用于擴增核酸的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于擴增核酸的方法和組合物的制作方法
用于擴增核酸的方法和組合物
相關申請的交叉參考本申請依據35U.S.C. § 119(e)要求2007年6月18日申請的美國專利申請號 60/944，708的優先權，該專利申請通過引用結合到本文中。發明領域W001]本發明的公開 內容涉及用于核酸序列擴增的方法和組合物。
導言來自犯罪現場或其它非無菌環境的DNA樣品的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增可被樣 品自身中存在的抑制因子影響。例如，戶外犯罪可能留下體液，例如沉積在土壤、沙地或林 木上的血液和精液，其可以含有可與樣品的DNA共提取并阻止PCR擴增的物質。來自室內 犯罪現場的紡織染料、皮革和木制品也可能含有DNA聚合酶抑制因子。擴增含有抑制因子 的DNA樣品的最終結果可能是在短串聯重復序列(STR)復合體中部分乃至完全缺失等位基 因。
發明概述在某些方面，本發明提供一種用于擴增人類法醫樣品中的靶核酸序列的方法。所 述方法包括提供含有靶核酸序列的人類法醫樣品；將至少一種高穩定性引物和靶核酸序列 混合，其中所述高穩定性引物包含至少一種高穩定性核酸類似物；并對樣品實施擴增反應， 由此通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。在某些方面，本發明提供一種擴增樣品中的核酸序列的方法。所述方法包括提供 含有靶核酸序列的樣品，其中所述靶核酸序列包含短串聯重復序列；將至少一種高穩定性 引物和靶核酸序列混合，其中所述高穩定性引物包含至少一種高穩定性核酸類似物，其中 所述高穩定性引物以允許短串聯重復序列擴增的方式與靶核酸序列特異性雜交；并對樣品 實施擴增反應，由此通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。在某些方面，本發明提供一種用于PCR反應的試劑盒。所述試劑盒包括三磷酸 脫氧核苷酸；熒光標記引物；非標記引物，其中至少一種引物是高穩定性引物，其中所述高 穩定性引物包含至少一種高穩定性核酸類似物；裝有等位基因分型標準物(an allelic ladder)的容器，所述等位基因分型標準物對應于適于同短串聯重復序列分析比較的大小； 和DNA聚合酶。在某些方面，本文提供用于PCR反應的試劑盒。所述試劑盒包括三磷酸脫氧核苷 酸、熒光標記引物、含有至少一種高穩定性核酸類似物的高穩定性引物和DNA聚合酶。在某些方面，本發明提供一種用于人類鑒定的引物。所述引物具有與選自以下 的至少一個基因座的序列互補的序列:CSF1P0、FGA、THOU TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、 D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433 和 D2S1338，其中所述引物中 的至少一個核酸為高穩定性核酸類似物。在某些方面，本發明提供一種鑒別某個體的靶核酸序列的方法。所述方法包括提 供一種樣品，其中所述樣品處于被認為被可以抑制核酸擴增的組分污染的位置，其中所述
6樣品包含來自個體的靶核酸序列。所述方法進一步包括使用至少一種高穩定性引物擴增 個體的靶核酸序列，其中所述高穩定性引物包含至少一種高穩定性核酸類似物，其中所述 引物可以擴增選自以下的至少一個基因座的序列CSFlP0、FGA、TH01、TP0X、vWA、D3S1358、 D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433、D2S1338 或其某些 組合，其中所述引物進一步包含遷移率調節物。所述方法進一步包括表征擴增的靶核酸序 列，由此鑒定擴增的靶核酸序列。在某些方面，本發明提供一種擴增樣品中的核酸序列的方法。所述方法包括提供 包含靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品；混合至少一種高穩定性引物和靶核酸序列，其中 所述高穩定性引物包含至少一種高穩定性核酸類似物；并對所述樣品實施擴增反應，由此 通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。
附圖簡述

圖1顯示了擴增靶核酸序列的某些示例性實施方案。圖2顯示了擴增靶核酸序列的某些示例性實施方案。圖3A顯示了擴增靶核酸序列的某些示例性實施方案。圖3B顯示了擴增靶核酸序列的某些示例性實施方案。圖4顯示了有或沒有腐殖酸的琺瑯蛋白(Amel)-LNA寡聚物的性能。技術人員應當明白，提供附圖僅是為了闡述目的。所述附圖無意以任何方式限制 本發明教導的范圍。
多個實施方案的描述本發明教導的某些實施方案提供有利于核酸擴增的組合物和方法。在某些實施 方案中，本發明教導提供用于克服或降低擴增抑制的方法和組合物，尤其用于在某些時候 位于非無菌環境中并可以包含污染物如PCR抑制因子的組分或組成物。在某些實施方 案中，本發明教導提供即便在存在這樣的PCR抑制因子時也增強現有擴增方案的穩定性 (robustness)的方法和組合物。本領域技術人員將認識到，盡管實驗室的一般性核酸擴增對本領域技術人員可能 是常規的，但擴增來自非實驗室條件的核酸樣品(例如取自犯罪現場的樣品)的能力可包 括核酸擴增抑制因子。一種降低PCR抑制因子影響的方法是在同一基因或基因座選擇另一 個引發序列。然而，本發明人已認識到，這種方案具有許多潛在的不利方面(例如某些引物 已被確定為可接受的和需要大量工作來引入新引物的情況)。在本文公開內容中公開的某 些實施方案表明了可如何解決這種潛在的不利。與選擇新引物相反，已經發現，保持相同的 基礎引物序列但是用高穩定性核酸類似物修飾該序列，以使引物在雜交時表現出更高穩定 性(例如其熔點高于對等引物)，具有顯著的益處。由于高穩定性核酸類似物的取代是對等 的，所以提供了大量關于應如何修飾每種引物以實現預期結果的指引。另外，該方案可容易 地應用于具有表征引物的試劑盒、組合物和技術(例如，其可用于擴增STR標記，包括CODIS 基因座)。本領域技術人員將認識到，按照本發明的公開內容，保持修飾的高穩定性引物中 的原始引物序列可能是重要的，因為其確保與原始的未修飾引物的基因型一致性。保持相同引物序列的優勢是防止由于引物結合位點突變或多態化而引起的等位基因脫落。由樣品中的靶核酸序列擴增獲得的信息可用于各種用途。例如，所述信息可用于 遺傳作圖、連鎖分析、臨床診斷或身分鑒定試驗。在某些實施方案中，所述信息可用于鑒別 核酸的來源(例如目標個體)或縮窄核酸的可能來源。在某些這樣的實施方案中，所述信 息可用于例如法醫學鑒定、生父鑒定試驗、DNA譜分析和相關應用。
某些定義
本文使用的術語“核苷酸堿基”是指一個或多個取代的或未取代的芳香族環。在某 些實施方案中，一個或多個芳香族環包含至少一個氮原子。在某些實施方案中，核苷酸堿基 能夠與適當互補的核苷酸堿基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氫鍵。示例性的核苷 酸堿基及其類似物包括但不限于天然核苷酸堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、6甲基-胞嘧啶、 尿嘧啶、胸腺嘧啶，以及天然核苷酸堿基的類似物，例如7-脫氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌 呤、7-脫氮雜-8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜-8-氮雜腺嘌呤、N6- Δ 2-異戊烯基腺嘌呤(6iA)、 Ν6-Δ2-異戊烯基-2-甲基硫代腺嘌呤(2ms6i Δ)、N2-二甲基鳥嘌呤(dmG)、7_甲基鳥嘌呤 (7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿 苷、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、2-硫 代嘧啶、6-硫代鳥嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、O6-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、 O4-甲基胸腺嘧啶、5，6_ 二氫胸腺嘧啶、5，6_ 二氫尿嘧啶、吡唑并[3，4-D]嘧啶(參見例如 美國專利號6，143，877和6，127，121和PCT公布申請號WO 01/38584)、乙烯基腺嘌呤、吲哚 (如硝基吲哚和4-甲基吲哚)和吡咯(如硝基吡咯)。某些示例性的核苷酸堿基可見于例 如Fasman,1989,Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology,385-394 頁，CRC Press, Boca Raton, Fla.，以及其中提及的參考文獻。“核苷酸”是指作為單體單元或在核酸中的核苷的磷酸酯。“核苷酸5'-三磷 酸”是指在5 ‘位具有三磷酸酯基團的核苷酸，有時表示為“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”， 以具體指出核糖的結構特征。三磷酸酯基團可以包括多個氧的硫取代，例如α-硫代-核 苷酸5'-三磷酸。關于核酸化學的綜述參見Shabarova，Ζ.和Bogdanov，A. Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,VCH,New York，1994。術語核苷酸還包括核苷酸類 似物。所述糖可為取代的或未取代的。示例性的核糖包括但不限于2' -(C1-C6)烷氧基核 糖、2' -(C5-C14)芳氧基核糖、2'，3' - 二脫氫核糖、2'-脫氧-3'-鹵代核糖、2'-脫 氧-3'-氟代核糖、2'-脫氧-3'-氯代核糖、2'-脫氧-3'-氨基核糖、2'-脫 氧-3' -(C1-C6)烷基核糖、2'-脫氧-3' -(C1-C6)烷氧基核糖和2'-脫氧-3' -(C5-C14) 芳氧基核糖、核糖、2'-脫氧核糖、2' ,3'-雙脫氧核糖、2'-鹵代核糖、2'-氟代核糖、 2'-氯代核糖和2'-烷基核糖，例如2' -0-甲基、4' -α-異構核苷酸、1' -α-異構 核苷酸、‘-4'-和3' -4'-連接的和其它“已鎖的”或“LNA”、雙環糖修飾(參見例如 PCT公布申請號WO 98/22489, WO 98/39352 ；和W099/14226)。在多核苷酸中的示例性LNA糖類似物包括但不限于以下結構
其中B為
任何核苷酸堿基。LNA是一類可按照標準Watson-Crick堿基配對規則形成堿基對的核酸類似物。摻 入LNA的寡核苷酸已增加了熱穩定性，并改善了相對于它們的核酸靶的區分能力。用于寡 核苷酸合成的LNA可由多個公司商購，例如丹麥的Exiqon (參見國際站點誦exiqon. com 和美國專利號6，670，461，其通過引用整體結合到本文中)。本文使用的術語“核苷酸類似物”是指任何非腺嘌呤、非胸腺嘧啶、非鳥嘌呤、非胞 嘧啶、非尿嘧啶核酸(其中“腺嘌呤”、“胸腺嘧啶”、“鳥嘌呤”、“胞嘧啶”和“尿嘧啶”中的每 一個都僅是指天然核酸)。本領域技術人員將認識到，核苷酸類似物仍將與以上的一種堿基 配對。核苷酸類似物包括高穩定性核苷酸，并因此至少包含PNA (肽核酸)、LNA(鎖核酸)、 2' -0-甲基核酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、含硫代磷酸酯鍵的核酸或其任意組 合。在某些實施方案中，核苷酸類似物是指其中戊糖和/或核苷酸堿基和/或核苷酸的一個 或多個磷酸酯可被其相應類似物置換的實施方案。在某些實施方案中，示例性的戊糖類似 物是上述的那些物質。在某些實施方案中，核苷酸類似物具有如上所述的核苷酸堿基類似 物。在某些實施方案中，示例性的磷酸酯類似物包括但不限于膦酸烷基酯、膦酸甲酯、氨基 磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸 酯、苯胺磷酸酯、磷酸酰胺、硼烷磷酸酯等，并可以包括結合的反離子。可聚合為多核苷酸類 似物的核苷酸類似物單體也包括在“核苷酸類似物”的定義中，在所述多核苷酸類似物中， DNA/RNA磷酸酯和/或糖磷酸酯主鏈被不同類型的核苷酸間鍵取代。示例性的多核苷酸類 似物包括但不限于肽核酸，其中多核苷酸的糖磷酸酯主鏈被肽主鏈置換。示例性的修飾戊 糖部分包括但不限于2'-修飾或3'-修飾，其中2'-位或3' _位為氫、羥基、烷氧基，例 如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基和苯氧基、疊氮基、氨基或烷基氨 基、氟代、氯代、溴代等。