一種提取純化m-mlv逆轉錄酶的方法

一種提取純化m-mlv逆轉錄酶的方法
【專利摘要】本發明提出了一種提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法。步驟為：工程菌的活化和表達：取M-MLV逆轉錄酶工程菌進行活化后加入IPTG誘導表達得到表達的工程菌；用溶菌酶室溫處理后加入DTT，吐溫-20，冰上處理一段時間后離心，得到粗蛋白；粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌，離心去除沉淀得到上清；上清移至已經預熱至60℃的水浴鍋中，孵育后離心，去除沉淀，得到上清；流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再進行脫鹽得到純化的M-MLV逆轉錄酶；得到的M-MLV逆轉錄酶可加入甘油使體積分數為50%，-20℃保存。本發明方法簡單，酶活性損失小，回收蛋白的純度、活性、回收量高。
【專利說明】-種提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法。

【背景技術】
[0002] Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT,M_MLV 逆 轉錄酶)是一種RNA依賴的DNA聚合酶，基因來源是莫洛尼（氏）鼠白血病病毒基因組。它 可以以單鏈RNA、DNA或RNA-DNA雜交體為模板進行cDNA合成。
[0003] M-MLV逆轉錄酶是從原核表達菌中（含M-MLV Reverse Transcriptase基因的 BL21 (DE3)工程菌）進行提取純化。
[0004] 目前，因活性蛋白容易變性失活因而純化都是要求在低溫條件下進行(冰上操 作)，常規純化M-MLV逆轉錄酶方法采用低溫超聲破碎，反復通過硫酸銨沉淀、離子交換、層 析和脫鹽進行純化，不僅高達50%的蛋白會在純化初期就會損失，而且部分基因組蛋白很 難完全去除，再加上基因組蛋白的存在會導致上柱速度緩慢，延長純化時間，純化得到的蛋 白酶活降低，影響了后期酶的逆轉錄活性。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種簡單，酶活性損失小，回收蛋白的純度和回收量高的 活性蛋白酶的提取方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供一種提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于， 包括如下步驟， 1) 工程菌的活化和表達：取M-MLV逆轉錄酶工程菌進行活化后并振蕩培養后加入IPTG 誘導；洗滌；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌，離心；再用緩沖液A重懸得到表達 的工程菌； 2) 粗蛋白制備：將所述表達的工程菌用溶菌酶室溫處理后加入DTT，吐溫-20,冰上處 理一段時間后離心，得到的上清即為粗蛋白； 3) 粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌，離心去除沉淀得到上清； 4) 將所述得到的上清移至已經預熱至60°C的水浴鍋中，孵育后離心，去除沉淀，得到上 清； 5) 上清流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再進行脫鹽得到純化的M-MLV逆轉錄酶； 所述緩沖液 A 為 20mM Tris-HCl，0. 2M NaCl，pH 8. 0 ; 任選的，得到的M-MLV逆轉錄酶加入甘油使體積分數為50%，-20°C保存。
[0007] 所述M-MLV逆轉錄酶工程菌為從莫洛尼氏鼠白血病病毒中PCR擴增得到PCR產 物，所得PCR產物經Sal I、Hindlll雙酶切后連接至經Sal I、Hindlll雙酶切的PET28a 載體上，構建表達載體PET28a-M-MLV，將上述質粒轉化表達菌BL21 (DE3)，即獲得生產重組 M-MLV逆轉錄酶的工程菌株。
[0008] 所述PCR擴增所用的引物為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2。
[0009] 所述步驟1)為取M-MLV逆轉錄酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養基中， 振蕩培養；取活化好的菌液轉接到同樣的LB液體培養基中，振蕩培養后加入IPTG誘導培養 8小時；用離心管超聲洗滌30min，并用雙蒸水潤洗一次；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖 液A洗滌，離心；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌。
