癌癥中的tert(端粒酶逆轉錄酶)基因啟動子突變的制作方法
【專利說明】
[00011 本申請享有起初在美國的兩個臨時申請61/833773(2013年6月11日提交)和61/ 805710(2013年3月27日提交）的所授予的權益，這里對兩個臨時申請做了完整參考引用和 整合。
[0002] 本發明得到了美國國立衛生研究院R01CA134225的資助，政府享有一定的發明權。
[0003] 本申請包含有序列表格。已通過EFS-網絡提交電子板，以ASCII文本形式，文件名 為"P12422-03_ST25.txt"。序列列表的大小為1605字節，2014年3月27日產生，在此做完整 整合。
技術領域
[0004] 本發明涉及癌癥領域。更具體地，本發明提供了與某些癌癥中基因啟動子突變有 關的方法和組合系統。
【背景技術】
[0005] 甲狀腺癌是最常見的經典的內分泌惡性腫瘤，其發病率已經在過去的幾十年里迅 速攀升，包括在美國以及其他工業化國家。甲狀腺癌中組織學上分類為四組:乳頭，濾泡，髓 樣，和未分化甲狀腺癌。如果診斷在早期階段，甲狀腺癌是一個好治療的疾病。總體而言，患 者5年平均存活率為97%。然而，有高度期進展侵襲性甲狀腺癌的病人5年存活率較差，約 40%。舉例來說，腫瘤大，有浸潤性，或有轉移的病人預后很差。還有，對失去放射性碘攝取 能力的轉移性疾病，現沒有有效的治療方法，這些患者1 〇年存活率小于15 %。
[0006] 盡管相對少見（占美國所有惡性腫瘤的1%)，甲狀腺癌的發病率在美國從1984年 至2004年間增加了一倍。1995年至2004年，甲狀腺癌是第三個增長最快的癌癥，僅次于腹 膜，大網膜，腸系膜及癌癥和其他消化道癌癥。同樣，大幅增加甲狀腺癌的發病率也已在加 拿大，澳大利亞，以色列和一些歐洲國家的觀察到。因此，需要對甲狀腺癌的分子機制有更 好的理解，以幫助開發新的診斷工具和更好的治療選擇。
【發明內容】
[0007] 本發明是基于或至少部分地基于下述發現，即在某些癌，包括甲狀腺癌，膀胱癌和 腦膠質母細胞瘤中的端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因啟動子區的某些多發突變，因此代表新的 診斷，風險預后評估和治療靶點和手段。
[0008] 更具體地講，通過大量的原發腫瘤的基因測序，我們探討在端粒酶逆轉錄酶 (TERT)基因的啟動子突變1，295,228 C>T和1，295,250 C>T(分別被稱為C228T和C250T)，其 分別對應從翻譯起始位點的-124 C>T和-146 C>T。我們發現C228T突變率在良性甲狀腺腫 瘤中為0/85(0.0 % )，在乳頭狀甲狀腺癌(PTC)中為30/257(11.7 % )，在濾泡狀甲狀腺癌 (FTC)為9/79( 11.4%)，在低分化甲狀腺癌(PDTC)中為3/8(37.5%)，在未分化甲狀腺癌 (ATC)中為23/54(42.6%)，在甲狀腺癌的細胞系中為8/12(66.7%) X250T突變是不常見 的，但與C228T突變相互排斥的，這兩個突變一并發生在11/79( 13.9%)甲狀腺濾泡狀癌， 25/54(46.3%)未分化甲狀腺癌，11/12(91.7%)甲狀腺癌細胞系。在乳頭狀甲狀腺癌各亞 型中，C228T突變被發現在4/13(30.8%)高細胞亞型PTC(TCPTC) ,23/187(12.3%)常規亞型 PTC(CPTC)，和2/56(3.6%)濾泡亞型？1'(：$￥?1'〇。在16例檢測的甲狀腺髓樣癌樣本中沒有 發現TERT突變。C228T突變與BRAF V600E突變在PTC中相關，存在于19/104(18.3%)BRAF突 變陽性的PTC，但只存在于11/153 (7.2 % )的BRAF突變陰性PTC樣品（P = 0.0094)。相反地， BRAF突變發現存在于85/227(37.4% )C228T突變陰性的PTC樣本，而在19/30(63.3% )C228T 突變陽性的PTC。因此，就我們所知，這是第一次證明TERT啟動子突變在甲狀腺癌存在，在具 有高度期高侵襲性甲狀腺癌TCPTC，PDTC，ATC和BRAF突變陽性的PTC尤其常見，揭示了甲狀 腺癌新的遺傳背景。另外，如本文進一步描述的，我們發現，高度重復發生的TERT啟動子突 變也高頻率地發生在膀胱癌和腦膠質細胞瘤中。