修飾的核苷酸間鍵包括磷酸類似物、具有非手性的不帶電荷的亞單 位間鍵的類似物(例如Sterchak，E.P.等人，Organic Chem, 52 =4202(1987))以及不帶電荷 的基于嗎啉代的、具有非手性的亞單位間鍵的聚合物(例如美國專利號5，034，506)。其中 常規的糖和核苷酸間鍵已被2-氨基乙基甘氨酸酰胺主鏈聚合物置換的另一類示例性多核苷酸類似物是肽核酸(PNA)(例如 Nielsen 等人，Science, 254 1497-1500 (1991) ；Egholm 等人，J. Am. Chem. Soc. , 114 1895-1897 (1992))。本文使用的術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互換使用，是指單鏈和雙鏈的核苷酸單體聚合物，包括通過核苷酸間磷酸二酯鍵或者核苷酸間類似物以及結合的反離 子(例如H+、NH4+、三烷基銨、Mg2+、Na+等)連接的2'-脫氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷 酸(RNA)。核酸可以完全由脫氧核糖核苷酸組成，完全由核糖核苷酸組成，或由其嵌合混合 物組成。核苷酸單體單元可以包括本文描述的任一種核苷酸，包括但不限于天然核苷酸和 核苷酸類似物。核酸的大小通常在數個單體單元(例如5-40個，此時它們在本領域有時 被稱為寡核苷酸)至數千個單體核苷酸單元的范圍內。除非另有說明，否則無論何時提出 核酸序列，其都被理解為由左至右核苷酸處于5' -3'的順序，“A”代表脫氧腺苷或其類似 物，“C”代表脫氧胞苷或其類似物，“G”代表脫氧鳥苷或其類似物，“T”代表胸苷或其類似 物，而“U”代表尿苷或其類似物，除非另有說明。核酸還包括但不限于基因組DNA、eDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化核酸、得 自亞細胞器如線粒體或葉綠體的核酸，以及得自可存在于生物樣品之上或當中的微生物或 DNA病毒或RNA病毒的核酸。核酸包括但不限于合成產物或體外轉錄產物。術語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”還可以包括核酸類似物、多核苷酸類似物 和寡核苷酸類似物。術語“核酸類似物”、“多核苷酸類似物”和“寡核苷酸類似物”可以互換 使用，在本文是指含有至少一個核苷酸類似物和/或至少一個磷酸酯類似物和/或至少一 個戊糖類似物的核酸。以下的核酸也包括在核酸類似物的定義中其中磷酸酯鍵和/或糖 磷酸酯鍵被其它類型的鍵置換，例如N- (2-氨基乙基)-甘氨酸酰胺和其它酰胺(參見例如 Nielsen 等人，1991，Science 254 1497-1500 ；WO 92/20702 ；美國專利號 5，719，262 ；美國 專利號5，698，685)；嗎啉代(參見例如美國專利號5，698，685 ；美國專利號5，378，841 ；美 國專利號 5，185，144)；氨基甲酸酯(參見例如 Stirchak&Summerton，1987，J. Org. Chem. 52 4202)；亞甲基(甲基亞氨基)(參見例如 Vasseur 等人，I"2，J.Am· Chem. Soc. 114 4006)； 3 ‘-硫甲縮酸(thioformacetals)(參見例如 Jones 等人，1993，J. Org. Chem. 58 2983)； 磺酸酯(參見例如美國專利號5，470，967) ；2-氨基乙基甘氨酸，通常稱為PNA(參見例如 Buchardt, WO 92/20702 ；Nielsen (1991) Science254 1497-1500)；以及其它鍵(參見例如 美國專利號 5，817，781 ；Frier&Altman, 1997，Nucl. Acids Res. 25 4429 和其中提及的參考 文獻)。磷酸酯類似物包括但不限于(Dc1-C4烷基膦酸酯，例如膦酸甲酯；(ii)氨基磷酸 酯；(Iii)C1-C6烷基磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯；和(V) 二硫代磷酸酯。“STR基因座”是指含重復單元的染色體區，所述重復單元的數量在給定物種如人 的某些個體中是可變的。重復序列不一定完美重復，可以含有中斷。術語“STR基因座” 包含例如通過擴增反應產生的這類染色體區的拷貝。STR基因座的實例可以包括但不限 于=THOU TPOX, CSF1P0、vWA、FGA, D3S1358、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、D8S1179、 D18S51、D21S11、D2S1338、D3S1539、D4S2368、D9S930、D10S1239、D14S118、D14S548、 D14S562、D16S490、D16S753、D17S1298、D17S1299、D19S253、D19S433、D20S481、D22S683、 HUMCSF1P0、HUMTP0X, HUMTHO1、HUMF13A01、HUMBFXIII、HUMLIP0L、HUMvWFA31。STR 標記的 多重PCR的實例可見于美國專利號7008771、6767703、6479235、6221598，每個專利均通過 引用整體結合到本文中。本領域技術人員將認識到，被配置為擴增或允許擴增以上基因座之一的序列的引物可以具有在基因座內或在基因座的任一側雜交的序列。

本文使用的術語“C0DIS基因座”是指以FBI的“組合的DNA索引系統(Combined DNA Index System) ”命名的 STR 基因座。13 個核心 STR 基因座為 THO1、TPOX、CSFlPO、vWA、 FGA、D3S1358、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、D8S1179、D18S51 和 D21S11。(參見例如 Butler, Forensic DNA Typing, Academic Press (2001)，H 63 M ) 。 FBI ^TU 歹ijdj 白勺 13個基因座的組中添加其它的基因座。術語“擴增產物”是指擴增反應的產物，所述擴增反應包括但不限于引物延伸、聚 合酶鏈式反應、RNA轉錄等。因此，示例性的擴增產物可以包括一種或多種選自以下的產物 引物延伸產物、PCR擴增子、RNA轉錄產物等。本文使用的術語“擴增”是指通常以模板依賴性方式再生產至少一部分靶多核苷 酸、靶多核苷酸替代品或其組合的任何方法，包括但不限于以線性或指數方式擴增核酸序 列的廣泛技術。實施擴增步驟的示例性方法包括連接酶鏈式反應(LCR)、連接酶檢測反應 (LDR)、連接繼之以Q-復制酶擴增、PCR、引物延伸、鏈置換擴增(SDA)、超支鏈置換擴增、多 重置換擴增(MDA)、基于核酸鏈的擴增(NASBA)、兩步多重擴增、滾環擴增(RCA)等，包括多 重形式或其組合，例如但不限于 OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/ PCR、PCR/LCR(也稱為組合鏈式反應-CCR)等。這些技術的描述除了其它地方以外還可見 于 Sambrook 等人，Molecular Cloning,第 3 版；Ausbel 等人；PCR Primer :A Laboratory Manual，Diffenbach 編輯，Cold Spring Harbor Press (1995) ；The Electronic Protocol Book, ChangBioscience (2002)，Msuih 等人，J. Clin. Micro, 34 :501_07 (1996) ；TheNucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley 編輯，Humana Press, Totowa, N. J. (2002) ；Abramson 等人，Curr Opin Biotechnol. 1993 年 2 月，4(1) :41_7 ；美國專利號 6，027，998 ；美 國專利號6，605, 451 ；Barany等人，PCT公布號WO 97/31256 ；Wenz等人，PCT公布號 W001/92579 ；Day 等人，Genomics,29(1) 152-162(1995) ；Ehrlich 等人，Science 252 1643-50(1991) ；Innis 等人，PCR Protocols :A Guide toMethods and Applications, Academic Press(1990) ；Favis φ 人，NatureBiotechnology 18:561—64(2000);禾口 Rabenau 等人，Infection 28:97-102(2000) ；LCR 試劑盒說明書(LCR Kit Instruction Manual)，目錄號 #200520,修訂號 #050002, Stratagene, 2002 ；Barany, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 88:188-93(1991) ；Bi 和 Sambrook，Nucl. Acids Res. 25 2924-2951 (1997)； Zirvi 等人，Nucl. Acid Res. 27 :e40i_viii (1999) ；Dean 等人，Proc Natl Acad Sci USA 99 5261-66 (2002) ；Barany 禾口 Gelfand，Gene 109 1-11(1991) ；Walker 等人，Nucl. Acid Res. 20 1691-96 (1992) ；Polstra 等人，BMC Inf. Dis. 2 18-(2002) ；Lage 等人， GenomeRes. 2003 年 2 月，13 (2) 294-307 ；和 Landegren 等人，Science241 1077-80 (1988)， Demidov, V.，Expert Rev Mol. Diagn. 2002 年 11 月，2 (6) · 542-8 ；Cook 等人，J Microbiol Methods. 2003 年 5 月，53(2) 165-74 ;Schweitzer 等人，Curr Opin Biotechnol. 2001 年 2 月，12(1) 21-7 ；美國專利號5，830，711 ；美國專利號6，027，889 ；美國專利號5，686，243 ； 公開的P. C. T.申請WO 0056927A3，以及公開的P. C. T.申請WO 9803673A1。在某些實施方 案中，新形成的核酸雙鏈體最初未被變性，但以其雙鏈形式用于一個或多個隨后步驟。在 本發明教導的某些實施方案中，可以將非常規的核苷酸堿基導入到擴增反應產物中，并通 過酶促(例如糖基化酶)和/或物理_化學方法處理產物，以便使產物不能用作隨后擴增的模板。在某些實施方案中，可以將尿嘧啶作為核堿基包含在反應混合物中，由此允許隨 后的反應，以通過使用尿嘧啶-N-糖基化酶清除先前含尿嘧啶的產物的遺留物(參見例如 公開的P. C. T.申請WO 9201814A2、美國專利號5，536，649和授予Andersen等人的美國臨 時申請60/584，682，其中UNG清除和磷酸化在同一反應混合物中進行，所述反應混合物還 含有可熱活化的連接酶)。在本發明教導的某些實施方案中，可以在擴增之前使用多種技 術中的任一種，以便促使擴增成功，例如在Radstrom等人，Mol Biotechnol. 2004年2月， 26(2) :133-46中所述。在某些實施方案中，可以整裝集成的方案實現擴增，所述方案包括 樣品制備和檢測，例如在美國專利號6，153，425和6，649，378中所述。反向修飾酶，例如 但不限于在美國專利號5，773，258中描述的那些，也在所公開的教導的范圍內。本領域 的人員將理解，可以在公開的方法和試劑盒中使用具有預期酶活性的任何蛋白。DNA聚合 酶(包括逆轉錄酶、尿嘧啶N-糖基化酶等)的描述除了其它地方以外還可見于Twyman， Advanced Molecular Biology, BIOSScientific Publishers, 1999 ；Enzyme Resource Guide,rev. 092298,Promega, 1998 ；Sambrook 禾口 Russell ；Sambrook 等人；Lehninger ；PCR The Basics ；和 Ausbel 等人。 “引物核酸”或“引物”是指這樣的核酸其可以與靶核酸或模板核酸雜交，并允許 使用例如摻入核苷酸的生物催化劑(例如在適宜的反應條件下的聚合酶)進行鏈延伸或延 長。這樣的條件可以包括在適宜的緩沖液(“緩沖液”包括為輔因子或影響PH、離子強度等 的替代物)中并在適宜的溫度下，存在一種或多種三磷酸脫氧核糖核苷酸和摻入核苷酸的 生物催化劑。引物核酸例如可以為天然的或合成的寡核苷酸(例如單鏈寡脫氧核糖核苷酸
