專利名稱：制造益生菌制劑的乳酸細菌的新穎菌株和其組合的制作方法
技術領域：
本發明涉及德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)的新穎菌株(Selur 6 和 Selur 19)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)的新穎菌株(Selur 12),以及這些新穎菌株組合益生菌菌株加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri) K7用于制備打算供人或動物使用的益生菌食品補充劑的用途。此外，本發明涉及一種預防和治療制劑，其含有上述菌株的不同組合作為有效組分，用于維持和改善宿主的整體健康狀態以及預防和/或治療胃腸道疾病。另外，已經發明和公開了基于用上述菌株對奶或乳清進行發酵來制備生物質、益生菌發酵劑培養物、食品補充劑和藥物制劑的新式程序和技術。
背景技術：
乳酸細菌(LAB)是一組多樣性的革蘭氏陽性無芽孢細菌，它們是需要特定營養環境的厭氧菌或兼性厭氧菌，最終代謝產物是乳酸。如今，LAB因其發酵活性以及其健康和營養益處而成為工業上重要的微生物。LAB、特別是乳酸細菌在胃腸道(GIT)中占據重要生態位，認為它們為整體健康狀態和正確生理條件提供許多益生菌益處。這些益處包括對天然菌群的積極影響、競爭性排斥病原體和刺激/調節粘膜免疫。在這一點上，值得特別強調的是，由益生菌賦予的健康益處具有菌株特異性，這取決于個別菌株特征(沙阿(Shah)，2007)。乳清蛋白和生物活性肽可能是乳制品中所含的最重要且研究最充分的生源物質。乳清蛋白與眾多營養和生理結果有關，包括生理變化、體育運動后恢復和預防肌肉萎縮、飽腹感和體重控制、感染和健康老齡化控制(史密瑟斯(Smithers)，2008)。乳蛋白是生物活性肽的豐富來源。來源于乳蛋白的生物活性肽在親本蛋白序列內是無活性的，且可在奶/乳清消化或發酵期間通過酶蛋白水解從LAB釋放。一旦釋放，生物活性肽就可在體內作為具有不同活性的調節化合物起作用，例如作為降低或控制高血壓的手段、抗氧化劑、預防血栓形成的手段、抗微生物手段和調節免疫系統的手段(邁澤爾(Meisel)，1998，科爾霍寧(Korhonen)和費蘭圖(Pihlanto), 2006)。酸奶是通過發酵生產的所有類型的奶中最流行的。長久以來，許多文明都堅信它對人類健康具有有益影響。阿育吠陀(Ayurveda),約公元前2500年出現的最古老健康科學之一，推薦消費酸奶來維持正確的整體健康狀態(喬普拉(Chopra)和多菲德(Doiphode)，2002)。盡管酸奶和因此酸奶細菌德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌在歷史上與人類健康有關，但酸奶細菌并不經常作為益生菌被提及。出現這種情況很可能是因為無法在人類胃腸道(GIT)的天然菌群中觀察到這些細菌，且因此過去大多數學者都認為這些物種無法在GIT和器官系統的條件下存活(瓜內爾(Guarner)等人，2005)。遺傳方法的發展促使學者能夠在某些特定菌株通過GIT期間追蹤它們。近年來，已在消費酸奶的人類的排泄物 中觀察到乳酸細菌(馬特(Mater)等人，2005，埃利(Elli )等人，2006)。相反，加西亞-阿爾比亞克(Garcia-Albiach)等人(2008)提出人類糞便微生物群中的變化主要歸因于酸奶自身的不要求細菌活力的性質。在這點上，專利申請WO 96/20607、WO 2005/056028和WO2008/002484揭示了具有益生菌性質的酸奶發酵劑培養物的特定菌株(嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種)，其用于治療各種GIT病癥的組合和制劑。一直到20世紀80年代，大多數從腸分離的乳桿菌屬菌株基于其形態和表型特征都被歸類為嗜酸乳桿菌(Lb. acidophilus)。隨著基于分子技術的現代分類學的發展，已在先前被確定為嗜酸乳桿菌的群組內鑒定出六種不同物種且進一步分成DNA同源組A (嗜酸乳桿菌、食淀粉乳桿菌(Lb. amylovorus)、卷曲乳桿菌(Lb. crispatus)、雞乳桿菌(Lb.gal I inarum))和DNA同源組B (加氏乳桿菌、約氏乳桿菌(Lb. johnsonii))。通過使用型特異性PCR引物或是通過DNA測序，確定了高變的16S-23S基因間間隔區以及16SrPHK基因序列的特異性足以區分類似的乳桿菌屬物種(坦諾克(Tannock)等人，1999,庫倫(Kullen)等人，2000)。