[0009] 因此，在一個方面，本發明提供了處理甲狀腺癌的新策略。在一個代表性的實施方 案中，用于治療患有甲狀腺癌的病人個體的方法包括下列步驟(a)獲得來自所述病人的生 物樣品；（b)用該獲得的生物樣品做化驗檢測，以確定1,295,228 C>T(C228T)和1，295,250C >T(C250T)突變，該兩個突變對應于從端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因啟動子的翻譯起始位點 的-124 OT和-146 C>T; (c)如果檢測到了C228T和/或C250T突變，則可確定該病人有或可 能發展成高危險高侵襲的甲狀腺癌；（d)檢測出這樣有或可能發展成高危險高侵襲的甲狀 腺癌的患者后，可做更準確的風險預后評估，然后可對患者選用一種或多種恰當的治療方 式，進行針對性的更有效的合理治療。
[0010] 在一個具體的實施方案中，步驟(b)的測定包括從TERT啟動子的翻譯起始位點啟 動子區域-124和-146的測序。在另一具體實施方案中，步驟(b)的測定包括以下步驟：（i)提 取從生物樣品中的DNA; ( ?? )使用的引物特異性雜交的TERT基因的DNA; (iii )通過聚合酶鏈 反應(PCR)放大TERT基因啟動子，其對應包含從TERT啟動子的翻譯起始位點的-124和-146 區域；（iv)測序擴增產物以確定C228T和/或C250T突變的存在。在某些實施方案中，引物包 含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。檢測方法不限于此，也可用其它檢測手段檢測兩個TERT 啟動子突變。
[0011] 在具體的實施方案中，對高進展性的甲狀腺癌的治療方法包含甲狀腺全切，側切， 放射性碘治療，和它們的組合。在進一步的實施方案中，治療方法包括給予病人TERT抑制劑 藥物。
[0012] 在另一個方面，本發明提供了鑒定受試者的疾病是否為具有或可能發展成高侵襲 性甲狀腺癌，及它們的治療方法。在一個實施方案中，用于鑒定受試者為具有或可能發展侵 襲性甲狀腺癌的方法包括(a)獲得來自所述受試者的生物樣品；（b)對來自所述對象獲得 的樣品的測定以確定1，295,228 C>T(C228T)和1,295,250 C>T(C250T)的突變。這些突變對 應于從端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因的啟動子的翻譯起始位點的-124 C>T和-146 C>T;和 (c)如果C228T和/或C250T突變存在，則確定所述受試者為患有或可能發展成高危險的侵襲 性甲狀腺癌;在具體的實施方案中，步驟(b)的測定包括對TERT啟動子從翻譯起始位點區域 包括-124和-146的測序。檢測方法不限于此，也可用其它檢測手段檢測兩個TERT啟動子突 變。
[0013] 在另一具體實施方案中，步驟(b)的測定包括以下步驟：（i)提取從生物樣品中的 DNA; ( ? )使用的引物特異性雜交的TERT基因的DNA; (iii )通過聚合酶鏈反應(PCR)放大TERT 基因啟動子，其包含從TERT啟動子的翻譯起始位點的-124和-146區域；（iv)測序擴增產物 以確定C228T和/或C250T突變的存在。在某些實施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。檢測方法不限于此，也可用其它檢測手段檢測兩個TERT啟動子突變。
[0014] 在某些實施方案中，該方法進一步包括施用治療形式適合受試者患有或可能發展 成有侵襲性甲狀腺癌的治療。在具體的實施方案中，治療方法包括甲狀腺全切，側切，放射 性碘治療，及它們的組合。在進一步的實施方案中，治療方法包括給予所述受試者TERT抑制 劑藥物。