寸乂 O術語“引物組”是指在適合的條件下特異性雜交并擴增靶序列的至少一種引物。在 某些實施方案中，引物組包含至少兩種引物。術語“STR特異性引物組”是指用于分析STR基因座的至少兩種引物。本文使用的術語“或其組合”是指在該術語之前所列條目的所有排列和組合。例 如，“A、B、C或其組合”意在包括以下的至少一種A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且如果順序在 特定背景下是重要的，則還包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。接續該實例，明確 包括含有一個或多個條目或術語的重復的組合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA, CABABB，諸如此類。技術人員將理解，關于任一組合中的條目或術語的數目通常沒有限制， 除非由上下文顯而易見。本文使用的術語“遷移率調節物”是指在篩分或非篩分基質中賦予寡核苷酸電泳 遷移率的聚合物鏈，所述電泳遷移率相對于混合物中的其它聚合物鏈的電泳遷移率明顯不 同。典型地，遷移率調節物在與所述成分雜交或結合時改變電荷/移動摩擦阻力；或者賦 予與眾不同的遷移率，例如但不限于在層析分離介質中與眾不同的洗脫特征或在與對應成 分雜交或結合時在篩分基質或非篩分基質中與眾不同的電泳遷移率；或者二者兼有(參見 例如美國專利號5，470，705和5，514，543)。關于遷移率調節物的多個實例，參見例如美國 專利號 6，395，486,6, 358，385,6, 355，709,5, 916，426,5, 807，682,5, 777，096,5, 703，222、 5，556，7292、5，567，292、5，552，028、5，470，705，和 Barbier 等人，Current Opinion in Biotechnology, 2003,14 1 :51_57。在某些實施方案中，至少一種遷移率調節物包含至少 一條核苷酸聚合物鏈，包括但不限于至少一條寡核苷酸聚合物鏈、至少一條多核苷酸聚合物鏈，或者至少一條寡核苷酸聚合物鏈和至少一條多核苷酸聚合物鏈(參見例如公開的 P. C. T.申請WO 9615271A1，以及Keygene SNPWave 關于使用已知數量的核苷酸來賦予連 接產物遷移率的某些實例的產品文獻)。在某些實施方案中，至少一種遷移率調節物包含至 少一條非核苷酸聚合物鏈。示例性的非核苷酸聚合物鏈包括但不限于肽、多肽、聚環氧乙烷 (PEO)等。在某些實施方案中，至少一條聚合物鏈包含至少一條基本不帶電的水溶性鏈，例 如由PEO單元組成的鏈；多肽鏈；或其組合。聚合物鏈可以包含均聚物、隨機共聚物、嵌段 共聚物或其組合。而且，聚合物鏈可以具有線性結構、組合結構、分支結構、樹狀結構(例如 含有聚酰胺胺樹狀聚合物的聚合物，Polysciences，Inc. Warrington，Pa.)或其組合。在某 些實施方案中，至少一條聚合物鏈在雜交或結合某種成分時為親水的，或者至少足夠親水， 以確保所述成分-遷移率調節物在水性介質中易于溶解。在遷移率依賴性分析技術為電泳 時，在某些實施方案中，聚合物鏈是不帶電的，或者所具有的電荷/亞單位密度顯著低于其 對應成分。可用作遷移率調節物的聚合物鏈的合成至少部分取決于聚合物的性質。制備適 宜的聚合物的方法一般依據眾所周知的聚合物亞單位合成方法。這些方法涉及使限定大小 的多亞單位聚合物單元彼此直接或通過帶電或不帶電的連接基團偶聯，這些方法一般適用 于廣泛的聚合物，例如聚環氧乙烷、聚乙醇酸、聚乳酸、聚氨酯聚合物、多肽、寡糖和核苷酸 聚合物。這些聚合物單元偶聯的方法還適于合成選定長度的共聚物，例如聚環氧乙烷單元 和聚丙烯單元交替的共聚物。可以通過標準固相方法(例如Int. J. PeptideProtein Res.， 35 161-214(1990))合成選定長度和氨基酸組成的多肽，其或者為均聚物，或者為混合的 聚合物。一種方法用于制備PEO聚合物鏈，其具有選定數量的六環氧乙烷(HEO)單元，在一 個末端用二甲氧基三苯甲基(DMT)保護HEO單元，并在其另一個末端用甲磺酸酯活化。然 后使活化的HEO與第二個DMT保護的HEO基團反應，以形成DMT保護的HEO 二聚體。然后 連續進行此單元添加，直至獲得預期的PEO鏈長(例如美國專利號4，914，210 ；另參見美國 專利號 5，777，096)。
三磷酸脫氧核苷酸(“dNTP”)是擴增核酸分子的結構單元，通常在標準PCR反應 中以各40-200 μ M濃度的三磷酸脫氧腺苷(“dATP”)、三磷酸脫氧鳥苷(“dGTP”)、三磷酸 脫氧胞苷(“dCTP”)和三磷酸脫氧胸苷(“dTTP”)提供。還可以使用其它dNTP(例如三磷 酸脫氧尿苷(“dUTP”))以及dNTP類似物和綴合的dNTP，其包含在本文使用的術語“dNTP” 中。盡管以這樣的濃度使用dNTP符合本發明的方法，但高于200 μ M的dNTP濃度可能是有 利的。因此，在本發明方法的某些實施方案中，每種dNTP的濃度一般為至少500 μ M，并可以 達到2mM的范圍。在某些進一步的實施方案中，每種dNTP的濃度可以在0. 5mM-lmM的范圍 內。本文使用的術語“提供”在廣義上是指提供、獲得或具有某物(例如樣品)，或者使 某物可獲得，且不以任何方式被所提供物品的來源或供應商限制。本文使用的“樣品”是指包含或推測包含目標核酸(靶核酸序列)或自身為含有 或推測含有目標靶核酸序列的核酸的任何物質。術語“樣品”因此包括核酸(基因組DNA、 cDNA、RNA)、細胞、生物體、組織、體液或包括但不限于例如以下的物質的樣品血漿、血清、 腦髓液、淋巴液、滑液、尿液、淚液、糞便，皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物，唾 液、血細胞、腫瘤、器官、組織、體外細胞培養成分的樣品、天然分離物(例如飲用水、海水、 固體材料)、微生物標本以及已用核酸示蹤分子“標記”的對象或標本。術語樣品可以包括取出用于隨后測試的實際樣品(例如用于測試的土壤、血液或一片衣服)。盡管樣品在多個 處理階段當中可以改變(例如其取自衣服并被轉移至在無菌容器中的溶液)，但樣品始終 包含靶核酸序列。術語“位置(location) ”表示樣品在某些時間點所定位的區域。例如，樣品可以位于鈍器上、轉移至一片衣服、轉移至土壤，然后轉移至無菌管。這些當中的每一處均應當是 樣品的位置。本領域技術人員將認識到，許多位置，實際上大部分非實驗室相關位置，含污 染物如PCR抑制因子的可能性都很高。術語“PCR抑制因子”表示所述化合物的存在一般降低PCR擴增或核酸擴增的效 率或有效性。本領域技術人員將認識到，PCR抑制因子不需要所述化合物完全抑制所有的 擴增(這樣的化合物將被表示為“完全抑制因子”)。相反地，任何量的抑制都可能是足夠 的，例如 0-1 %、1-10 %、10-2020-3030-4040-50 50-6060-7070-80%、 80-90%、90-95%、95-98%、98-99%或99-100%抑制。在某些實施方案中，推測由非實驗室 條件(或位置)收集的樣品包含PCR抑制因子。在某些實施方案中，可以測試樣品，以確定 是否存在PCR抑制因子(例如通過運行對照PCR)。在某些實施方案中，當樣品的位置提示 可能存在PCR抑制因子時推定存在PCR抑制因子。在某些實施方案中，PCR抑制因子選自 以下的至少一種腐殖酸、膽鹽、其它鹽、復合多糖、膠原、亞鐵血紅素、黑色素、真黑素、肌紅 蛋白、多糖、蛋白酶、鈣離子、尿素、血色素、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G、靛青染料、血色素、棕黃 酸、二價陽離子、螯合分子、酶，以及蛋白、腐殖酸、復合多糖、EDTA、EGTA、DNA酶和膠原。術語“標準穩定性引物”表示引物是標準核酸序列引物。所述引物可以包含核酸， 例如A、T、G、C或U。該術語在本文一般用于和對等的高穩定性引物相比較。在提及標準穩定性引物和高穩定性引物時使用的術語“對等(的)(comparable)，， 表示除了所指出的一個或多個差異以外，所述序列是相同的(例如高穩定性引物包含一個 或多個核酸類似物，所述類似物是對標準穩定性引物中的核酸的對等置換)。當第一個和第 二個核酸具有相同的或相似的堿基配對選擇特性時(例如二者的堿基配對均為A堿基配對 T、G和C，或者二者的堿基配對均為C堿基配對A、T或G)，核酸置換是“對等的”。術語“高穩定性引物”表示引物包含至少一種高穩定性核酸類似物。本領域技術 人員將認識到，在某些實施方案中，高穩定性引物可退火，以便允許STR(例如CODIS序列之 一)擴增。術語“高穩定性核酸類似物”表示所述核酸是一種核酸類似物，所述核酸在與第一 個天然核酸堿基配對時比在相同的環境條件下應結合同樣的第一種核酸的對等的第二種 天然核酸更強烈地結合。在某些實施方案中，這意味著在相同環境條件(例如PCR條件) 下高穩定性核酸類似物具有比天然核酸高的Tm。在某些實施方案中，高穩定性核酸類似物 可以為PNA、LNA、2' -0-甲基核酸、2' _0_烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯鍵 的核酸或其任意組合。當高穩定性核酸類似物與第二種天然核酸均具有相同或相似的堿基 配對選擇特性時(例如它們兩個對A的堿基配對超過T、G和C，或者它們兩個對C的堿基 配對超過A、T或G)，它們是對等的。堿基配對作用的相對強度可以多種方式確定，例如計 算機建模、本領域技術人員的標準知識或通過堿基配對分子的熔點分析。在某些實施方案 中，這可以通過制備兩種引物來檢驗，第一種引物具有可能的高穩定性核酸類似物(例如 ATC (LNA G)GC)和對等的標準穩定性引物(例如ATCGGC)，并將兩種引物的熔點與同一互補序列對比(例如TAGCCG)。本文使用的“靶核酸序列”是指被復制、擴增和/或檢測的核酸區域。在某些實施方案中，“靶核酸序列”或“模板核酸序列”處于用于擴增的兩個引物序列之間。本領域技術 人員會認識到，靶核酸可以來自通過表征靶核酸序列被鑒定或匹配的個體或小組。這樣的 個體可被稱為“目標個體”。在某些實施方案中，目標個體是已知的。在某些實施方案中，目 標個體是未知的。在本申請中，一個序列與另一個序列相同或互補的陳述包括以下情況其中兩個 序列彼此完全相同或互補，以及其中一個序列的僅一部分與另一個序列的一部分或完全相 同或互補。在此情況下，術語“序列”包括但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探針、弓丨 物、引物特異性部分和靶特異性部分。在本申請中，一個序列與另一個序列互補的陳述包括以下情況其中兩個序列具 有錯配。在此情況下，術語“序列”包括但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探針、引物、 引物特異性部分和靶特異性部分。盡管存在這些錯配，但兩個序列在適宜的條件下彼此應 選擇性雜交。在本申請中，一個序列與另一個序列雜交或結合的陳述包括以下實施方案其中 兩個序列的全部彼此雜交或結合，以及其中一個或兩個序列的僅一部分與完整的另一個序 列或與另一個序列的一部分雜交或結合。