1996年，在盧布爾雅那大學生物技術院乳品學系(Chair of DairyScience, Biotechnical faculty, University of Ljubl jana)從 7 天大的母乳喂養的健康嬰兒分離出加氏乳桿菌K7菌株。其存放在ZM工業微生物菌種保藏中心(ZM Culture Collection of Industrial Microorganisms),登記為 WDCM810 (WFCC-MIRCEN 世界微生物數據中心(WFCC-MIRCEN World Data Centre for Microorganisms，WDCM))。在 2009 年9月，所述菌株已根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)以登記號CCM 7710存放于捷克微生物保藏中心(Czech Collection of Microorganisms, CCM)。基于生理和生化性質，包括用API 50CHL (生物梅里埃公司(BioMerieux)，法國(France))鑒別的發酵流程，將其鑒定為嗜酸乳桿菌群組的成員。缺少S層蛋白、使用菌株特異性引物的PCR和對16SrPHK的V2-V3區一級序列的確定已經表明，菌株K7歸屬于加氏乳桿菌類型(博格維奇 馬提亞斯奇< Bogovic MatijaSW和羅吉爾(Rogelj), 2OOO,坎賽克 馬亨尼奇等人，2003)。據證實加氏乳桿菌K7滿足益生菌菌株的基本準則，因為其耐低pH值且耐膽汁，產生抗微生物物質(包括具有廣泛抗微生物譜的細菌素)且粘附于Caco-2細胞[博格維奇 馬提亞斯奇和羅吉爾，2000，博格維奇 馬提亞斯奇等人，2003]。加氏乳桿菌K7的特點在于生物合成和產生至少兩種細菌素，命名為乳酸菌素K7A (gassericene K7A)和乳酸菌素K7B(gassericene K7B)，其核苷酸序列以登記號EF392861和AY307382存放在GenBank中。兩種細菌素均屬于二肢細菌素的類別(佐里奇 彼得內爾(ZoriC PeterneDt 2007)。此外，菌株能夠在通過胃腸道時存活下來，且在通過標準方式或通過剖腹產出生的仔豬的腸韌帶中至少臨時地形成菌群。在通過剖腹產出生且人工感染有產腸毒素性大腸桿菌(Escherichia coli)的仔豬中，加氏乳桿菌K7在一定程度上降低感染的存活率，且除 了因為產生有機酸和刺激免疫反應而引起的抗微生物活性以外，腸韌帶競爭性地釋放大腸桿菌是充當所述活性的可能機制。通過細胞模型Caco-2證實了加氏乳桿菌K7防止非產腸毒素性突變體大腸桿菌菌株08:K88+定植于腸上皮細胞的能力(博格維奇 馬提亞斯奇等人，2004 ;博格維奇 馬提亞斯奇等人，2006 ;羅吉爾和博格維奇 馬提亞斯奇，2006)。一些先前的專利申請描述了從嬰兒糞便(JP 04320642、JP 05227946、美國專利6596530)和人乳(W0 2004/003235、WO 2008/016214)中分離一組不同的菌株，包括益生菌加氏乳桿菌菌株。
此外，美國專利申請US2008233104揭示在治療性組合物中應用益生菌生物體的組合物和方法。具體而言，揭示了乳酸細菌的一種或一種以上菌株控制病原體的用途。菌株對于抗微生物手段(例如抗生素和抗病毒手段)具有耐藥性或大大降低的敏感性。所揭示的組合物用于治療或預防細菌介導的胃腸道感染。國際專利申請W08905849揭示從豬的胃腸道中分離的乳酸細菌，其能夠在胃腸道環境中存活，也就是對膽汁或酸耐受。這些細菌包括于希望為人類或動物所消費以治療或預防胃腸道疾病的發酵乳產品中。NZ523010揭示一種具有益生菌活性的乳酸細菌的分離菌株。所述菌株已選自乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)或腸球菌屬(Enterococcus),且更確切地說，選自羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri) NCC2581 (CNCMI-2448)、羅伊氏乳桿菌 NCC2592 (CNCM 1-2450)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)NCC2583 (CNCM1-2449)、羅伊氏乳桿菌 NCC2603 (CNCMI-2451 )、羅伊氏乳桿菌 NCC2613(CNCMI-2452)、嗜酸乳桿菌 NCC2628 (CNCM 1-2453)。
發明內容
本發明涉及從生產于保加利亞山脈(Bulgarian mountains)-巴爾干山脈