[0015] 在另一個方面，本發明提供了治療具有膀胱癌病人的方法。在一個實施方案中，用 于治療患有膀胱癌的個體的方法包括(a)獲得來自所述受試者的生物樣品；（b)對從受試者 對象獲得的樣品進行測定以確定1，295,228 C>T(C228T)和1，295,250 C>T(C250T)突變的 存在。該兩突變對應于從端粒酶逆轉錄酶（TERT)基因的啟動子的翻譯起始位點-124 C>T 和-146 C>T; (c)如果C228T和/或C250T突變被測到，則可確定所述受試者具有或可能發展 為膀胱癌，或膀胱癌復發，或有高惡性的膀胱癌；（d)對這樣的病人做相應的針對性的膀胱 癌治療制定最佳方案。
[0016] 在某些實施方案中，生物樣品是尿樣。在一個具體的實施方案中，步驟(b)的測定 包括TERT啟動子從翻譯起始位點的-124和-146區域測序。在另一具體實施方案中，步驟(b) 的測定包括以下步驟：（i)提取生物樣品中的DNA;( ii )用特異引物特異性地雜交TERT基因 DNA; (i i i)用聚合酶鏈反應(PCR)放大TERT基因，其包含的區域從TERT啟動子的翻譯起始位 點的-124和-146區域;和（iv)測序擴增產物以確定C228T和/或C250T突變的存在。在某些實 施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。檢測方法不限于此，也可用其它檢測 手段檢測兩個TERT啟動子突變；
[0017] 在另一個方面，本發明提供了鑒定受試者為具有或可能發展為膀胱癌，和治療它 們的方法。在一個實施方案中，用于鑒定受試者為具有或可能發展為膀胱癌的方法包括(a) 獲得來自所述受試者的生物樣品；（b)對來自所述對象獲得的樣品測定，以確定突變1，295， 228 C>T(C228T)和1,295,250 C>T(C250T)的存在，其對應于從端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因 的啟動子的翻譯起始位點的-124 OT和-146 C>T;(c)如果C228T和/或C250T突變的得到 鑒定存在，則可確定所述受試者為患有或可能發展為膀胱癌，或有高危險侵襲性的膀胱癌。 在一個具體的實施方案中，步驟(b)的測定包括TERT啟動子區域(包括從TERT啟動子的翻譯 起始位點的-124和-146)的測序。
[0018] 在另一具體實施方案中，步驟(b)的測定包括以下步驟：（i)提取從生物樣品中的 DNA; ( ? )用特異的引物特異性的雜交TERT基因 DNA; (iii )通過聚合酶鏈反應(PCR)放大TERT 基因，其包含從TERT啟動子的翻譯起始位點的-124和-146區域;和（iv)測序擴增產物以確 定C228T和/或C250T突變的存在。在某些實施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。檢測方法不限于此，也可用其它檢測手段檢測兩個TERT啟動子突變。在具體實施方案 中，生物樣品是尿樣或是其它生物樣品。
[0019] 在具體的實施方案中，膀胱癌治療方式包括一種或多種方法，包括但不限于，經尿 道切除術(使用電灼），根治性膀胱切除，部分切除，和尿分流;放射療法，化學療法(例如，膀 胱內）；和生物治療，如BCG(卡介苗）。在進一步的實施方案中，治療方法包括給予所述受試 者TERT抑制劑藥物。
[0020] 另一方面，本發明提供了治療具有膠質母細胞瘤檢測處理的方法。在一個實施方 案中，用于治療具有膠質母細胞瘤受試者的方法包括(a)獲得來自受試者的生物樣品；（b) 對來自所述對象獲得的樣品的測定，以確定在1，295,228 C>T(C228T)和1,295,250 C>T (C250T)突變，其對應于從端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因的啟動子的翻譯起始位點的-124 C> T和-146C>T;(c)如果C228T和/或C250T突變被識別，則確定所述受試者具有或有可能發展 成膠質細胞瘤，并有獨特的風險程度和預后發展；（d)給于病人以合適的一個或一個以上的 治療方式。在一個具體的實施方案中，步驟(b)的測定包括從TERT啟動子的翻譯起始位點 的-124和-146區域測序。