示例性的實施方案現在將提到多個非限制性的示例實施方案。要理解的是，這些實施方案無意限制 本發明的教導。相反，本發明的教導意在涵蓋替代、修改和等同方案，本領域技術人員將意 識到這一點。圖1是用于擴增樣品的靶核酸序列的方法的一個實施方案的流程圖，所述樣品含 有(或懷疑含有)至少一種核酸擴增抑制因子。在某些實施方案中，這涉及提供包含至少 一種靶核酸序列和核酸擴增抑制因子的樣品10。接著，將至少一種高穩定性引物與靶核酸 序列混合20。高穩定性引物可以包含至少一種高穩定性核酸類似物。在此之后，對樣品實 施擴增反應30。本領域技術人員將認識到，人們不需要添加或肯定地知曉擴增抑制因子存 在于樣品中。如上所示，樣品可以為包含或推測包含目標核酸(靶核酸序列)或其自身為包含 或推測包含目標靶核酸序列的核酸的任何物質。在某些實施方案中，所述樣品包含核酸 (基因組DNA、cDNA、RNA)、細胞、生物體、組織、流體或包括但不限于以下的物質例如血漿、 血清、腦髓液、淋巴液、滑液、尿液、淚液、糞便，皮膚呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物， 唾液、血細胞、腫瘤、器官、組織、體外細胞培養成分的樣品、天然分離物(例如飲用水、海 水、固體材料)、微生物標本以及已用核酸示蹤分子“標記”的對象或標本，或其任意組合。包含靶核酸序列的樣品可以包含來自任何來源的生物材料。所述樣品可以由廣泛 來源中的任一種提供，且不需要直接由核酸的原始生物來源提供。在某些實施方案中，樣品 可以來自據信或推定被抑制核酸擴增的組分污染的位置。在某些實施方案中，包含靶核酸 序列的樣品可以為得自例如犯罪現場或含有人或動物殘留物的位置(例如考古場所或事 故地點)的生物材料。在某些實施方案中，由樣品提取核酸。參見例如Butler，ForensicDNA Typing,在28-32頁。在某些實施方案中，包括核酸在內的樣品可被降解或以少量存在。 在某些實施方案中，所述樣品可以包含至少來自個體的靶核酸序列。在某些實施方案中，樣品的位置可以為(或在一個點可能已經為)室內環境。室內 環境例如可以在居民住地、房屋、公寓、住宅單元、旅館、汽車旅館、政府辦公室、雜貨店、便 利店、辦公室、辦公樓、醫院、診所、教堂、飯館、大型購物中心、學校、學院、大學、宿舍、監獄、 拘留所、車庫或圖書館之內。在某些實施方案中，樣品可以來自交通工具之內，例如小汽車、 飛機、火車、公共汽車、運貨車、救護車、警車、消防車或出租車。在其它實施方案中，樣品可 以來自戶外環境。戶外環境可以為例如公園、庭院、森林、樹林、街道、高速公路、校園、大學 校園、辦公室復合地面、營地、跑道、登山道、廣場或停車場。在某些實施方案中，樣品可以來 自一片水域，例如湖、池塘、海洋、河流、小溪、濕地、水池或浴盆。本領域技術人員將認識到， 樣品可以直接接觸任一種以上位置以及其它位置的多個表面。 在某些實施方案中，樣品可包括至少一部分衣服，例如牛仔褲、褲子、毛線衫、襯 衫、內衣、裙子、女外套、圍巾、運動鞋、鞋、靴子、制服、手套、連指手套、短襪、長襪、夾克或外 套。在某些實施方案中，樣品可包括至少一部分附屬物，例如眼鏡、珠寶、手袋、假發或錢包。 在某些實施方案中，樣品可包括至少一部分家具。所述家具可以為例如桌子、椅子、車輛座 椅、床、嬰兒床、床頭板、凳子、計算器、廚房用具或燈。在某些實施方案中，樣品可包括纖維。 纖維可包括例如粗斜紋棉布、帆布、絲綢、棉布、人造纖維、毛織品、毛皮、皮革、絨面革、塑料 或合成纖維。在某些實施方案中，樣品可包括紙、家具、木材、竹子、塑料、金屬、玻璃、陶瓷、 石膏或涂料。在某些實施方案中，樣品可包括至少一部分室內裝飾品、浴簾、窗簾、遮光物 (shade)、百葉窗(blind)、地氈、地毯、床單、枕套、床罩或毛毯。本領域技術人員將認識到， 樣品可以包括的以上物質還可以被表征為靶核酸序列或樣品在其上存留一定時間的位置。 本領域技術人員將認識到，樣品或靶核酸序列可以直接接觸以上物質。在某些實施方案中，樣品包含(或推定包含)核酸和核酸擴增抑制因子。核酸包 含靶核酸序列。在某些實施方案中，靶核酸序列可以包含核酸、核酸類似物、多核苷酸類似 物和寡核苷酸類似物。在某些實施方案中，靶核酸序列可以包含天然DNA。在某些實施方案 中，靶核酸序列可以包含至少一個短串聯重復序列(STR)。用于本發明的靶核酸序列可來源于任何活的或曾經是活的生物體，包括但不限于 原核生物、真核生物、植物、動物和病毒。靶核酸序列可以起源于細胞核，例如基因組DNA，或 者可以為核外核酸，例如質粒、線粒體核酸、多種RNA等。如果靶核酸為RNA，則靶核酸序列 可以首先被逆轉錄為cDNA。此外，靶核酸序列可以雙鏈形式或單鏈形式存在。核酸擴增抑制因子可以為例如PCR抑制因子或能夠損傷核酸的化合物或材料。實 例包括但不限于腐殖酸、膽鹽、其它鹽、復合多糖、膠原、亞鐵血紅素、黑色素、真黑素、肌紅 蛋白、多糖、蛋白酶、鈣離子、尿素、血色素、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G、靛青染料、血色素、棕黃 酸、二價陽離子、螯合分子、酶、蛋白、復合多糖、EDTA、EGTA、DNA酶和膠原。在某些實施方案中，核酸擴增抑制因子可以為樣品中的污染物。在某些實施方案 中，核酸擴增抑制因子可以處于環境中。樣品中可以存在一種或多種核酸擴增抑制因子。在 某些實施方案中，樣品包含至少一種核酸擴增抑制因子。在某些實施方案中，樣品包含至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 種核酸擴增抑制因子。在某些實施方案中，核酸擴增抑制因子可以為可能并不總是用作抑制因子但能夠在某些情況下(例如于某些濃度)抑制核酸擴增的物質。例如，諸如MgCl2的鹽在某些濃 度不能抑制核酸擴增，但其于較高濃度可以用作抑制因子。本領域技術人員將認識到，在這 些情況下，所述物質在實際核酸擴增條件下如果以足以至少部分抑制擴增的水平存在，則 將僅被認為是“核酸抑制因子”。在以下的實施例章節提供測定樣品中的核酸擴增抑制因子 的存在情況的方法。在某些實施方案中，可以鑒定樣品中的核酸抑制因子。在其它實施方 案中，不需要鑒定樣品中的核酸抑制因子。在某些實施方案中，核酸抑制因子僅用作抑制因 子或者根本不具有功能(由此排除以上討論的組分，如MgCl2)。在某些實施方案中，核酸擴 增抑制因子是環境條件，例如溫度。在某些實施方案中，條件(例如溫度)被排除了作為核 酸擴增抑制因子的可能性。
在某些實施方案中，實施目前公開的一些技術的人士決定樣品所處的其中一個位 置提示擴增抑制因子的可能性。在作出此決定后，他們隨后應用所公開方法的其余部分，該 部分涉及高穩定性引物。在某些實施方案中，所述方法可以包含至少一種高穩定性引物。在其它實施方案 中，所述方法可以包含至少兩種高穩定性引物。在某些實施方案中，所述方法可以包含至少 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 種或更多種以上的高穩定性引物，每 種高穩定性引物均具有不同的序列，并擴增不同的基因座。在某些實施方案中，高穩定性引物包含至少一種高穩定性核酸類似物。在某些實 施方案中，高穩定性引物包含至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個或更多的高穩定性核酸類似物。在某些實施方案中，高穩定性核酸類似物為PNA、LNA、 2' -0-甲基核酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯鍵的核酸或其任意 組合。在某些實施方案中，高穩定性引物中至少的核酸為核酸類似物，例如高穩定性 引物中 1-5 %,5-10 %、10-15 %、15-20 20-25 25-30 30-35 35-40 40-50 %、 50-60%,60-70%,70-80%,80-90%,90-100%的核酸為核酸類似物。在某些實施方案中， 核酸類似物位于引物的5'末端。在某些實施方案中，核酸類似物位于引物的3'末端。在 某些實施方案中，核酸類似物位于引物的中心。在某些實施方案中，核酸類似物均勻地分布 于整個引物中。在某些實施方案中，核酸類似物在序列中彼此相鄰。在某些實施方案中，核 酸類似物被天然核酸分隔。在某些實施方案中，在單個引物中使用不同類型的核酸類似物 (例如LNA和PNA)。在某些實施方案中，所有的核酸類似物都是相同類型，但不必是相同核 酸(例如A與G類似物形式)。在某些實施方案中，多種高穩定性引物使用不同的核酸類似 物。在某些實施方案中，在單個反應中使用多個高穩定性引物，多個高穩定性引物盡管結合 相同的靶核酸序列，但包含不同的核酸類似物。在某些實施方案中，結合能力的這種重疊可 以抵消多種不同PCR抑制因子的存在。在某些實施方案中，高穩定性引物可以具有比第二種引物(例如標準穩定性引 物)高的熔點溫度，所述第二種引物與高穩定性引物幾乎相同，只是第二種引物由天然核 酸組成，由此沒有高穩定性核酸類似物。在某些實施方案中，高穩定性引物可以具有比第二 種引物高的熔點溫度，所述第二種引物與高穩定性引物幾乎相同，只是第二種引物在不同 的位置包含至少一種高穩定性核酸類似物。本領域技術人員將認識到，以上“高穩定性引物”和“標準穩定性引物”的比較常常 將高穩定性引物表征為具有至少一個被核酸類似物“置換的”核酸。這僅是為了簡化描述，不需要為了使引物被叫做“高穩定性引物”而在其首次使用前實際地物理“置換”核酸。也 就是說，如何設計或實際產生引物不改變其是否為高穩定性引物。本文描述的方法不需要 用核酸類似物置換標準穩定性引物的實際步驟。換句話說，可以在不涉及標準穩定性引物 的任何中間步驟的情況下制備高穩定性引物。本文使用的“置換”或“取代”表述僅是為了 便利以及與標準穩定性引物比較的目的。在某些實施方案中，高穩定性弓I物還包含遷移率調節物。遷移率調節物是本領域 已知的，在上文更詳細地描述。在某些實施方案中，遷移率調節物可以為聚環氧乙烷、聚乙 醇酸、聚乳酸、多肽、寡糖、聚氨酯、聚酰胺、聚磺酰胺、聚亞砜、聚膦酸酯或其嵌段共聚物。如 上所述，遷移率調節物允許每種引物的遷移率被任意確定，與寡核苷酸的長度或序列無關。高穩定性引物可以與靶核酸序列特異性雜交。在某些實施方案中，高穩定性引物 以允許短串聯重復序列擴增的方式與靶核酸序列雜交。在某些實施方案中，標準穩定性引 物(高穩定性引物基于其或與其對等)可以來自STR特異性引物組(例如將結合或允許 STR擴增的引物或引物組)。在某些實施方案中，引物可以得自CODIS特異性引物組。在某 些實施方案中，所述引物可以為含琺瑯蛋白LNATM的寡核苷酸。 在某些實施方案中，可以用高穩定性引物擴增廣泛的核酸序列。在某些實施方案 中，可以擴增來自至少一個基因座的核酸序列。在某些實施方案中，可以擴增來自至少一個 STR基因座的核酸序列。在某些實施方案中，所述擴增可以擴增例如以下的基因座的核酸序 列琺瑯蛋白、THOU TPOX, CSF1P0、vWA、FGA、D3S1358、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、 D8S1179、D18S51、D21S11、D2S1338、D3S1539、D4S2368、D9S930、D10S1239、D14S118、 D14S548、D14S562、D16S490、D16S753、D17S1298、D17S1299、D19S253、D19S433、D20S481、 D22S683、HUMCSF1P0、HUMTPOX、HUMTHO1、HUMF13A01、HUMBFXI11、HUMLIPOL、HUMvffFA31 或其 任意組合。在某些實施方案中，擴增琺瑯蛋白序列。在某些實施方案中，以一個反應擴增1個以上的基因座。在某些實施方案中，共擴 增 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個或更多的基因座。在使用多 重共擴增的某些實施方案中，不是所有的引物對都包含高穩定性引物。在擴增后，可以通過本領域已知的眾多方法中的任一種分析、解析和/或表征PCR 反應的產物。例如，可以通過變性樣品并使用凝膠電泳或毛細管電泳方案分離來分析PCR 反應。該分析的結果隨后可使人們確定存在的STR序列的重復數。核酸擴增和雜交程序是本領域已知的。在某些實施方案中，擴增可以經PCR實現。 例如，在Applied Biosystems AmpF/STR SEfiler PCR擴增試劑盒用戶說明書中提 供了 PCR擴增方案，該說明書通過引用整體結合到本文中。圖2是用于擴增樣品中的靶核酸序列的方法的一些實施方案的流程圖，所述樣品 包含至少一種核酸擴增抑制因子。在某些實施方案中，這包括提供一種樣品，其中所述樣品 處于被認為被可抑制核酸擴增的組分污染的位置，其中所述樣品至少包含個體的靶核酸序 列 100。接著，使用至少一種高穩定性引物擴增個體的靶核酸序列，其中所述高穩定性引 物包含至少一種高穩定性核酸類似物，其中所述引物可以由至少一個基因座擴增序列，所 述基因座選自以下的至少一個CSF1P0、FGA、THOl、TPOX, vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、 D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433、D2S1338 或其某些組合，其中所述引物還包含遷移率調節物110。在此之后，表征擴增的靶核酸序列，由此鑒定擴增的靶核酸序列120。在某些實施方案中，通過確定在至少一個且優選一個以上的針對擴增產物的以上基因座中存在的STR 數量實現表征。圖3A是用于擴增樣品中的靶核酸序列的方法的一些實施方案的流程圖，所述樣 品包含至少一種核酸擴增抑制因子。在某些實施方案中，這包括提供含有靶核酸序列的樣 品，其中所述靶核酸序列包含可用于鑒定靶核酸序列來源(例如目標個體)的短串聯重復 序列200。接著，將至少一種高穩定性引物與靶核酸序列混合210。高穩定性引物包含至 少一種高穩定性核酸類似物，并以允許短串聯重復序列擴增的方式與靶核酸序列特異性雜 交。在此之后，對樣品實施擴增反應，由此通過高穩定性引物擴增靶核酸序列220。在某些 實施方案中，高穩定性核酸類似物的位置不在高穩定性引物的3'末端。在某些實施方案 中，高穩定性核酸類似物在高穩定性引物的3'末端不是最后一個核酸。在某些實施方案中，不需要存在乃至懷疑存在PCR抑制因子。在某些實施方案中， 無論何時要擴增法醫樣品使用高穩定性引物都可能是有用的。一個這樣的實施方案示于圖 3B。