(Stara Planina)和洛多皮山脈(Rhodopes)的傳統酸奶中分離的德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lb. bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(St. Thermophilus)菌株,其顯示數種獨有特征。這些菌株是 德氏乳桿菌保加利亞亞種Selur 6，根據布達佩斯條約在2009年9月以登記號CCM 7712存放于捷克微生物保藏中心(CCM); 德氏乳桿菌保加利亞亞種Selur 19，根據布達佩斯條約在2009年9月以登記號CCM 7713存放于捷克微生物保藏中心(CCM); 嗜熱鏈球菌Selur 12，根據布達佩斯條約在2009年9月以登記號CCM 7711存放于捷克微生物保藏中心(CCM)。本發明的另一方面涉及含有至少一種上述菌株以及先前所述從兒童糞便中分離的益生菌加氏乳桿菌K7菌株的組合物和產品，所述加氏乳桿菌K7菌株具有登記號CCM7710。本發明的另一方面揭示基于奶或乳清發酵，從上述菌株制造生物質和益生菌發酵齊峭養物、供人和動物使用的食品補充劑和藥物制劑的程序。最后，本發明的最后一個方面涉及上述菌株或含有上述菌株的任何培養物、組合物或產品的用途，其在制造功能性食品和預防性制劑(如供人和動物使用的食品補充劑)和治療性制劑期間用于維持宿主的整體健康狀態以及預防和/或治療胃腸道病癥、泌尿生殖感染或陰道感染。定義根據本發明，術語“益生菌”應按FA0/WH0 (2002)的定義理解，且具體而言，這些益生菌是活的生物體，當被攝取足夠數量時會提供某些生理益處，且通常具有菌株特異性。根據本發明，術語“生源物質”意指來源于微生物活動的營養組分，其有益于健康狀態，與腸道菌群無關(光R(Mitsuoka)，2000)。根據這一定義，來自發酵乳的所述物質是例如由LAB在發酵期間產生的乳酸、丁酸、生物活性肽、P -半乳糖苷酶和胞外多糖。根據本發明且如本文所用，術語“營養和/或藥學上可接受的物質/載體”意指一種或一種以上固體或液體物質或填充劑、稀釋劑或包囊物質，其適于被人或動物攝取且與活性益生菌菌株相容。根據本發明，術語“可相容”是指組分在人或動物體內不抑制益生菌且允許根據本發明的栗色著色和菌株活性以及加氏乳桿菌菌株K7。
圖I展示使用德氏乳桿菌型特異性Del I和Del II引物的PCR。注解M_100bp(富酶泰斯公司(Fermentas)) ；1. Selur 6 ；2. L7 ；3. L8 ；4. L12 ；5. Selur 19 ；6. LMG 64121 德氏乳桿菌保加利亞亞種;7. LMG 69011德氏乳桿菌德氏亞種(Lb. delbr. delbr. ) ;8_12是從天然酸奶中分離的德氏乳桿菌保加利亞亞種；13.陰性對照。圖2展示使用嗜熱鏈球菌型特異性Thl和Th2引物的PCR。注解M_100bp (富酶泰斯公司)；1-ST4 ;2-ST7 ;3-Selur 12。圖3展示使用德氏乳桿菌保加利亞亞種亞型特異性LBl和LLBl引物的PCR。注解=M-Ikb (富酶泰斯公司)；I-Selur 6 ;2_L7 ;3_L8 ;4_L12 ；5-Selur 19 ;6_LMG 6412T 德氏乳桿菌保加利亞亞種；7_LMG 6901t德氏乳桿菌德氏亞種；8_12是從天然酸奶中分離的德氏乳桿菌保加利亞亞種；13.陰性對照。圖4展示在使用引物1254的RAPD-PCR之后所獲得的DNA片段。注解M_lkb (富酶泰斯公司)；I-Selur 6 ;2_L7 ;3_L8 ;4_L12 ;5_Selur 19 ;6_LMG 6412T 德氏乳桿菌保加利亞亞種；7-LMG 6901t德氏乳桿菌德氏亞種；8_12是從天然酸奶中分離的德氏乳桿菌保加利亞亞種；13.陰性對照。圖5展示在使用引物KGT-70GC的RAPD-PCR之后所獲得的DNA片段。注解1+12-標記Ikb (富酶泰斯公司);2_加氏乳桿菌K7 ;3_嗜熱鏈球菌Selur 12 ;4_德氏乳桿菌保加利亞亞種Selur 6 ;5_德氏乳桿菌保加利亞亞種Selur 19 ;6_10_從天然酸奶中分離的德氏乳桿菌保加利亞亞種；11_陰性對照(RAPD-反應參考混合物)。圖6呈現德氏乳桿菌保加利亞亞種Selur 6和Selur 19菌株針對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213的抗微生物活性。采用加氏乳桿菌K7進行比較。圖7呈現各種菌株對CaCo-2細胞的粘附能力；(1=德氏乳桿菌保加利亞亞種Selurl9，2=嗜熱鏈球菌Selur 12，3=德氏乳桿菌保加利亞亞種Selur 6,4=鼠李糖乳桿菌GG，5=約氏乳桿菌Ljl，6=羅伊氏乳桿菌ING I，7=代田乳桿菌(Lb. Shirota) SHI，8=加氏乳桿菌K7)。圖8呈現經嗜熱鏈球菌Selur 12和各種乳桿菌菌株(Selur 6、Selur 19和K7)感染的奶在42°C和37 °C下發酵期間的pH值變化。