[0021] 在另一具體實施方案中，步驟(b)的測定包括以下步驟：（i)提取從生物樣品中的 DNA;( ? )用特異引物特異性地雜交TERT基因 DNA;(iii)放大通過聚合酶鏈反應(PCR)TERT基 因，其包含從TERT啟動子的翻譯起始位點的-124和-146區域；（i v)測序擴增產物以確定 C228T和/或C250T突變的存在。在實施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。檢 測方法不限于此，也可用其它檢測手段檢測兩個TERT啟動子突變。
[0022] 在又一個方面，本發明提供了鑒定受試者為具有或可能發展成膠質細胞瘤，以及 它們的治療方法。
[0023] 在一個實施例中，一個方法用于鑒定受試者為具有或可能發展為膠質母細胞瘤包 括(a)獲得來自所述受試者的生物樣品；（b)對來自受試者的樣品做測定，以確定1，295,228 01'(02281')和1，295,250 01'(02501')突變在，其對應于-124 01'和-146 01'(從端粒酶逆 轉錄酶TERT基因的啟動子的翻譯起始位點起）；（c)如果C228T和/或C250T突變得到識別，則 可鑒定所述受試者為患有或可能發展成膠質細胞瘤。在一個具體的實施方案中，步驟(b)包 括對包含-124和-146(從TERT啟動子的翻譯起始位點起)的TERT啟動子區域測序。
[0024] 在另一具體實施方案中，步驟(b)的測定包括以下步驟：（i)提取生物樣品中的 DNA; ( ? )用特異的引物特異性雜交TERT基因的DNA; (iii )通過聚合酶鏈反應(PCR)放大TERT 基因，其包含-124和-146 (從TERT啟動子的翻譯起始位點起）的區域；（i v)測序擴增產物以 確定C228T和/或C250T突變的存在。在某些實施方案中，引物包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。檢測方法不限于此，也可用其它檢測手段檢測兩個TERT啟動子突變。在具體實施方案 中，生物樣品是腫瘤組織，或穿刺樣本，或腦脊液，或其它生物樣品。
[0025] 在具體的實施方案中，治療腦膠質細胞瘤包括一個或多個外科手術，放射治療(例 如，3維放射治療，調強放射療法，立體定向放射治療，和質子束放射治療）；化療（例如，鞘 內）；和生物治療（例如，酪氨酸激酶抑制劑療法，血管內皮生長因子(VEGF)療法，樹突呼叫 疫苗療法和基因療法）。在進一步的實施方案中，治療方法包括給予所述受試者TERT抑制劑 藥物。
【附圖說明】
[0026]圖1.測序人類的TERT啟動子電泳測序圖。所示為人TERT啟動子的兩個含有突變的 DAN序列的代表性電泳測序圖。1A:使用有正鏈引物進行測序獲得的DNA鏈，其中顯示TERT啟 動子突變C228T和C250T，包括各種甲狀腺癌細胞系和甲狀腺癌的樣品。圖1B:用反鏈引物進 行測序，以各種甲狀腺癌細胞系和甲狀腺癌的樣品測試，顯示TERT啟動子突變G228A和 G250A的反鏈DNA。圖1A和1B:WR0細胞系用來顯示野生型人TERT啟動子。PTC，甲狀腺乳頭狀 癌;FTC，甲狀腺濾泡狀癌;ATC，甲狀腺未分化癌;PDTC，低分化甲狀腺癌。
[0027]圖2. TERT啟動子在膀胱癌和膠質母細胞瘤的突變。也顯示了野生型TERT啟動子。 樣本代表性地顯示膀胱癌和成膠質細胞瘤代表電泳測序和兩個TERT啟動子突變。該圖的上 部顯示了野生型DNA的正鏈序列和兩個突變在這兩種癌癥的核苷酸變化的電泳測序圖。該 圖的下部顯示了野生型DNA的反鏈序列和兩個突變在這兩種癌癥的核苷酸變化的電泳測序 圖。
【具體實施方式】
[0028] 可以理解的是，本發明并不限于所述的具體方法和內容等，因本文中所描述是可 以變化。也應當理解，本文使用的術語僅用于描述具體實施方案的目的，并不限制本發明的 范圍。必須指出，如