人們可以首先提供懷疑含有靶核酸序列的法醫樣品300。法醫樣品不需要由實施本發 明技術的人收集。在某些實施方案中，將所述樣品清潔至一定程度。在某些實施方案中，處 理法醫樣品，以便將靶核酸置于用于隨后擴增的溶液或緩沖液中。在某些實施方案中，處理 樣品，以便由樣品中可能存在的細胞或細胞組分中釋放靶核酸。本領域技術人員將認識到， 盡管可能需要某些收集和/或純化，但樣品不一定是100%沒有污染物或PCR抑制因子。在 某些實施方案中，留下PCR抑制因子與靶核酸序列混合。在此之后，人們接著可以將至少一種高穩定性引物與靶核酸序列混合，其中高穩 定性引物以允許靶核酸序列擴增的方式與靶核酸序列特異性雜交，如在步驟310中所示。 在此之后，人們可以實施擴增步驟，以通過高穩定性引物擴增靶核酸序列，如在步驟320 中所示。本領域技術人員將認識到，有多種可以使用的擴增技術，例如PCR、定量PCR或 TAQMAN PCR。最后任選地，人們可以表征擴增的靶核酸序列，然后將該特征與個體 的(例如嫌疑犯)譜系比較，如步驟330所示。在其中短串聯重復序列(STR)被擴增和表 征的實施方案中，可以將樣品中的STR的多個特征與個體的多個STR比較，以確定是否存在 匹配。本領域技術人員將認識到，在某些實施方案中，本文描述的關于其它實施方案的其它 選擇也可應用于該方法。本領域技術人員將認識到，法醫樣品可以包含眾多的不同物質，例如唾液、血液、 陰道液體、精液、血漿、血清、腦髓液、淋巴液、滑液、尿液、淚液和糞便。在某些實施方案中， 法醫樣品包含選自以下器官的外分泌物皮膚、嘴、肺、鼻、眼、耳、臍、消化道、泌尿生殖道及 其任意組合。在某些實施方案中，樣品包括來自動物的靶核酸序列。在某些實施方案中，所 述動物為人。在某些實施方案中，法醫樣品是可用于解決法制體系感興趣的問題的樣品；但是， 其不一定在所有的實施方案中都被限于此。例如，在某些實施方案中，法醫樣品是某些人期 望鑒定或表征的樣品。鑒定或表征可針對已知或未知的來源(例如候選目標個體)。在某 些實施方案中，法醫樣品是人們期望鑒定來源的樣品。在某些實施方案中，STR可以包含在靶核酸序列中；然而，不需要在所有的實施方案中都存在STR。例如，在某些實施方案中，可用于法醫分析的任何核酸序列都可以是靶核 酸序列。在某些實施方案中，靶核酸序列允許人們確定在一個位置和個體發現的物質(例 如組織樣品、血液等)的來源。在某些實施方案中，其允許人們對作為所述物質的可能來源 中排除某一個體。在某些實施方案中，靶核酸序列允許人們確定靶核酸序列的初始來源是男性還是女性(例如其為性別特異性標記)。這可以多種方式實現，例如通過確定所述個體是具有兩 個X染色體還是具有X和Y染色體。在某些實施方案中，這種區別可通過觀察與X或Y染 色體相關的特異性序列差異來確定。在某些實施方案中，這可通過檢驗靶核酸序列在一個 染色體上比在另一個染色體上長來實現。例如，通過分析(和初始擴增)琺瑯蛋白(對于 X染色體，其在內含子1中具有6個堿基的缺失)，人們可以確定所述樣品是僅包含X染色 體還是包含X和Y染色體這二者。因此，在某些實施方案中，所述方法可用于擴增性別特異 性標記。在某些實施方案中，基因座的初始序列、標準穩定性引物的初始序列(其可容 易地如本文所述修飾)及其擴增方法和隨后的結果分析可見于美國專利號7，008，771、 6，767，703,6, 479，235和6，221，598，所述專利通過引用整體結合到本文中。在某些實施方案中，由擴增和分析或表征樣品中的靶核酸序列獲得的信息可用于 多種用途，例如遺傳作圖、連鎖分析、臨床診斷或鑒定試驗。在某些實施方案中，所述信息可 用于鑒別核酸的來源或縮窄核酸的可能來源。在某些這樣的實施方案中，所述信息可用于 例如法醫學鑒定、生父鑒定試驗、DNA譜分析和相關應用。可以對含有核酸的任何樣品，例如骨、毛發、血液、組織等，實施個人身分鑒別測 試。可以由樣品提取DNA，然后用包含擴增一組微衛星的高穩定性引物的引物組在抑制因子 存在下擴增DNA，從而產生一組擴增的片段。在法醫檢驗中，例如，可以將樣品的微衛星擴 增模式與推定受害者的已知樣品(推測的匹配來源)比較，或者可以與來源于推定受害者 的家族成員(例如母親和父親)的擴增微衛星的模式比較，其中使用高穩定性引物擴增同 一組微衛星。微衛星擴增模式可用于證實或排除受害者的身份。在生父鑒定試驗中，例如， 樣品一般來源于兒童，與推定父親的微衛星模式進行比較，并可以包含與兒童母親的微衛 星模式匹配。微衛星擴增模式可用于證實或排除父親的身份。以下名單可以包含G+C含量 為 50%或以下的微衛星例如 D3S1358 ；vffA ；D16S539 ；D8S1179 ；D21S11 ；D18S51 ；D19S433 ； THOl ；FGA ；D7S820 ；D13S317 ；D5S818 ；CSFlPO ；TPOX ；次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶；腸脂肪 酸結合蛋白；識別抗原/表面抗原；CFS-I受體的c-fms原癌基因；酪氨酸羥化酶；胰腺磷脂 酶A-2 ；凝血因子XIII ；細胞色素芳香化酶P-450 ；脂蛋白脂肪酶；c-fes/fps原癌基因；和 未知的片段。所述產物可通過例如毛細管電泳配合GeneScan 310分析檢驗。在某些實施方案中，提供用于PCR反應的試劑盒。所述試劑盒包括三磷酸脫氧核 苷酸；含有至少一種高穩定性核酸類似物的高穩定性引物；和DNA聚合酶。上文詳細描述了適于所述試劑盒的高穩定性引物。在某些實施方案中，所述試劑 盒可以包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 種或更多的高穩定 性引物。在某些實施方案中，可以存在至少兩種引物作為引物混合物。在某些實施方案中， 引物混合物包含約δρπιο /μ L至50ρπιΟ1/μ 1的每種引物。在某些實施方案中，引物混合 物包含約10、15、20、25或30pmol/yL的每種引物。在某些實施方案中，所述試劑盒包含STR-特異性引物組的至少一種引物。在某些實施方案中，所述試劑盒包含STR-特異性引物組。在某些實施方案中，所述試劑盒還含有熒光標記的引物。在某些實施方案中，所述試劑盒進一步包含裝有等位基因分型標準物的容器，所 述等位基因分型標準物對應于適于同短串聯重復序列分析比較的大小。等位基因分型標準 物可用于分析STR。在某些實施方案中，所述試劑盒可以包含等位基因分型標準物混合物。 在某些實施方案中，等位基因分型標準物混合物可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16個或更多個以上的STR基因座的等位基因分型標準物。在某些實施方案中，所 述等位基因分型標準物可以為熒光標記的等位基因分型標準物。在某些實施方案中，所述試劑盒進一步包含DNA聚合酶。DNA聚合酶可以為 熱穩定的。在本發明方法的某些實施方案中，擴增包括使所述靶核酸與具有聚合酶活 性的酶接觸。例如，具有聚合酶活性的酶可以選自以下的至少一種來自水生棲熱菌 (Thermusaquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、其它棲熱菌(Thermus)屬、芽 ？包桿菌屬、熱球菌(Thermococcus)屬、棲熱袍菌(Thermotoga)屬和火球菌(Pyrococcus) 屬的DNA聚合酶。例如，合適的聚合酶包括AmpliTaqGold DNA聚合酶；AmpliTaq DNA 聚合酶；AmpliTaq DNA聚合酶；Stoffel片段；rTth DNA聚合酶；rTth DNA聚合酶XL ； 來自脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的Bst DNA聚合酶大片段；來自 Thermococcus litoralis 的 Vent 禾口 Vent Exo ；來自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima) 的Tma ；來自火球菌(Pyrococcus)的DeepVent禾口 De印Vent Exo-以及Pfu ；及其突變體、 變體和衍生物。在某些實施方案中，所述試劑盒進一步包含MgCl2。在某些實施方案中，試劑盒所 提供的MgCl2可以10mM、15mM、20mM或25mM的濃度存在。在某些實施方案中，所述試劑盒 包含疊氮化鈉。在某些實施方案中，所述試劑盒包含含有MgCl2& 10X緩沖溶液。在某些 實施方案中，所述試劑盒包含BSA。在某些實施方案中，所述試劑盒包含dNTP混合物。在某 些實施方案中，dNTP混合物可以包含25mM的每種核苷酸。在本發明的某些實施方案中，使 用至少0. 5mM的每種dNTP。在其它實施方案中，使用至少ImM dNTP。在某些實施方案中，所述試劑盒進一步包含至少一種對照樣品。在某些實施方案 中，所述試劑盒可以包含陽性對照、陰性對照、提取空白對照或其任意組合。在某些實施方案中，所述試劑盒進一步包含遷移率調節物。所述遷移率調節物可 以為聚環氧乙烷、聚乙醇酸、聚乳酸、多肽、寡糖、聚氨酯、聚酰胺、聚磺酰胺、聚亞砜、聚膦酸 酯及其嵌段共聚物。在某些實施方案中，所述試劑盒進一步包含說明書。在某些實施方案中，所述說明 書可以描述如何鑒定樣品中一種或多種靶核酸的存在情況。在某些實施方案中，所述說明 書可以描述如何鑒別樣品中STR基因座的存在情況。在某些實施方案中，所述說明書可以 描述如何鑒別樣品中C0DIS基因座的存在情況。標準穩定件引物和高穩定件弓I物的詵擇本領域技術人員將認識到，一種確定本文所述的高穩定性引物的可能序列的方法 是以允許擴增目標基因座(例如包含STR的基因座)的標準穩定性引物開始，并如本文所 述對其置換(permutation)。在許多實施方案中，這可容易地如下實現采用在STR分析、 更具體地說是C0DIS分析中使用的已知的或公開的引物序列，并使用它們作為初始啟動模
21板。或者，可以通過采用來自任一種目前公開的基因座(或其它STR相關的目標基因座) 的引物大小的核酸序列，并測試每個引物大小的部分，確定其它的高穩定性引物序列。可將 多種不同的核酸類似物插入候選的高穩定性引物的每個位置中，并測試所產生引物的Tm。 那些Tm增加的候選高穩定性引物將是高穩定性引物。圍繞著每個基因座的每個序列都可 用于產生眾多高穩定性引物。用于目前公開的STR和C0DIS基因座的所有可能的標準穩定 性引物均可以容易地由本領域技術人員確定(例如以基因座中的第一個核酸開始，包含適 宜長度的引物的一部分核酸(例如5-30個核酸)，以產生第一個標準穩定性引物。人們可 以將一個核酸位置沿著序列向下移動到一個新的核酸位置(其可以與先前的引物序列重 疊)，人們希望得到多少種引物就重復該過程多少次。在某些實施方案中，應小心選擇在多重反應中使用的引物序列。不適宜的引物選 擇可能產生幾種不需要的作用，例如沒有擴增、在多個位點擴增、引物二聚體形成、來自不 同基因座的引物序列的不需要的相互作用、產生與另一個基因座的等位基因重疊的一個基 因座的等位基因，或者不同的基因座需要在多重反應中不相容的擴增條件或方案。可以按 照以下的選擇方法選擇標準穩定性引物。在某些實施方案中，如下開發和選擇用于多重系統的引物使用反復的選擇引物 序列的過程，將用于共擴增選定基因座的引物混合，共擴增基因座，然后分離和檢測擴增產 物。最初，該過程經常以不平衡的方式產生擴增的等位基因(即某些基因座的產率高于其 它基因座)，且還可以產生不代表等位基因自身的擴增產物。為由多重系統消除這樣的額外片段，將全部組的各個引物與相同或其它基因座的 引物一起使用，以鑒定哪種引物有助于額外片段的擴增。一旦鑒定出產生一種或多種片段 的兩種引物，就以單獨的一對或以多重系統(或多重系統的亞組)修飾和再檢驗一種或兩 種引物。重復該過程，直至產物評價在多重系統中產生擴增的等位基因，且無或具有可接受 水平的額外擴增產物。有時候，可通過標記引物對中的相反引物消除額外的擴增產物。這種改變揭示了 檢測步驟中相反引物的產物。這種新標記的引物可以比先前標記的引物高的保真度擴增真 正的等位基因，產生的真正的等位基因在總擴增產物中的比例更大。引物濃度的測定可以在最終的引物序列選擇之前或之后進行，但優選在該選擇之 后進行。一般來說，增加任何具體基因座的引物濃度增加了針對該基因座產生的產物量。但 是，這也是一個重復過程，因為針對一個基因座增加得率可能降低一個或多個其它基因座 的得率。而且，引物可以相互作用，直接影響其它基因座的得率。引物濃度的線性增加不一 定使對應基因座的產物得率產生線性增加。基因座對基因座的平衡也可能受到擴增方案的眾多參數的影響，例如使用的模板 量、擴增循環次數、熱循環方案的退火溫度以及在循環過程結束時包含或排除額外的延伸 步驟。一般不能在所有等位基因和基因座之間實現絕對均衡的平衡，也不需要產生有用的 等位基因信息。多重系統開發的過程在另一個意義上也可能是重復過程。也就是說，首先有可能 針對少量基因座開發多重系統，該系統沒有或幾乎沒有來自擴增的額外片段。該系統的引 物可以與一個或多個其它基因座的引物組合。這種擴增的引物組合可以由擴增產生或不產 生額外的片段。從而可以導入和評價新的引物。