具體實施例方式新穎德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Selur6和Selur 19以及嗜熱鏈球菌菌株Selur 12新穎德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Selur6和Selur 19以及嗜熱鏈球菌菌株Selur 12的樣本已經以登記號CCM 7712、CCM 7713和CCM 7711存放于CCM (捷克微生物保藏中心)，存放日期是2009年9月。存放是根據國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms f or the Purposes of the Patent Procedure)的條款進行。乳桿菌屬菌株Selur 6和鏈球菌屬菌株Selur 12是從由巴爾干山脈(保加利亞)的原料乳獲得的傳統酸奶中分離，乳桿菌屬菌株Selur 19是從由洛多皮山脈(保加利亞)的原料乳獲得的傳統酸奶中分離。同樣地，加氏乳桿菌菌株K7的樣本已經以登記號CCM 7710存放于CCM(捷克微生物保藏中心)，存放日期是2009年9月。這一存放同樣根據國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約的條款進行。加氏乳桿菌K7是一種已被充分描述的益生菌菌株(博格維奇 馬提亞斯奇和羅吉爾，2000 ;博格維奇 馬提亞斯奇等人，2003，2004，2006 ;羅吉爾和博格維奇 馬提亞斯奇，2006，佐里奇 彼得內爾，2007)，其在ZM工業微生物菌種保藏中心(斯洛文尼亞)的登記號是頂105，登記為WDCM810 (WFCC-MIRCEN世界微生物數據中心(WDCM))0其于1996年8月在斯洛文尼亞盧布爾雅那分離自7天大的母乳喂養嬰兒的糞便。K7是以下兩種細菌素的生產者乳酸菌素K7A和乳酸菌素K7B。基于染色體細菌素操縱子的核苷酸序列，將兩種細菌素歸入二肽非抗生素(IIb)的群組。乳酸菌素K7A (1143bp)和乳酸菌素K7B (3276bp)的核苷酸序列存放在GenBank中，登記號是EF392861 (乳酸菌素K7A)和AY307382 (乳酸菌素K7B)。其含有I個質粒且形成位于長鏈中的較短桿。在微需氧條件中生長的最佳溫度是37°C。如以下實例I中所述，首先通過基因分型表征新穎乳桿菌屬菌株和鏈球菌屬菌株。針對利用Wizard 基因組DNA純化套裝(普洛麥格公司(Promega))或利用Maxwel 1 16系統(普洛麥格公司)從常見培養物中分離的DNA執行PCR，所述PCR使用德氏乳桿菌菌株特異性引物 Del I (5，-ACG GAT GGA TGG AGA GCA G-3’)和 Del II (5，-GCAAGT TTGTTC TTT CGAACT C-3’)以及嗜熱鏈球菌菌株特異性引物Th I (5，-ACG GAATGT ACT TGAGTT TC-3，)和 Th II (5，-TTT GGC CTT TCG ACC TAA C_3，)(替爾薩拉-蒂米斯耶爾維(Tilsala-_i'imi.sjiU_vi)和阿拉托薩瓦(Alatossava), 1997)。用引物 LB1(5’-AAA AAT GAA GTTGTT TAA AGT AGG TA-3’ ^PLLBl (5，-AAG TCT GTC CTCTGG CTG G-3’)執行德氏乳桿菌的亞型鑒定(托里亞尼(Torriani)等人，1999)。菌株Selur 6和Selurl9被鑒定為德氏乳桿菌保加利亞亞種，且菌株Selurl2被鑒定為嗜熱鏈球菌。為了另外證實類型鑒定，對經PCR擴增的16S rPHK可變區Vl和V3執行測序。乳桿菌屬菌株Selur 6和Selur 19與德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC BAA-365或ATCCl 1842的參考序列(德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Selur 6的16S rPHK的PCR延伸可變區Vl和V3的序列(測序是由瑞士巴爾加赫(Balgach-Switzerland)的微合成實驗室(MicrosynthLab)進行)和德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Selur 19的16S rPHK的PCR延伸可變區Vl和V3的序列(測序是由瑞士巴爾加赫的微合成實驗室進行))一致(99%),Al, Premium RUN986446 49880
GATTTGTTGGACGCTAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAACAACATGAATCGCATG ATTCAAGTTTGAAAGGCGGCGYAAGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGCAGTAACTGGTCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAATGATAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCATCGGAAACTGTCATTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAAT乳桿菌屬....................116個命中物20個生物體[根源；細胞生物體；
細菌；厚壁菌門；桿菌綱；乳桿菌目；乳桿菌科].德氏乳桿菌....................................94個命中物7個生物體
..德氏乳桿菌保加利亞亞種................61個命中物3個生物體...德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCCBAA-365...... 9個命中物I個生物體...德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC11842...... 10個命中物I個生物體..德氏乳桿菌印度亞種...............I個命中物I個生物體..德氏乳桿菌德氏亞種...............4個命中物I個生物體..德氏乳桿菌乳亞種...................13個命中物I個生物體.乳桿菌屬JCM8653種.............I個命中物I個生物體.乳桿菌屬CYl種......................I個命中物I個生物體.未經培養的乳桿菌屬種............9個命中物I個生物體[環境樣本].乳桿菌屬RA2120種................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬RA2062種................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬RA2066種................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬DJF_CR11種............I個命中物I個生物體.乳桿菌屬19-2種......................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬JCM1552種.............I個命中物I個生物體.乳桿菌屬DumLacl種..............I個命中物I個生物體.乳桿菌屬MF-07種...................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬DI70種......................I個命中物I個生物體.瑞士乳桿菌(lactobacillushelveticus)...........2個命中物I個生物體
或Al, Premium RUN986445 49879GATTTGTTGGACGCTAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAACAACATGAATCGCATGATTCAAGTTTGAAAGGCGGCGTAAGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC
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物體[根源；細胞生物體；細菌；厚壁菌門；桿菌綱；乳桿菌目；乳桿菌科].德氏乳桿菌....................................94個命中物7個生物體..德氏乳桿菌保加利亞亞種...........61個命中物3個生物體...德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCCBAA-365. . . 9個命中物I個生物體...德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC11842........ 10個命中物I個生物體..