿 梭微生物中分離。僅舉例來說，可使用下文實施例部分描述的方法分離所述構建體/載體。
[0310] 在一個具體的實施方案中，兩種構建體/載體被共分離。
[0311] 可使用任意數量的已知方法，將所述祀向（destined化r)親代微生物的構建體/ 載體引入所述微生物。但是，舉例來說，可使用下文實施例部分描述的方法。
[0312] 可W想到，可將甲基轉移酶基因引入穿梭微生物并過表達。因此在一個實施方案 中，可W使用已知方法收集所得的甲基轉移酶并在體外用于甲基化所述待引入親代微生物 中的構建體。然后，可將所述構建體/載體引入所述目標（親代）微生物。在另一個實施方 案中，將甲基轉移酶基因引入所述穿梭微生物的基因組，然后將所述祀向（destined化r) 親代微生物的構建體/載體引入所述穿梭微生物，從所述穿梭微生物中分離一種或多種構 建體/載體，然后將所述構建體/載體引入目標（親代）微生物。
[0313] 可W想到，可將如上文所定義的祀向（destined化r)親代微生物的構建體/載體 和甲基化構建體/載體結合W提供一種目標組合物。該種組合物在繞過限制性屏障機制W 產生本發明的重組微生物方面特別有用。
[0314] 在一個具體實施方案中，上文所述的構建體/載體是質粒。
[0315] 本領域普通技術人員會了解用于產生本發明的微生物的許多適合的甲基轉移酶。 但是，可W使用例如枯草桿菌瞻菌體OT1甲基轉移酶和下文實施例中描述的甲基轉移酶。 考慮到所需甲基轉移酶的序列和遺傳密碼，應容易地了解編碼適合的甲基轉移酶的核酸。 在一個實施方案中，編碼甲基轉移酶的核酸如下文實施例所述（例如SEQ_IDN031的核 酸）。
[0316] 可W使用任意數量的被改造為適于使甲基轉移酶基因表達的構建體/載體來產 生所述甲基化構建體/載體。但是，舉例來說，可使用下文實施例部分描述的質粒。
[0317] 根據本文包含的信息，會理解可改造（tailor)親代微生物的遺傳修飾W利于使 得一種或多種產物的產生優于一種或多種其他產物。例如，破環丙麗酸到己醜乳酸的轉化 有利于使得乳酸、甲酸、蘋果酸、延胡索酸、巧樣酸、玻巧酸和2-麗戊二酸的產生優于額氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸的產生。 。31引產牛方法
[0319] 本發明提供了一種用于通過微生物發酵產生一種或多種產物的方法，所述方法包 括使用本發明的微生物發酵含C0的底物。在一種具體的實施方案中，所述方法用于通過微 生物發酵產生己醇或一種或多種其他產物，其包括使用本發明的微生物發酵含C0的底物。 本發明的方法可用于減少來自工業過程的總的大氣碳排放。
[0320] 優選地，所述發酵包括使用本發明的重組微生物在生物反應器中厭氧發酵底物W 產生所述一種或多種產物（在一種具體的實施方案中，己醇、或己醇和一種或多種其他產 物）的步驟。
[0321] 在一個實施方案中，所述方法包括如下步驟：
[0322] (a)將含C0的底物提供給生物反應器，所述生物反應器含有本發明第一方面的一 種或多種微生物的培養物；和
[0323] 化）在所述生物反應器中厭氧發酵所述培養物W產生一種或多種產物（在一個實 施方案中包括己醇）。
[0324] 在一個實施方案中，所述方法包括W下步驟：
[0325] i.在由工業生產過程產生的含C0的氣體釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲；
[0326] ii.通過培養物厭氧發酵含C0的氣體W產生一種或多種產物（在一個實施方案中 包括己醇），所述培養物含有本發明第一方面的一種或多種微生物。
[0327] 在本發明的一個實施方案中，被所述微生物發酵的氣態底物是含C0的氣態底物。 所述氣態底物可W是作為工業過程副產物或者從某些其他來源（例如汽車廢氣）獲得的含 C0的廢氣。在某些實施方案中，所述工業過程選自鐵金屬產品生產例如鋼鐵廠、有色金屬產 品生產、石油精煉過程、煤的氣化、電力生產、炭黑生產、氨生產、天然氣精煉、甲醇生產和焦 炭生產。在該些實施方案中，可在所述含C0的氣體被排放到大氣中之前使用任意方便的方 法從所述工業過程中將其捕獲。所述CO可w是合成氣（含一氧化碳和氨氣的氣體）的組 分。從工業過程產生的C0通常被燃燒掉來產生c〇2,因此本發明在減少c〇2溫室氣體排放 和產生用作生物燃料的下醇方面尤其有用。根據所述含C0的氣態底物的組成，還可能需要 對其進行處理，W在將其引入所述發酵之前除去任何不需要的雜質例如塵粒。例如，可使用 已知的方法過濾或洗涂所述氣態底物。