[0010] 所述步驟1)為取M-MLV逆轉錄酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養基中， 37°C，200rpm振蕩培養過夜；取活化好的菌液轉接到同樣的LB液體培養基中，37°C，250轉 /分振蕩培養4小時后加入1M IPTG至終濃度1. 0mmol/L，28°C、250 rpm件下培養8小時； 用離心管超聲洗滌30min，并用雙蒸水潤洗一次；12000rpm，4°C離心5分鐘收集菌體；收集 的菌體用緩沖液A洗滌一次，12000rpm，4°C離心5分鐘；再用緩沖液A重懸得到表達的工程 菌。
[0011] 所述步驟2)為將所述表達的工程菌用4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分 鐘后加入DTT使終濃度為ImM，加入吐溫-20使體積百分比為0. 5%，冰上處理45分鐘， 15000g/4°C /20分鐘，得到的上清即為粗蛋白。
[0012] 所述步驟3)為粗蛋白中緩慢加入體積系數5%的二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪 拌10分鐘，15000g，4°c離心20分鐘，去除沉淀。
[0013] 所述步驟4)中孵育10分鐘，離心條件為15000g/4°C /20分鐘。
[0014] 所述步驟5)為上清補足NaCl后流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，該柱先用10倍床 體積結合緩沖液平衡；再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌；最后用洗脫液洗脫目的蛋 白；含目的蛋白的洗脫液用sephade XG25脫鹽后即得到純化的M-MLV逆轉錄酶；脫鹽中用 到的脫鹽緩沖液為緩沖液 E: 100mMTris-HCl，PH7.5, 2mMDTT, 0·2%ΝΡ-40, lOOmMNaCl， 0.2mM EDTA ； 所述結合緩沖液為20mM Tris-HCL，0. 5MNaCl，PH8. 0，5mM咪唑；所述洗滌緩 沖溶液為 20mM Tris-HCL, 0. 5MNaCl, PH8. 0,15mM/50mM 咪唑；所述洗脫液為 20mM Tris-HCL, 0· lMNaCl, ΡΗ8· 0，200mM 咪唑。
[0015] 本發明生產工藝合理簡單，僅需要溶菌酶破碎菌體，二氧化硅吸附雜蛋白和核酸， 60°C加熱孵化處理10分鐘，親和層析進行純化，避免了常規逆轉錄酶純化中反復通過離子 交換柱，層析柱和脫鹽柱進行純化。保證酶活性得到很好的保持，并且保證了產品產量和純 度，后期使用過程中逆轉錄效果良好。
[0016] 1.產品的確認 (1)基因來源 M-MLV逆轉錄酶基因為從莫洛尼（氏）鼠白血病病毒基因中擴增得到。
[0017] 擴增引物為： M-MLV ：cgcGAGCTCATGACCCTAAATATAGAAGAT SEQ ID N0:1 M-MLV ：cgcAAGCTTCGAGGAGGGTAGAGGTG SEQ ID NO :2 基因序列信息：Moloney murine leukemia virus, complete genome. gb|AF033811. 1 |AF033811，Range 1: 2332 to 4347。 具體見 SEQ ID NO:3 ; (2)載體來源 PET-28a表達質粒購自美國Novagen公司。該質粒在克隆位點前有1個T7啟動子，在T7 啟動子前有1個6XHis-Tag coding序列，是Τ7的增強子，多克隆位點上有Ncol-Xholll 個酶切位點，載體上還有1個卡那霉素（Kan)的篩選標記； (3) 宿主菌 宿主菌為BL21 (DE3)菌株，即宿主菌BL21經噬菌體DE3溶源化后，DE3的lacUV5強啟 動子及位于其下游的T7 RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因組DNA中。宿主菌在非代 謝性乳糖類似物IPTG的誘導作用下能產生大量的T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶能特異性 地識別PET-28a表達載體中的T7啟動子序列，從而高效地表達目的重組蛋白。由于IPTG 不會被宿主菌利用，因此向培養液中加入少量的IPTG就能對lacUV5強啟動子產生持久的 誘導作用； (4) M-MLV逆轉錄酶工程菌株 M-MLV逆轉錄酶基因的per產物經Sal I、HindIII雙酶切后連接至經Sal I、HindIII 雙酶切的PET28a載體上，構建表達載體PET28a-M-MLV，將上述質粒轉化表達菌BL21 (DE3)， 即獲得生產重組M-MLV逆轉錄酶的工程菌株。
[0018] 2.產品的制備 ①用50ml緩沖液A (20mM Tris-HCL, (λ 2MNaCl, PH8. 0)重懸菌體（生產重組M-MLV逆 轉錄酶的工程菌株），4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘，加入DTT使終濃度為ImM，加 入吐溫-20使體積百分比為0. 5%，冰上處理45分鐘，15000g/4°C /20分鐘，得到的上清即粗 蛋白。