德氏乳桿菌印度亞種...............I個命中物I個生物體..德氏乳桿菌德氏亞種...............4個命中物I個生物體..德氏乳桿菌乳亞種....................13個命中物I個生物體.乳桿菌屬JCM8653種..............I個命中物I個生物體.乳桿菌屬CYl種.......................I個命中物I個生物體.未經培養的乳桿菌屬種.............9個命中物I個生物體[環境樣本].乳桿菌屬RA2120種.................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬RA2062種.................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬DJF_CR11種.............I個命中物I個生物體.乳桿菌屬RA2066種.................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬19-2種.......................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬JCM1552種..............I個命中物I個生物體.乳桿菌屬DumLacl種...............I個命中物I個生物體.乳桿菌屬MF-07種...................I個命中物I個生物體.乳桿菌屬DI70種......................I個命中物I個生物體.瑞士乳桿菌................................2個命中物I個生物體Selurl2菌株與嗜熱鏈球菌LMG 18311的參考序列(嗜熱鏈球菌菌株Selurl2的16SrPHK的PCR延伸可變區Vl和V3的序列(測序是由瑞士巴爾加赫的微合成實驗室進行))一致(100%)，Al, Premium RUN986447 49881GAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGAATGACTCATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGCTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACC權利要求
1.一種德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus)菌株Selur 6,其從由巴爾干山脈(Stara Planina Mountain)(保加利亞(Bulgaria))的原料乳生產的傳統酸奶中分離，且以登記號CCM 7712存放于捷克微生物保藏中心(CCM)。
2.一種德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Selur 19，其從由洛多皮山脈(RhodopeMountains)(保加利亞)的原料乳生產的傳統酸奶中分離，且以登記號CCM 7713存放于捷克微生物保藏中心(CCM)。
3.一種嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)菌株Selur 12,其從由巴爾干山脈(保加利亞)的原料乳生產的傳統酸奶中分離，且以登記號CCM 7711存放于捷克微生物保藏中心(CCM)。
4.一種發酵劑培養物，其含有至少一種根據權利要求I至3所述的細菌菌株，特征在于每種菌株可以在每克組合物IO6Cfu (集落形成單位)到IO11Cfu范圍內的活細胞濃度存在，包括每克組合物至少106cfu,例如107cfu/g,優選至少108cfu/g,例如至少109cfu/g,或至少101Qcfu/g,例如至少 10ncfu/go
5.根據權利要求4所述的發酵劑培養物，特征在于其含有2到3種根據權利要求I至3所述的菌株。
6.根據權利要求4所述的發酵劑培養物，特征在于其含有至少一種根據權利要求I至3所述的細菌菌株以及另一種培養物或含有兩種培養物的培養物混合物，各自以0. 1%到99. 9%、優選以1%到99%、更優選以10%到90%的比率存在于產品中。
7.根據權利要求6所述的發酵劑培養物，特征在于其含有至少一種根據權利要求I至3所述的細菌菌株以及以登記號CCM 7710存放于捷克微生物保藏中心(CCM)的加氏乳桿菌(Lb. gasseri)益生菌菌株K7，其中所述加氏乳桿菌菌株K7以在每克或每毫升組合物IO6Cfu (集落形成單位)到IO11Cfu范圍內的活細胞濃度存在，每克或每毫升組合物至少106cfu,例如至少 107cfu/g 或 107cfu/ml,即至少 108cfu/g 或 108cfu/ml,例如至少 109cfu/g或 109cfu/ml,例如至少 101Qcfu/g,例如至少 10ncfu/g。