[032引應理解，為使所述細菌生長并發生C0到己醇（和/或其他產物）的轉化，除所述 含C0的底物氣體外，需要將適合的液體營養培養基進料至所述生物反應器。所述底物和培 養基可連續、分批或分批補料方式進料至所述生物反應器。營養培養基會含有足W允 許所使用的微生物生長的維生素和礦物質。適合用于使用C0進行發酵W產生己醇（和任 選的一種或多種其他產物）的厭氧培養基是本領域中已知的。例如，Biebel(Journalof IndustrialMicrobiology&Biotechnology(2001) 27, 18-26)記載了適合的培養基。所述 底物和培養基可WW連續、分批或分批補料方式進料至所述生物反應器。在本發明的一個 實施方案中，所述培養基如下文實施例部分所述。
[0329] 合乎需要地，所述發酵應在用于發生C0到己醇（和/或其他產物）的發酵的合適 條件下進行。應考慮的反應條件包括；壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養基抑、培養基 氧化還原電勢、攬拌速率（如果使用連續攬拌蓋反應器的話）、接種物水平、確保所述液相 中的C0不成為限制的最大氣體底物濃度W及避免產物抑制的最大產物濃度。
[0330] 此外，通常需要增加底物流中的C0濃度（或氣態底物中的C0分壓），從而提高 C0作為底物時發酵反應的效率。在增加的壓力下操作可顯著增加C0從氣相轉移到液相的 速率，在液相中C0可被所述微生物作為碳源攝取用于產生所述己醇（和/或其他產物）。 該進而意味著，當生物反應器保持在升高的壓力而非大氣壓力下時，可減少保留時間（定 義為生物反應器中的液體體積除W輸入氣體流速）。最佳反應條件將部分地取決于本發 明所使用的具體微生物。但是，一般來說，優選的是所述發酵在高于環境壓力的壓力下進 行。并且，因為給定的C0到己醇（和/或其他產物）的轉化率部分地是所述底物保留時間 的函數，并且實現所需保留時間進而限定了生物反應器的所需體積，所W使用增壓系統可 大大地減少所需的生物反應器的體積，從而減少所述發酵設備的資金成本。依據美國專利 no. 5, 593,886中給出的實例，反應器體積的減少與反應器操作壓力的增加成線性比例，即 在10個大氣壓下操作的生物反應器僅需要是在1個大氣壓下操作的生物反應器體積的十 分之一。
[033。 已經在別處描述了在升高的壓力下進行氣體到己醇發酵的益處。例如，W0 02/08438描述了在30psig和75psig壓力下進行的氣體到己醇的發酵，獲得的己醇產率分 別為150g/l/天和369g/l/天。但是，發現在大氣壓下使用相似的培養基和輸入氣體組成 進行的示例性發酵產生1/20到1/10的己醇/升/天。
[0332] 還合乎需要的是，含C0的氣態底物的引入速率是該樣的，即確保液相中的C0濃度 不成為限制。該是因為C0受限的條件的結果可能是己醇產物被所述培養物消耗。
[0333] 用于進料至發酵反應的氣流組成可對所述反應的效率和/或成本有顯著影響。例 女口，化可降低厭氧發酵過程的效率。在發酵之前或之后的發酵過程各階段中，對不需要或不 必要的氣體的處理會增加該些階段的負擔（例如，當在氣體流進入生物反應器之前將氣體 流壓縮時，不必要的能量可能被用于壓縮發酵中不需要的氣體）。因此，可能需要處理底物 流（尤其是來自工業來源的底物流）w除去不需要的組分并增加需要的組分的濃度。
[0334] 在某些實施方案中，將本發明的細菌培養物維持在水性培養基中。優選地，所述水 性培養基是基本厭氧微生物生長培養基。合適的培養基是本領域中已知的，記載于例如美 國專利no. 5, 173, 429和5, 593,886和W0 02/08438,并且如下文實施例部分所述的。
[0335] 可通過本領域中已知的方法從發酵液中回收本發明方法產生的一種或多種產物 (在一個實施方案中，產生己醇、或含有己醇和/或一種或多種其他產物的混合醇流），所述 方法例如分觸或蒸發、滲透蒸發、W及萃取發酵（包括例如液-液萃取）。也可通過本領域 中已知的方法從發酵液中回收副產物，例如酸（包括己酸鹽）。例如，可使用含有活性炭過 濾器的吸附系統或電滲析。或者，也可使用連續氣提。