重復上述的一次或多次反復選擇操作，直至鑒定出完整的引物組，其可用于共擴 增本文所述的對于共擴增選定的基因座。要理解的是，可開發許多不同的引物組，以擴增特 定的基因座組。可以使用本領域技術人員已知的用于寡核苷酸合成的任何標準程序進行標準雜 交引物的合成。本領域技術人員將認識到，可以修改以上用于測定標準穩定性引物的方法，以通 過使用包含高穩定性核酸類似物的引物，并以相似的方式在它們之間選擇，確定高穩定性 引物。當然，也可以檢驗候選的高穩定性引物的最終Tm。DNA樣品的制備可以使用與DNA擴增相適的任何DNA制備方法，制備本發明方法使用的樣品。許 多這樣的方法是本領域技術人員已知的。實例包括但不限于通過苯酚提取(Sambrook， J.等人(1989)MolecularCloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y.，9. 14-9. 19 頁)進行 DNA 純化，以及通過鹽 沉淀(Miller, S.等人(1988)Nucl. Acids Res. 16 1215)或 chelex(Walsh 等人，(1991) BioTechniques 10:506 513，Comey 等人，(1994) Forensic Sci. 39 1254)進行部分純 化，以及使用未處理的血液釋放未純化的物質(Burckhardt，J. (1994)PCR Methods and Applications 3 =239243,McCabe,Edward R. B. ， (1991)PCR Methods and Applications 1 99106, Nordvag,Bjorn-Yngvar (1992)BioTechniques 12 =4490-492 M)。當要使用本發明的方法分析的至少一種樣品包含人基因組DNA時，所述DNA可以 由選自以下的組織制備血液、精液、陰道細胞、毛發、唾液、尿液、骨、口腔樣品、含有胎盤細 胞或胎兒細胞的羊水、絨膜絨毛及以上列出的任何組織的混合物。任選地，可以在用于本發明方法之前使用本領域技術人員已知的任何標準DNA定 量檢測DNA濃度。在這樣的情況下，可以通過如Sambrook，J.等人(1989)，出處同上，附 錄E. 5所述的分光光度檢測法，或使用檢測技術如Brunk C. F.等人(1979)，Anal Biochem 92 :497500所述的用熒光法測定DNA濃度。可以如Waye，J. S.等人(1991)“Sensitive and specific quantification of human genomic deoxyribonucleicacid(DNA)in forensic science specimens :casework examples, ”J. Forensic Sci. , 36 :11981203 所述，通過比較 DNA標準品與人特異性探針的雜交量，檢測DNA濃度。在擴增反應中使用太多的模板DNA可 以產生假象，其表現為不代表真正等位基因的額外條帶。在某些實施方案中，可以使用定量 技術如TA0MAN pCR。在某些實施方案中，可以使用任一種上文討論的擴增技術。在 某些實施方案中，使用實時PCR分析。在某些實施方案中，使用SYBR Green染料。在某些 實施方案中，使用5'核酸酶方法。本領域技術人員將認識到，在某些實施方案中，使用高穩定性引物可以允許去除 以上的一些步驟，因為樣品的純化可能不太關鍵。在多重擴增中的DNA擴增制備出樣品后，就以多重擴增步驟共擴增目標基因座。可以使用眾多不同的擴 增方法中的任一種擴增基因座，包括但不限于聚合酶鏈式反應(PCR) (Saiki, R.K.等人 (1985)，Science 230 13501354)、基于轉錄的擴增(Kwoh, D. Y.和 Kwoh，T.J. (1990)， AmericanBiotechnology Laboratory, October,1990)禾口 鏈置換擴 ±曾(SDA)(Walker, G.T.等人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. A. 89 =392396) 在某些實施方案中，使用對所 述組中的每個基因座特異性的高穩定性引物對對DNA樣品進行PCR擴增。
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在某些實施方案中，針對每個基因座的至少一種高穩定性引物可以共價連接染料 標記，更優選地連接熒光染料標記。可以針對多重擴增反應選擇高穩定性引物和與其連接 的染料，使得在優選通過凝膠電泳或毛細管電泳分離等位基因時，用一種顏色標記的每個 基因座的引物擴增的等位基因與其中使用相同顏色標記的高穩定性引物共擴增的組中的 另一基因座的等位基因不重疊。在某些實施方案中，針對在多重反應中共擴增的每個基因座的至少一種高穩定性 引物在用于所述反應前用熒光標記來標記。適于連接用于本發明的引物的熒光標記可商 購。參見例如PEBiosystems和Molecular Probes的熒光素和羧基-四甲基羅丹明標記以 及它們的化學衍生物。在某些實施方案中，使用至少3個不同標記來標記在多重擴增反應 中使用的不同高穩定性引物。當包含大小標記來評價多重反應時，用于制備大小標記的引 物可以用與用于擴增反應中的目標基因座的引物不同的標記來標記。在某些實施方案中，所用的基因座特異性高穩定性引物的序列包括眾多核苷酸， 其在用于雜交的條件下，足以與要擴增的基因座的等位基因雜交，并基本上沒有其它基因 座的等位基因的擴增。參考授予Simons的美國專利號5，192，659，該專利關于基因座特異 性引物的更詳細描述的教導通過引用結合到本文中。DNA片段的分離和檢測一旦由多重擴增步驟產生一組擴增的等位基因，就評價擴增的等位基因。該方法 的評價步驟可以通過眾多不同方法中的任一種來完成，其中一些方法在下文描述。電泳可用于分離多重擴增反應的產物，毛細管電泳(參見例如Buel，Eric等人 (1998), Journal of Forensic Sciences ;43 (1) 164-170 頁)或變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (參見例如 Sambrook，J.等人(1989)，載于 Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Press，13. 45-13. 57 頁)也可以。適用于所述方法 的評價步驟的凝膠制備以及電泳步驟和條件在以下的實施例中闡述。以變性聚丙烯酰胺凝 膠電泳和毛細管電泳分離DNA片段主要基于片段大小進行，但可以通過使用遷移率調節物 來調節。一旦分離出擴增的等位基因，隨后就可以顯現和分析在凝膠或毛細管中的等位基 因和任何其它DNA (例如DNA大小標記或等位基因分型標準物)。在凝膠中顯現DNA可以使 用眾多技術中的任一種來完成，包括銀染或報告體，如放射性同位素、熒光劑、化學發光劑 和與可檢測物質組合的酶。在某些實施方案中，檢測含有13個或13個以上的基因座的多 重體的方法包括熒光(參見例如Schumm，J. ff.等人，載于Proceedings from the Eighth International Symposium onHuman Identification,(由 Promega Corporation ^ 1998 年出版)，78-84頁；Buel，Eric等人(1998)，出處同上)，其中在多重反應中針對每個基因 座的高穩定性引物后接使用熒光檢測器檢測標記產物。上文提及的描述顯現等位基因的先 有技術方法的參考文獻通過引用結合到本文中。可以通過比較大小標準如DNA標記或基因座特異性等位基因分型標準物測定存 在于DNA樣品中的等位基因，以確定在樣品中的每個基因座存在的等位基因。在某些實 施方案中，用于評價含有兩個或多個多態性STR基因座的多重擴增的標記的大小包括針對 所評價的每個基因座的等位基因分型標準物的組合。參見例如Puers，Christoph等人， (1993) Am J. Hum Genet. 53 :953958，Puers，Christoph，等人，(1994) Genomics 23 :260264。 另參見美國專利號5，599，666 ；5，674，686 ；和5，783，406關于適用于檢測STR基因座的等位基因分型標準物的描述，以及其中公開的分型標準物構建方法。在構建針對各個基因座的等位基因分型標準物之后，可以混合這些等位基因分型 標準物，并加載進行凝膠電泳，同時進行擴增樣品的加載。每種等位基因分型標準物與樣品 中對應基因座的等位基因共遷移。可以使用內部泳道標準品評價本發明的多重反應產物，所述標準品是特化類型的 大小標記，配置用于在聚丙烯酰胺凝膠的相同泳道中或相同的毛細管中運行。內部泳道標 準品可以包括一系列已知長度的片段。更優選地用熒光染料標記內部泳道標準品，所述染 料與擴增反應中的其它染料可區分。在構建內部泳道標準品之后，該標準品還可以與擴增的樣品或等位基因分型標準 物混合，并加載進行電泳，用于比較在凝膠電泳的不同泳道或毛細管電泳的不同毛細管中 的遷移。內部泳道標準品的遷移變化表明分離介質性能的變化。這種差異的定量和與等位 基因分型標準物的關聯允許修正未知樣品中的等位基因的大小測定值。仵詵的檢測摶術 熒光檢測在某些實施方案中，熒光檢測用于評價混合物中的擴增的等位基因，其使用一種 或多種高穩定性引物通過多重擴增反應產生。以下是該檢測方法可如何實施的簡要概述。隨著自動化熒光成像的出現，可以實現更快地檢測和分析多重擴增產物。對于熒 光分析，可以在每個基因座的擴增中包含一種熒光標記的高穩定性引物。適用的熒光標 記的高穩定性引物可以包括熒光素標記的(FL-)、羧基-四甲基羅丹明標記的(TMR-)和 5，6_羧基羅丹明6G-標記的(R6G)高穩定性引物。優選通過平板凝膠電泳或毛細管電泳 實現對使用這類標記的高穩定性引物產生的擴增片段的分離。產生的分離片段可以使用 熒光檢測設備如ABI PRISM 310遺傳分析儀、ABI PRISM 377DNA測序儀(Applied Biosystems Division, PerkinElmer, Foster City, Calif.)或 Hitachi FMBIO II 焚光 掃描儀(HitachiSoftware Engineering America, Ltd. South San Francisco, Calif.)來 分析。在某些實施方案中，用于多重擴增反應的每對高穩定性引物中的一個或兩個具有 與其連接的熒光標記，結果，由擴增反應產生的擴增等位基因被熒光標記。在該實施方案 中，擴增的等位基因隨后通過毛細管電泳分離，分離的等位基因使用熒光成像分析儀顯現 和分析。熒光檢測相對于放射性標記及檢測方法可能是有利的，因為熒光檢測不需要使用 放射性材料，且沒有與使用這些材料伴隨的所有法規性和安全性問題。相對于其它非放射性檢測方法如銀染，也可以使用采用標記的高穩定性引物的熒 光檢測，因為熒光檢測方法一般顯現出少于銀染的擴增假象。較少量的假象部分歸因于以 下事實熒光檢測僅檢測到連接標記的DNA的擴增條帶，而由多重擴增反應產生的DNA的每 個擴增等位基因的兩條鏈均使用銀染檢測方法來染色和檢測。
實施例依據以下實施例可進一步理解本發明教導的一些方面，所述實施例不應被解釋為 以任何方式限制本發明教導的范圍。實施例1本實施例示例了一種測試樣品中的PCR抑制因子的存在情況(或確定某種物質是
25否為抑制因子)的測定。如上所示，鑒定樣品中的抑制因子的存在情況是任選步驟。