[0019] ②粗蛋白中緩慢加入體積系數5%的二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌30分鐘(吸 附基因組DNA和雜蛋白），15000g/4°C /20分鐘，去除沉淀，上清移入干凈離心管。
[0020] ③將步驟②得到的上清移至已經預熱至60°C的水浴鍋中，孵育10分鐘， 15000g/4°C /20分鐘，去除沉淀，上清移入干凈離心管。
[0021] ④上清液補足NaCl至終濃度為0. 5M，流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，該柱先用10 倍床體積結合緩沖液（20mM Tris-HCL，0. 5MNaCl，PH8. 0，5mM咪唑）平衡；再用5倍床體積 洗滌緩沖溶液（20mM Tris-HCL，0· 5MNaCl，PH8. 0,15mM/50mM咪唑）依次洗滌；最后用洗脫 液（20mMTris-HCL，0. lMNaCl，PH8.0，200mM咪唑)洗脫目的蛋白。含目的蛋白的洗脫液用 s印hadexG25 脫鹽，脫鹽緩沖液為緩沖液 E : (100mMTris-HCl (7. 5)，2mMDTT，0· 2%NP-40， lOOmMNaCl，0. 2mMEDTA)。脫鹽后加入甘油使體積分數為50%，-20°C保存備用。
[0022] 3.產品的用途 M-MLV逆轉錄酶可以以單鏈RNA、DNA或RNA-DNA雜交體為模板進行eDNA合成。由于 具有RNase Η活性低，eDNA得率高高的特點，M-MLV逆轉錄酶可用于逆轉錄、qRT-PCR，適合 應用于一步法qRT-PCR試劑盒的開發。
[0023] 有益效果： 1. 和常規M-MLV逆轉錄酶提取方法對比，采用60°C孵育步驟，最大限度去除雜蛋白，保 障提純得到高純度M-MLV逆轉錄酶； 2. 和常規M-MLV逆轉錄酶提取方法對比，提取純化過程加入二氧化硅進行核酸和雜蛋 白的吸附，去除大量核酸和雜蛋白，上柱速度快，有效減少親和層析柱中核酸和雜蛋白的非 特異吸附機會，減少上柱時間，有利于保證回收蛋白的純度和保持逆轉錄酶活性； 3. 和常規M-MLV逆轉錄酶提取方法對比，本發明只需要親和層析柱和脫鹽柱，上柱次 數少，操作簡單，避免反復使用離子交換柱和層析柱，容易在普通實驗室進行蛋白純化并且 有效保障蛋白回收率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1是SDS-PAGE純度檢測電泳圖。
[0025] 圖2是M-MLV逆轉錄酶活性檢測結果圖。
[0026] 圖3是不加 M-MLV逆轉錄酶的活性檢測對照實驗結果圖。

【具體實施方式】
[0027] 下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例 中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明 書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0028] 實施例1 : 一、主要試劑 1. LB液體培養基（1000 mL) NaCl ：10g 蛋白胨：l〇g 酵母粉：5g 2. 緩沖液 A (20mM Tris-HC1，0.2M NaCl，pH 8.0) (1000 mL) Trizma-HCl： 1.7651g Trizma-Base ：1.066g NaCl ： 11. 688g 3. 緩沖液 B (20mM Tris-HC1，0.5M NaCl，pH 8.0) (1000 mL) Trizma-HCl ： 1.7651g Trizma-Base ： 1.066g NaCl ： 29. 22g 4. 洗滌緩沖液C:(20mM Tris-HC1，0.5M NaCl，5mM 咪唑，0.5%Tween-20，pH 8.0)(100 mL) 緩沖液B :100mL 3M 咪唑：167uL Tween-20 :500 uL 5. 洗滌緩沖液 D:(20mM Tris-HC1，0.5M NaCl，5mM 咪唑，pH 8.0) (100 mL) 緩沖液B :100mL 3M 咪唑：167uL 6. 菌種活化 取M-MLV逆轉錄酶工程菌200uL接種到20mL含卡那霉素（5(^g/mL)LB液體培養基中， 37°C，200rpm振蕩培養過夜。
[0029] 二、工程菌的構建和表達 1、M-MLV逆轉錄酶工程菌的構建 模板為含莫洛尼（氏）鼠白血病病毒基因組gag-pol基因質粒。序列見SEQ ID N0:3 (Invitrogen全基因人工合成） 擴增引物為： M-MLVF ：cgcGAGCTCATGACCCTAAATATAGAAGAT (SEQ ID NO:1) M-MLVR ：cgcAAGCTTCGAGGAGGGTAGAGGTG (SEQ ID NO :2) PCR反應體系配置見表1 :

【權利要求】