[0336] 在本發明某些優選實施方案中，可通過W下方式從所述發酵液中回收己醇和/或 一種或多種其他產物：從所述生物反應器連續移出部分發酵液，從所述發酵液中分離微生 物細胞（方便地通過過濾），并從所述發酵液中回收一種或多種產物。醇可通過例如蒸觸方 便地回收，酸可通過例如吸附到活性炭上來回收。優選地將分離的微生物細胞返回至所述 發酵生物反應器。優選地將已除去任何的醇和酸后剩余的無細胞滲透物返回至所述發酵生 物反應器。可將另外的營養物（例如B族維生素）加入到所述無細胞滲透物中W在將其返 回至所述生物反應器之前補充所述營養培養基。
[0337] 同樣地，如果如上所述調整所述發酵液的抑W增強己酸到活性炭的吸附，那么應 在將其返回至所述生物反應器之前將抑重新調整到與所述發酵生物反應器中發酵液類似 的抑。
[033引可使用W下很多技術從發酵液中回收玻巧酸，例如，酸化、與離子交換層析結合的 電滲析（SongandLee, 2006,EnzymeMicrobTechnol39, 352-361)、Ca(0H)沉淀與過濾和 添加硫酸（Leeetal2008,ApplMicrobiolBiotechnol79, 11-22)、或使用基于胺的萃取 劑（例如H正辛胺）的化學萃取（Huhetal，2006,ProcBiochem41,1461-1465)。對于所 有的方法，具有游離酸形式而非鹽形式是至關重要的。但是大多數玻巧酸的生物技術產生 過程都在P冊-7的中性或微酸范圍內操作。考慮到玻巧酸的pKa(pKa= 4. 16和5. 61)，在 該些情況下，大部分玻巧酸都W鹽而非游離酸的形式存在。但是已知自產己醇梭菌和一氧 化碳營養型產己酸菌在所需要的抑4-6的低抑范圍下耐受和生長。
[0339] 可相對容易地通過W下方法從發酵液中回收支鏈氨基酸額氨酸、亮氨酸和異亮 氨酸；濃縮（例如反滲透）、生物質的結晶或去除（例如超濾或離也）和離子交換層析 (Ikeda,A. , 2003,AminoAcidProductionProcesses,inR.FaurieandJ.Thommel(eds.) MicrobialproductionofL-aminacids, 1-35)。
[0340] 可通過任何已知的方法從發酵液中回收乳酸、甲酸、2-麗戊二酸和其他產物。但 是，例如，在乳酸的情況下，傳統的發酵過程產生可被收集和再酸化的乳酸巧沉淀。或者，可 使用膜技術（例如電滲析）來分離乳酸。可通過在選擇性離子滲透膜上應用適合的電勢從 發酵液中分離低濃度的乳酸。其他適合的技術包括納米過濾，其中單價離子可在壓力下選 擇性地穿過膜。
[0341] 應理解，在一些情況下，可使用所述方法產生和回收除了己醇之外的產物（例如， 包括額氨酸、亮氨酸、玻巧酸、丙麗酸、乳酸和甲酸的一種或多種產物）。因此，本發明應被理 解為包括用于產生該些產物中的一種或多種的方法。 陽34引連施例:
[0343] 現將參照如下非限制性實施例更詳細地描述本發明。 陽344]連施例1:
[0345] 通過同源重組刪除自產己醇梭菌budA基因
[0346] 使用包含自產己醇梭菌DSM23693的budA基因的5'和3'同源臂的質粒進行遺傳 修飾（圖1-2)。使用新的甲基轉移酶將所述質粒在體內甲基化，接著將其轉化到自產己醇 梭菌DSM23693(DSMZ，德國）中。已經通過PCR和通過抑制自產己醇梭菌DSM23693AbudA 菌株中的2, 3-下二醇的產生表明了所述budA基因的敲除。
[0347] 表達質粒的構建：
[0348] 本發明使用了標準重組DNA和分子克隆技術，該些技術由Sambrooketal, 1989 和Ausubeletal，1987記載。從NCBI中獲得了自產己醇梭菌DSM23693的5'上游側翼同 源臂（Seq.ID3)和3'下游側翼同源臂（Seq.ID4)的DNA序列。
[034引 根據制造商的說明書，使用Invitrogen的化relinkGenomicDNAminikit分離 來自自產己醇梭菌DSM23693的基因組DM。