在本實施例中，提供包含靶核酸序列和可能的PCR抑制因子的樣品。將其與用于 擴增靶核酸序列的一組標準穩定性引物混合。在單獨的容器中配制包含與樣品反應相同量 的靶核酸序列和引物組的對照溶液。對樣品和對照實施擴增反應。分析并比較樣品反應和 對照反應的擴增結果。在樣品反應中沒有PCR產物表明在樣品中存在抑制因子。備選地， 與對照反應中的PCR產物量相比在樣品反應中存在較少量的PCR產物表明樣品中存在抑制 因子。實施例2本實施例示例了測試含有高穩定性核酸類似物的高穩定性引物的測定。在本實施例中，提供僅包含天然核酸的引物(例如標準穩定性引物)。產生候選高 穩定性引物，其與標準穩定性引物具有相同序列，但使用對等的(例如其以相同選擇性堿 基配對)高穩定性核酸類似物代替至少一個天然核酸。檢驗測試引物的熔點溫度，并與標 準穩定性引物的熔點溫度相比較。較高的熔點指示更穩定的引物。如果候選高穩定性引物 的熔點高于標準穩定性引物的熔點，則這是候選高穩定性引物比標準穩定性引物更穩定的 指示。備選地，產生候選高穩定性引物，其與標準穩定性引物具有相同序列，但使用兩個 高穩定性核酸類似物代替兩個核酸。檢驗候選高穩定性引物的熔點溫度，并與標準穩定性 引物的熔點溫度相比較。如果候選高穩定性引物的熔點高于標準穩定性引物的熔點，則這 是候選高穩定性引物比標準穩定性引物更穩定的指示。備選地，產生候選高穩定性引物，其與標準穩定性引物具有相同序列，但使用三種 高穩定性核酸類似物代替三種核酸。檢驗候選高穩定性引物的熔點溫度，并與標準穩定性 引物的熔點溫度相比較。較高的熔點指示更穩定的引物。如果候選高穩定性引物的熔點高 于標準穩定性引物的熔點，則這是候選高穩定性引物比標準穩定性引物更穩定的指示。實 施例3 本實施例示例了含有PCR抑制因子的樣品中的靶核酸序列的擴增。提供包含靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。將靶核酸序列與含有高穩定性引物 的引物組混合。高穩定性引物包含高穩定性核酸類似物。對樣品(或至少包含靶核酸序 列)實施擴增反應，通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。即便在PCR抑制因子存在下，靶核 酸序列也以較高度的效率被擴增。備選地，提供包含靶核酸序列和2種或3種PCR抑制因子的樣品。將靶核酸序列 與含有高穩定性引物的引物組混合。高穩定性引物包含高穩定性核酸類似物。對樣品實施 擴增反應，通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。即便在PCR抑制因子存在下，靶核酸序列也 以較高度的效率被擴增。備選地，提供來自犯罪現場的樣品。所述樣品包含靶核酸序列和PCR抑制因子。將 靶核酸序列與含有高穩定性引物的引物組混合，所述高穩定性引物包含高穩定性核酸類似 物。對樣品實施擴增反應，通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。即便在PCR抑制因子存在 下，靶核酸序列也以較高度的效率被擴增。實施例4本實施例示例了含有PCR抑制因子的樣品中的靶核酸序列的擴增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。靶核酸序列與包含高穩定性引物的 引物組混合。所述引物組能夠擴增CODIS核酸序列或另一個含STR的基因座。高穩定性引物包含兩種或三種高穩定性核酸類似物。對樣品實施擴增反應，并通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。實施例5本實施例示例了含有PCR抑制因子的樣品中的靶核酸序列的擴增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。靶核酸序列與包含兩種(或三種) 高穩定性引物的引物組混合。每種引物包含高穩定性核酸類似物。對樣品實施擴增反應， 并通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。靶核酸序列將以比僅使用對等的標準穩定性引物的 情況高的程度擴增。實施例6本實施例示例了含有核酸和PCR抑制因子的樣品中的STR基因座的擴增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。將包含核酸和PCR抑制因子的樣品 與包含高穩定性引物的STR特異性引物組混合。對樣品實施擴增反應，并通過高穩定性引 物擴增STR基因座。實施例7本實施例示例了含有PCR抑制因子的樣品中的CODIS基因座的擴增。提供含有靶核酸序列和懷疑具有PCR抑制因子的樣品。將靶核酸序列與包含至少 一種高穩定性引物的CODIS特異性引物組混合。對樣品實施擴增反應，并通過高穩定性引 物擴增CODIS基因座。實施例8本實施例示例了在PCR 抑制因子存在下 D8S1179、D18S51、D21Sll、FGA、TH01、vWA
和琺瑯蛋白中的一個或多個基因座的擴增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。將包含靶核酸序列和PCR抑制因子 的樣品與包含對0851179、018551、021511、？6々、^01^14和琺瑯蛋白基因座中的每一種特 異性的至少一種高穩定性引物的引物組混合。對樣品實施擴增反應，并通過高穩定性引物 擴增目標基因座。實施例9本實施例示例了在PCR 抑制因子存在下 D8S1179、D18S51、D21Sll、FGA、TH01、vWA、 D2S1338、D3S1358、D16S539、D19S433、SE33和琺瑯蛋白中的一個或多個基因座的擴增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。將包含靶核酸序列和PCR抑制因 子的樣品與包含對 D8S1179、D18S51、D21Sll、FGA、TH01、vWA、D2S1338、D3S1358、D16S539、 D19S433、SE33和琺瑯蛋白基因座中的每一種特異性的至少一種高穩定性引物的引物組混 合。對樣品實施擴增反應，并通過高穩定性引物擴增目標基因座。實施例10本實施例示例7 D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P0、D3S1358、THOU D13S317、 D16S539、D2S1338、D19S433、vWA，TP0X、D18S51、D5S818 和 FGA 中的一個或多個基因座的擴
增ο提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。將包含靶核酸序列和PCR抑制因 子的樣品與包含對 D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P0、D3S1358、THOU D13S317、D16S539、 D2S1338、D19S433、vffA, TPOX, D18S51、D5S818和FGA基因座中的每一種特異性的至少一種 高穩定性引物的引物組混合。對樣品實施擴增反應，并通過高穩定性引物擴增目標基因座。 實施例11本實施例示例了Penta E、D18S51、D21S11、THOU D3S1358、FGA、TPOX, D8S1179、 vWA、琺瑯蛋白以及 Penta D、CSF1P0、D16S539、D7S820、D13S317 和 D5S818 中的一個或多個
基因座的擴增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。將包含靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品與包含對 Penta E、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358、FGA、TP0X、D8S1179、vWA、琺瑯蛋 白以及PentaD、CSF1P0、D16S539、D7S820、D13S317和D5S818基因座中的每一種特異性的
至少一種高穩定性引物的引物組混合。對樣品實施擴增反應，并通過高穩定性引物擴增目 標基因座。實施例12本實施例闡述了DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、 DYS437、DYS438和DYS439中的一個或多個基因座的擴增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。將包含靶核酸序列和PCR抑制因子 的樣品與包含對 DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、 DYS438和DYS439中的每一種特異性的至少一種高穩定性引物的引物組混合。對樣品實施 擴增反應，并通過高穩定性引物擴增目標基因座。實施例13本實施例闡述了人們可如何制備高穩定性引物的多個不同實施方案。本領域技術 人員將認識到，與以下的基因座相關的核酸序列是已知的TH01、TPOX、CSF1P0、vWA、FGA、 D3S1358、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、D8S1179、D18S51、D21S11、D2S1338、D3S1539、 D4S2368、D9S930、D10S1239、D14S118、D14S548、D14S562、D16S490、D16S753、D17S1298、 D17S1299、D19S253、D19S433、D20S481、D22S683、HUMCSF1P0、HUMTP0X、HUMTH01、HUMF13A01、 HUMBFXIII、HUMLIP0L、HUMvWFA31。人們選擇一個或多個核酸序列(來自以上的基因座)中 的一部分作為擴增引物的結合位點(任何序列均可滿足，只要其允許擴增相關STR)。核酸 部分將長得足以允許引物根據需要與其結合(例如為起引物作用，長5-30個核酸)。該部 分將用于產生標準穩定性引物(其將與以上選擇的初始序列雜交)。標準穩定性引物將是 選定部分的互補序列。然后產生與標準穩定性引物對等的候選高穩定性引物。除了在候選高穩定性引物 中存在一個或多個高穩定性核酸取代之外，候選的高穩定性引物與標準穩定性引物相同。 選擇高穩定性核酸取代，使得它們具有被置換核酸所具有的相同堿基配對選擇特性。這種 對等的置換可以繼續所期望的次數(以產生所期望數量的引物序列)。“置換”實際上不一 定是用一個核酸類似物物理置換一個天然核酸，而是可以合成新的引物，其除了核酸類似 物之外，與標準穩定性引物相同。一旦產生了一種或多種候選高穩定性引物，就可以測試其在擴增抑制因子存在下 的擴增能力。這可以如下實現加入已知量的初始靶核酸序列(一個上述基因座)，加入 已知量的抑制因子(例如腐殖酸、膽鹽、其它鹽、復合多糖、膠原、亞鐵血紅素、黑色素、真黑 素、肌紅蛋白、多糖、蛋白酶、鈣離子、尿素、血色素、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G、靛青染料、血色 素、棕黃酸、二價陽離子、螯合分子、酶、蛋白、復合多糖、EDTA、EGTA、DNA酶和膠原)，并加入 每種候選高穩定性引物。使用候選高穩定性引物的擴增量可以與使用標準穩定性引物時出 現的擴增量相比較。相比于標準穩定性引物表現出較高程度的擴增能力的那些候選引物是 高穩定性引物。在備選的實施方案中，高穩定性核酸類似物選自下列之一PNA、LNA、2' _0_甲基 核酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯鍵的核酸或其任意組合。已知此實施例、本領域技術人員的知識和本文公開的教導，本領域技術人員能夠 制備針對任一種上述基因座的任何部分的高穩定性引物。實施例14本實施例闡述了本領 域技術人員可如何鑒定擴增抑制因子。首先，技術人員獲得已知的靶核酸序列和針對該靶核酸序列的標準穩定性引物。技術人員將它們混合在用于標 準PCR反應的緩沖溶液中。技術人員將該溶液分為兩部分。對于第一部分，技術人員將候 選PCR抑制因子加入PCR反應。對第二部分沒有加入抑制因子。兩部分平行進行PCR擴增， 比較在每個部分中產生的產物量。如果第一部分產生的擴增產物較少，則候選PCR抑制因 子是PCR抑制因子。實施例15 本實施例闡述了人們可如何使用高穩定性引物鑒定目標個體。提供含有靶核酸序 列和PCR抑制因子的樣品。將樣品與包含對以下基因座中的至少5個特異性的至少一種高 穩定性引物的引物組混合D8S1179、D18S51、D21S11、FGA、THOl、vWA、D2S1338、D3S1358、 D16S539、D19S433、SE33和琺瑯蛋白。對樣品實施擴增反應，并通過高穩定性引物擴增目標