8.根據權利要求4至7中任一權利要求所述的發酵劑培養物，其用于發酵各種通常經歷乳酸細菌發酵步驟的物質，例如奶、植物物質、肉制品、果汁和面團。
9.一種食品，其含有載劑物質和至少一種根據權利要求I至3所述的菌株或根據權利要求4至7中任一權利要求所述的發酵劑培養物。
10.根據權利要求9所述的產品，特征在于所述載劑物質代表以下食品組合物奶、酸奶、白干酪、發酵乳、基于奶的發酵產品、基于肉的發酵產品、基于發酵谷類物質的產品、基于奶和小麥的散劑、嬰兒食品、冰淇淋、果汁、糖果或口香糖。
11.一種制造根據權利要求I至3所述的細菌菌株和加氏乳桿菌菌株K7的生物質以及制造根據權利要求4至6所述的益生菌發酵劑培養物的方法，特征在于其以環境制備、實施發酵和最終凍干等步驟進行。
12.根據權利要求11所述的方法，特征在于其基于奶發酵或其它發酵基質進行，所述其它發酵基質例如為乳清或植物基質，例如豆乳、米乳或其它谷物乳。
13.一種獲得打算供人和動物使用的食品補充劑和藥物制劑的方法，所述食品補充劑和藥物制劑含有至少一種根據權利要求I至3所述的細菌菌株以及加氏乳桿菌菌株K7，或獨立含有加氏乳桿菌菌株K7。
14.根據權利要求13所述的方法，特征在于其基于奶發酵或其它發酵基質進行，所述其它發酵基質例如為乳清或植物基質，例如豆乳、米乳或其它谷物乳。
15.一種打算供人和動物使用的食品補充劑組合物，特征在于其含有至少一種根據權利要求I至3所述的細菌菌株以及加氏乳桿菌菌株K7或其它菌株，或獨立含有加氏乳桿菌菌株K7。
16.一種醫藥組合物，特征在于其含有至少一種根據權利要求I至3所述的細菌菌株以及加氏乳桿菌菌株K7或其它菌株，或獨立含有加氏乳桿菌菌株K7。
17.根據權利要求15至16所述的組合物，特征在于其含有至少一種根據權利要求I至3所述的細菌菌株，數量為每克載劑物質IO7Cfu到約IO12Cfu,以及加氏乳桿菌菌株K7，數量為每克載劑物質約IO8Cfu到約IO12Cfu,優選每克載劑物質IO9Cfu到約IO12Cfu,更優選約IO10Cfu 到約 IO12Cfu0
18.根據權利要求15至17所述的組合物，特征在于其也含有其它食品補充劑、益生菌、礦物質、維生素和其它食品或/和藥學上可接受的物質。
19.根據權利要求I至3中任一權利要求所述的細菌菌株、根據權利要求4至7和15至18所述的培養物、組合物或產品，其打算用于治療性或預防性治療人或動物的疾病。
20.一種根據權利要求I至3中任一權利要求所述的菌株、根據權利要求4至6和15至18所述的培養物、組合物或產品的用途，用于獲得打算用于治療性或預防性治療人或動物疾病的產品。
21.根據權利要求20所述的用途，特征在于所述疾病是胃腸道疾病。
22.根據權利要求20至21所述的用途，特征在于所述疾病選自包含以下的群組抗生素相關病癥、胃腸炎、腹瀉(包括旅行者腹瀉和急性兒童腹瀉)、不耐癥、胃腸道感染、病原菌(包括難辨梭菌(Clostridium difficile))在胃腸道中的發展、腸易激綜合癥(IBS)、炎癥性腸道疾病(IBD)和其它免疫調節綜合癥。
全文摘要
本專利申請涉及從生產于保加利亞山脈(Bulgarian mountains)——巴爾干山脈(Stara Planina)和洛多皮山脈(Rhodopes)中的傳統酸奶中分離的德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)(Selur 6和Selur 19)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)Selur 12的新穎菌株，以及這些新穎菌株組合從母乳喂養嬰兒的糞便中分離的益生菌菌株加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)K7用于制造打算供人或動物使用的益生菌食品補充劑的用途。本發明還涉及預防和治療制劑，其含有上述菌株和來源于奶或乳清發酵的生源物質的不同組合作為活性組分，且希望用于維持宿主的整體健康狀態以及預防和/或治療胃腸道疾病。此外，還公開了基于用上述菌株對奶或乳清進行發酵來制造益生菌發酵劑培養物、益生菌保加利亞酸奶和益生菌食品補充劑的程序。
文檔編號A23L1/314GK102686112SQ201080058508
公開日2012年9月19日 申請日期2010年10月27日 優先權日2009年10月27日
發明者博雅那·博古維克·瑪蒂翟西科, 瓦倫蒂娜·尼古拉耶芙娜·科斯塔迪諾娃, 羅蓋利·羅蓋利 申請人:塞路爾控股有限公司