[0巧0] W自產己醇梭菌DSM23693基因組DNA作模板、iProof高保真DNA聚合酶炬io-Rad Ubratories)和表1中的寡核巧酸通過PCR擴增所述5' (Seq.ID3)和3'側翼同源臂（Seq.ID4)，并且PCR所用程序如下；98°C初始變性30s，然后25個循環的變性（98C，10s)、退火 (60。15s)和延伸（72。30s)，然后是最后延伸步驟（72。7min)。
[0巧1] 塞1;用于克隆的寡核巧酸
[0巧2]

【權利要求】
1. 一種重組的一氧化碳營養型產乙酸微生物，所述微生物被改造為適于在發酵含一氧 化碳的底物時產生一種或多種產物以及降低量的或基本不產生2, 3- 丁二醇和/或其前體， 所述微生物與親代微生物相比包含破壞了 2, 3- 丁二醇生物合成途徑的一種或多種遺傳修 飾。
2. -種重組的一氧化碳營養型產乙酸微生物，所述微生物被改造為適于在發酵含一氧 化碳的底物時產生乙醇作為主要產物以及降低量的或基本不產生2, 3- 丁二醇和/或其前 體，所述微生物與親代微生物相比包含破壞了 2, 3- 丁二醇生物合成途徑的一種或多種遺 傳修飾。
3. 權利要求2的重組微生物，其中所述微生物被改造為適于進一步產生甲酸、乳酸、丙 酮酸、琥珀酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙酰乳酸、蘋果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、檸檬酸 中的一種或多種。
4. 權利要求2或3的重組微生物，其中與親代微生物相比，所述微生物被改造為適于產 生的增加量的乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙酰乳酸、蘋果 酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、檸檬酸中的一種或多種。
5. 權利要求1-4中任一項的重組微生物，其中所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所 述遺傳修飾破壞了一種或多種能將丙酮酸轉化成乙酰乳酸的酶的表達和/或活性。
6. 權利要求1-4中任一項的重組微生物，其中所述微生物包含至少一種遺傳修飾，所 述遺傳修飾破壞了一種或多種能將乙酰乳酸轉化成乙偶姻的酶的表達和/或活性。
7. 權利要求1-4中任一項的重組微生物，其中所述微生物包含至少一種遺傳修飾，所 述遺傳修飾破壞了一種或多種能將乙偶姻轉化成2, 3- 丁二醇的酶的表達和/或活性。
8. 權利要求1-4中任一項的重組微生物，其中所述微生物包含至少一種遺傳修飾，所 述遺傳修飾破壞了兩種或多種能將丙酮酸轉化成乙酰乳酸、將乙酰乳酸轉化成乙偶姻和將 乙偶姻轉化成2, 3- 丁二醇的酶的組合的表達和/或活性。
9. 權利要求5或8的重組微生物，其中所述一種或多種能將丙酮酸轉化成乙酰乳酸的 酶是乙酰乳酸合酶（alsS)。
10. 權利要求6或8的重組微生物，其中所述一種或多種能將乙酰乳酸轉化成乙偶姻的 酶是乙酰乳酸脫羧酶（budA)。
11. 權利要求7或8的重組微生物，其中所述一種或多種能將乙偶姻轉化成2, 3- 丁二 醇的酶為選自以下的酶：2, 3- 丁二醇脫氫酶（2, 3bdh)、乙偶姻還原酶、伯醇：仲醇脫氫酶。
12. 權利要求1-11中任一項或多項的重組微生物，其中所述一種或多種遺傳修飾破壞 了乙酰乳酸合酶（alsS)、乙酰乳酸脫羧酶（BudA)、2, 3-丁二醇脫氫酶（2, 3bdh)、乙偶姻還 原酶、伯醇：仲醇脫氫酶中的一種或多種的表達和/或活性。
13. 權利要求1-12中任一項的重組微生物，其中所述親代微生物選自自產乙醇梭 菌（Clostridium autoethanogenum)、揚氏梭菌（Clostridium 1 jungdahlii)、拉氏梭菌 (Clostridium ragsdalei)和科斯卡塔梭菌（Clostridium coskatii)。
14. 權利要求12的重組微生物，其中所述親代微生物是自產乙醇梭菌DSM23693。
15. -種產生重組的一氧化碳營養型產乙酸微生物的方法，所述微生物能夠在發酵含 一氧化碳的底物時產生一種或多種產物以及降低量的或基本不產生2, 3- 丁二醇和/或其 前體，所述方法包括遺傳修飾一氧化碳營養型產乙酸親代微生物以破壞2, 3- 丁二醇生物 合成途徑。