基因座。然后檢驗擴增的序列，使得可以表征以上基因座的短串聯重復序列(例如鑒定每 個基因座存在多少短串聯重復序列)。然后將這些結果與目標個體的STR特征對比。如果 STR相同，則目標個體被認為與靶核酸序列匹配。實施例16本實施例闡述了一種通過使用高穩定性引物擴增靶核酸序列的方法。人們首先提 供懷疑含有靶核酸序列的法醫樣品。處理法醫樣品，以便將靶核酸置于用于隨后的擴增的 緩沖液中，并使得可以由可在樣品中存在的細胞或細胞組分釋放靶核酸。在此之后，人們接著將至少一種高穩定性引物與靶核酸序列混合。高穩定性 引物以允許靶核酸序列擴增的方式與靶核酸序列特異性雜交。在此之后，人們通過 TAQMAN PCR擴增靶核酸序列，由此擴增靶核酸序列。任選地，人們可以表征擴增的靶核酸序列，然后將該特征與個體譜系對比，以確定 所述個體一般而言與靶核酸序列和樣品是否匹配。實施例17本實施例通過用含LNA的寡核苷酸置換既有的寡核苷酸示例了高穩定性引物的 增強性能。本實施例還提供關于以下情況的一般性指引本領域技術人員可如何檢驗針對 多種CODIS相關序列的多種引物，并確定在多種引物中高穩定性核酸類似物應處于何處和 有多少。制備多種含琺瑯蛋白-LNA的寡核苷酸。每種引物包含至少1個LNA，有些包含2 個 LNA。在有和沒有腐殖酸(PCR抑制因子)的受控條件下以40ng/ μ L測試琺瑯蛋白-LNA 引物的擴增能力。結果與不包含LNA的對照序列的擴增能力對比。在用對照引物擴增Ing 男性DNA的過程中，以40ng/ μ L獲得對PCR的部分抑制。相反，含有一些LNA的引物表現 出顯著較少的抑制。而且，一些琺瑯蛋白LNA-寡核苷酸于eOng/μ L克服了腐殖酸抑制(圖4)。相比 之下，對照寡核苷酸在相同條件下不能擴增。實施例18本實施例示例了可如何擴增性特異性標記來確定靶核酸序列的來源是男性還是 女性。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品。將包含靶核酸序列和PCR抑制因子 的樣品與包含對琺瑯蛋白基因座特異性的至少一種高穩定性引物的引物組混合。對樣品實 施擴增反應，并通過高穩定性引物擴增目標基因座。然后檢驗擴增產物。如果擴增產物僅包含在內含子1中具有6個堿基缺失的核酸 序列，則受試者是女性。如果擴增產物包含在內含子1中具有6個堿基缺失和在內含子1中不具有6個堿基缺失的測序混合物，則受試者是男性。要理解的是，先前的一般性描述和詳述都僅是示例性的和解釋性的，不限制權利 要求所保護的本發明。在本申請中，單數的應用包括復數，除非另有具體說明。在本申請中， 單詞“一個”或“一種”是指“至少一個”或“至少一種”，除非另有具體說明。在本申請中， “或”的應用是指“和/或”，除非另有說明。此外，術語“包括”以及其它形式如“包含”、“含 有”的應用不是限制性的。另外，諸如“元件”或“組分”的術語既包括含有一個單元的元件 或組分，也包括含有一個以上的單元的元件或組分，除非另有具體說明。
本文使用的章節標題僅是為了組織目的，不能被解釋為以任何方式限制所述主 題。要認識到的是，在本發明教導中討論的溫度、濃度、時間或次數等之前有隱含的 “約”，使得輕微的和不顯著的偏差在本文的本發明教導的范圍內。例如，“一種引物”是指可 以但不是必須存在一種以上的引物；例如但不限于特定引物種類的一個或多個拷貝，以及 特定引物類型的一種或多種形式，例如但不限于許多不同的正向引物。另外，所應用的“包 括”、“包含”和“含有”無限制意義。要理解的是，先前的一般性描述和詳述都僅是示例性的 和解釋性的，不限制本發明。參考文獻的引用結合本文提及的所有參考文獻，包括專利、專利申請、論文、教科書等以及它們中引用 的參考文獻均通過引用整體結合到本文中。對于一個或多個引用結合的文獻和類似材料與 本申請不同或相抵觸的情況，包括但不限于限定的術語、術語應用、所述技術等，以本申請 為準。等同方案先前的描述和實施例詳述了本發明的某些優選的實施方案，并描述了本發明人設 想的最佳模式。但是，要認識到的是，不管前述可以在上下文中出現得如何詳細，本發明都 可以多種方式實施，應按照隨附的權利要求及其任何等同方案解釋本發明。
權利要求
一種擴增樣品中的核酸序列的方法，所述方法包括提供一種包含靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品；將至少一種高穩定性引物和靶核酸序列混合，其中所述高穩定性引物包含至少一種高穩定性核酸類似物；和對所述樣品實施擴增反應，由此通過所述高穩定性引物擴增所述靶核酸序列。
2.權利要求1的方法，其中所述靶核酸序列包括DNA。
3.權利要求1的方法，其中通過PCR實現擴增。
4.權利要求1的方法，其中所述高穩定性核酸類似物選自PNA、LNA、2'-0-甲基核 酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯鍵的核酸及其任意組合。
5.權利要求4的方法，其中所述高穩定性核酸類似物包括LNA。
6.權利要求1的方法，其中所述高穩定性引物包括至少2種高穩定性核酸類似物。
7.權利要求1的方法，其中所述方法包括提供至少2種高穩定性引物。
8.權利要求1的方法，其中所述方法包括提供至少5種高穩定性引物。
9.權利要求1的方法，其中所述高穩定性引物具有比第二種引物高的熔點溫度，所述 第二種引物除了以下兩點之外與所述高穩定性引物相同a)所述第二種引物由天然核酸 組成，和b)包括代替高穩定性核酸類似物的對等天然核酸。
10.權利要求1的方法，其中所述PCR抑制因子選自腐殖酸、膽鹽、復合多糖、膠原、亞 鐵血紅素、黑色素、真黑素、肌紅蛋白、多糖、蛋白酶、鈣離子、尿素、血色素、乳鐵蛋白、免疫 球蛋白G和靛青染料。
11.權利要求1的方法，其中用高穩定性引物的所述擴增擴增至少一個基因座的核酸 序列，所述基因座選自CSF1P0、FGA、TH01、TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、 D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433和 D2S1338。
12.權利要求1的方法，其中用高穩定性引物的所述擴增擴增至少一個基因座的核酸 序列，所述基因座選自CSF1P0、FGA、THOU TPOX, vWA、D3S1358、D5S818 和 D7S820。
13.一種鑒定個體的靶核酸序列的方法，所述方法包括提供一種樣品，其中所述樣品處于據信被可抑制核酸擴增的組分污染的位置，其中所 述樣品包含來自個體的靶核酸序列；使用至少一種高穩定性引物擴增所述個體的靶核酸序列，其中所述高穩定性引物包 含至少一種高穩定性核酸類似物，其中所述引物可以擴增至少一個基因座的序列，所述基 因座選自CSF1P0、FGA、THOU TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、 D16S539、D18S51、D21S11、D19S433、D2S1338或其組合，其中所述引物進一步包含遷移率調 節物；和表征擴增的靶核酸序列，由此鑒定擴增的靶核酸序列。
14.權利要求14的方法，其中所述高穩定性核酸類似物包含LNA。
15.一種用于人類鑒定的引物，所述引物具有與至少一個基因座的序列互補的序列，所 述基因座選自CSFlP0、FGA、TH01、TP0X、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、 D16S539、D18S51、D21S11、D19S433和D2S1338，其中所述引物中的至少一種核酸為高穩定 性核酸類似物。
16.權利要求15的引物，其中所述引物進一步包含遷移率調節物。
17.權利要求16的引物，其中所述遷移率調節物選自聚環氧乙烷、聚乙醇酸、聚乳酸、 多肽、寡糖、聚氨酯、聚酰胺、聚磺酰胺、聚亞砜、聚膦酸酯及其嵌段共聚物。
18.一種用于PCR反應的試劑盒，所述試劑盒包括 三磷酸脫氧核苷酸；熒光標記的引物；包含至少一種高穩定性核酸類似物的高穩定性引物；和 DNA聚合酶。
19.權利要求18的試劑盒，所述試劑盒還包括裝有等位基因分型標準物的容器，所述 等位基因分型標準物對應于適于同短串聯重復序列分析比較的大小。
20.權利要求18的試劑盒，所述試劑盒還包括熒光標記的引物。
21.權利要求18的試劑盒，所述試劑盒還包括MgCl2。
22.權利要求18的試劑盒，所述試劑盒還包括BSA。
23.權利要求18的試劑盒，所述試劑盒還包括疊氮化鈉。
24.權利要求18的試劑盒，所述試劑盒還包括對照樣品。
25.權利要求18的試劑盒，所述試劑盒還包括遷移率調節物。
26.權利要求25的試劑盒，其中所述遷移率調節物選自聚環氧乙烷、聚乙醇酸、聚乳 酸、多肽、寡糖、聚氨酯、聚酰胺、聚磺酰胺、聚亞砜、聚膦酸酯及其嵌段共聚物。
27.一種用于PCR反應的試劑盒，所述試劑盒包括 三磷酸脫氧核苷酸；熒光標記的引物；非標記引物，其中至少一種引物為高穩定性引物，其中所述高穩定性引物包含至少一 種高穩定性核酸類似物；裝有等位基因分型標準物的容器，所述等位基因分型標準物對應于適于同短串聯重復 序列分析比較的大小；和 DNA聚合酶。
28.權利要求18或27的試劑盒，其中所述高穩定性引物包含允許短串聯重復序列擴增 的序列。
29.—種擴增樣品中的核酸序列的方法，所述方法包括提供包含靶核酸序列的樣品，其中所述靶核酸序列包含短串聯重復序列； 將至少一種高穩定性引物和靶核酸序列混合，其中所述高穩定性引物包含至少一種高 穩定性核酸類似物，其中所述高穩定性引物以允許短串聯重復序列擴增的方式與靶核酸序 列特異性雜交；和對樣品實施擴增反應，由此通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。
30.權利要求1、13或29的方法，其中所述高穩定性核酸類似物不在所述高穩定性引物 的3'末端。
31.權利要求30的方法，其中所述高穩定性核酸類似物不是所述高穩定性引物的最后一個核酸。
32.—種擴增人類法醫樣品中的靶核酸序列的方法，所述方法包括 提供含有靶核酸序列的人類法醫樣品；將至少一種高穩定性引物和靶核酸序列混合，其中所述高穩定性引物包含至少一種高 穩定性核酸類似物；和對所述樣品實施擴增反應，由此通過高穩定性引物擴增靶核酸序列。
33.權利要求32的方法，其中所述人類法醫樣品包括至少一種選自以下的物質唾液、 血液、陰道液體、精液、血漿、血清、腦髓液、淋巴液、滑液、尿液、淚液和糞便。
34.權利要求32的方法，其中所述人類法醫樣品包括選自以下器官的外分泌物皮膚、 嘴、肺、鼻、眼、耳、臍、消化道、泌尿生殖道及其任意組合。
35.權利要求32的方法，其中所述靶核酸序列包含DNA。
36.權利要求32的方法，其中擴增通過PCR實現。
37.權利要求32的方法，其中所述高穩定性核酸類似物選自PNA、LNA、2'-0-甲基核 酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯鍵的核酸及其任意組合。
38.權利要求37的方法，其中所述高穩定性核酸類似物包含LNA。
39.權利要求32的方法，其中所述高穩定性引物包括至少2種高穩定性核酸類似物。
40.權利要求32的方法，其中所述方法包括提供至少2種高穩定性引物。
41.權利要求32的方法，其中所述方法包括提供至少5種高穩定性引物。
42.權利要求32的方法，其中所述高穩定性引物具有比第二種引物高的熔點溫度，所 述第二種引物除了以下兩點之外與所述高穩定性引物相同a)所述第二種引物由天然核 酸組成，和b)包括代替高穩定性核酸類似物的對等天然核酸。
43.權利要求32的方法，其中用高穩定性引物的所述擴增擴增至少一個基因座的核酸 序列，所述基因座選自CSF1P0、FGA、TH01、TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、DSS1179、 D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433和 D2S1338。
44.權利要求32的方法，其中所述法醫樣品在提供步驟之前處于非無菌環境中。
45.權利要求32的方法，其中所述法醫樣品位于選自以下的至少一個位置室內環境、 居住地、房屋、公寓、住宅單元、旅館、汽車旅館、政府辦公室、雜貨店、便利店、辦公室、辦公 樓、醫院、診所、教堂、飯館、大型購物中心、學校、學院、大學、宿舍、監獄、拘留所、車庫、圖書 館、交通工具、小汽車、飛機、火車、公共汽車、運貨車、救護車、警車、消防車、出租車、戶外環 境、公園、庭院、森林、樹林、街道、高速公路、校園、大學校園、辦公室復合地面、營地、跑道、 登山道、廣場、停車場、一片水域、湖、池塘、海洋、河流、小溪、濕地、水池和浴盆，其中所述法 醫樣品在提供步驟之前位于所述位置。
46.權利要求32的方法，其中所述法醫樣品在提供步驟之前包含至少一部分衣服。
47.權利要求46的方法，其中所述衣服選自以下的至少一種牛仔褲、褲子、毛線衫、襯 衫、內衣、裙子、女外套、圍巾、運動鞋、鞋、靴子、制服、手套、連指手套、短襪、長襪、夾克和外 套。
48.權利要求32的方法，其中所述法醫樣品直接接觸選自以下的至少一種環境家具、 桌子、椅子、車輛座椅、床、嬰兒床、床頭板、凳子、計算器、廚房用具、燈、織物、粗斜紋棉布、 帆布、絲綢、棉布、人造纖維、毛織品、毛皮、皮革、絨面革、塑料、合成纖維、紙、木材、竹子、塑 料、金屬、玻璃、陶瓷、石膏、涂料、裝飾品、眼鏡、珠寶、手袋、假發、錢包、室內裝飾品、浴簾、 窗簾、遮光物、百葉窗、地氈、地毯、床單、枕套、床罩和毛毯。
49.權利要求1、13、29和32之一的方法，其中所述高穩定性引物包含允許短串聯重復序列擴增的序列。 全文摘要
本發明的教導提供了用于核酸擴增的方法、組合物和試劑盒。在本發明教導的某些實施方案中，以至少一種高穩定性引物進行擴增反應。在某些實施方案中，本發明的教導提供了一種包含高穩定性引物的方法，所述高穩定性引物用于擴增含有靶核酸序列和PCR抑制因子的樣品中的核酸序列。
文檔編號C12P19/34GK101861396SQ200880103496
公開日2010年10月13日 申請日期2008年6月18日 優先權日2007年6月18日
發明者J·J·穆勒羅, L·K·亨尼西 申請人:應用生物系統有限責任公司