16. -種產生重組的一氧化碳營養型產乙酸微生物的方法，所述微生物能夠在發酵含 一氧化碳的底物時產生乙醇作為主要產物以及降低量的或基本不產生2, 3- 丁二醇和/或 其前體，所述方法包括遺傳修飾一氧化碳營養型產乙酸親代微生物以破壞2, 3- 丁二醇生 物合成途徑。
17. 權利要求15或16的方法，其中所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到所述親 代微生物中，所述遺傳修飾破壞了一種或多種基因，所述基因編碼能將丙酮酸轉化成乙酰 乳酸、將乙酰乳酸轉化成乙偶姻和/或將乙偶姻轉化成2, 3- 丁二醇的一種或多種酶。
18. 權利要求17的方法，其中所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到所述親代微 生物中，所述遺傳修飾破壞了兩種或多種基因的組合，所述基因編碼能將丙酮酸轉化成乙 酰乳酸、將乙酰乳酸轉化成乙偶姻和/或將乙偶姻轉化成2, 3- 丁二醇的酶。
19. 權利要求17或18的方法，其中所述一種或多種能將丙酮酸轉化成乙酰乳酸的酶 是乙酰乳酸合酶（alsS)，所述一種或多種能將乙酰乳酸轉化成乙偶姻的酶是乙酰乳酸脫 羧酶（budA)和/或所述一種或多種能將乙偶姻轉化成2, 3-丁二醇的酶為選自以下的酶： 2, 3-丁二醇脫氫酶（2, 3bdh)、乙偶姻還原酶、伯醇：仲醇脫氫酶。
20. 權利要求15-19中任一項的方法，其中所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入 到所述親代微生物中，所述遺傳修飾破壞了一種或多種基因，所述基因編碼乙酰乳酸合酶 (alsS)、乙酰乳酸脫羧酶（BudA)和2, 3- 丁二醇脫氫酶（2, 3bdh)中的一種或多種。
21. 通過權利要求15-20的任一項的方法產生的重組微生物。
22. -種用于產生一種或多種產物的方法，所述方法包括使用如權利要求1-14和21中 任一項的微生物發酵含CO的底物。
23. -種用于產生乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙酰乳 酸、蘋果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、檸檬酸中的一種或多種的方法，所述方法包括使用如權 利要求1-14和21中任一項的微生物發酵含CO的底物。
24. 權利要求22或23的方法，所述方法包括如下步驟： (a) 將含CO的底物提供給生物反應器，所述生物反應器含有一種或多種權利要求1-13 和19中任一項的微生物的培養物；和 (b) 在所述生物反應器中厭氧發酵所述培養物以產生所述一種或多種產物，優選包括 乙醇。
25. 權利要求22或23的方法，所述方法包括如下步驟： (a) 在由工業生產過程產生的含CO的氣體被釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲； (b) 通過培養物厭氧發酵所述含CO的氣體以產生所述一種或多種產物，優選包括乙 醇，所述培養物含有一種或多種權利要求1-13和19中任一項的微生物。
26. 權利要求22-25中任一項的方法，其中所述底物含有至少約20體積％至約100體 積％的CO。
27. 權利要求22-26中任一項的方法，其中所述方法還包括從所述發酵液中回收所述 一種或多種產物的步驟。
28. 通過權利要求22-27中任一項的方法產生的一種或多種產物。
29. 權利要求28的一種或多種產物，其中所述一種或多種產物選自乙醇、甲酸、乳酸、 丙酮酸、琥珀酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙酰乳酸、蘋果酸、延胡索酸、檸檬酸和2-酮戊 二酸。
【文檔編號】C12N15/53GK104395455SQ201380018640
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年1月31日 優先權日:2012年1月31日
【發明者】M·科普克, S·那加拉祖, 陳銥婷 申請人:新西蘭郎澤科技公司