1. 一種提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，包括如下步驟， 1) 工程菌的活化和表達：取M-MLV逆轉錄酶工程菌進行活化后并振蕩培養后加入IPTG 誘導；洗滌；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌，離心；再用緩沖液A重懸得到表達 的工程菌； 2) 粗蛋白制備：將所述表達的工程菌用溶菌酶室溫處理后加入DTT，吐溫-20,冰上處 理一段時間后離心，得到的上清即為粗蛋白； 3) 粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌，離心去除沉淀得到上清； 4) 將所述得到的上清移至已經預熱至60°C的水浴鍋中，孵育后離心，去除沉淀，得到上 清； 5) 上清流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再進行脫鹽得到純化的M-MLV逆轉錄酶； 所述緩沖液 A 為 20mM Tris-HCl，0. 2M NaCl，pH 8. 0 ; 任選的，得到的M-MLV逆轉錄酶加入甘油使體積分數為50%，-20°C保存。
2. 權利要求1所述的提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，所述M-MLV逆轉 錄酶工程菌為從莫洛尼氏鼠白血病病毒中PCR擴增得到PCR產物，所得PCR產物經Sal I、 Hindlll雙酶切后連接至經Sal I、Hindlll雙酶切的PET28a載體上，構建表達載體 PET28a-M-MLV，將上述質粒轉化表達菌BL21 (DE3)，即獲得生產重組M-MLV逆轉錄酶的工程 菌株。
3. 權利要求2所述的提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，所述PCR擴增所用 的引物為 SEQ ID ΝΟ:1 和 SEQ ID NO:2。
4. 權利要求1或2所述的提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，所述步驟1) 為取M-MLV逆轉錄酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，振蕩培養；取活化好的 菌液轉接到同樣的LB液體培養基中，振蕩培養后加入IPTG誘導培養8小時；用離心管超聲 洗滌30min，并用雙蒸水潤洗一次；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌，離心；再用 緩沖液A重懸得到表達的工程菌。
5. 權利要求4所述的提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，所述步驟1)為取 M-MLV逆轉錄酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，37°C，200rpm振蕩培養過夜； 取活化好的菌液轉接到同樣的LB液體培養基中，37°C，250轉/分振蕩培養4小時后加入 1]\11?16至終濃度1.0臟〇1/1，281：、250印111件下培養8小時；用離心管超聲洗滌301^11，并 用雙蒸水潤洗一次；12000rpm，4°C離心5分鐘收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次， 12000rpm，4°C離心5分鐘；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌。
6. 權利要求1或2所述的提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，所述步驟2) 為將所述表達的工程菌用4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘后加入DTT使終濃度為 ImM，加入吐溫-20使體積百分比為0. 5%，冰上處理45分鐘，15000g/4°C /20分鐘，得到的上 清即為粗蛋白。
7. 權利要求1或2所述的提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，所述步驟3) 為粗蛋白中緩慢加入體積系數5%的二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌10分鐘，15000g，4°C 離心20分鐘，去除沉淀。
8. 權利要求1或2所述的提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，所述步驟4) 中孵育10分鐘，離心條件為15000g/4°C /20分鐘。
9.權利要求1或2所述的提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，所述步驟5) 為上清補足NaCl后流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，該柱先用10倍床體積結合緩沖液平衡； 再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌；最后用洗脫液洗脫目的蛋白；含目的蛋白的洗脫 液用 SephadeXG25脫鹽后即得到純化的M-MLV逆轉錄酶；脫鹽中用到的脫鹽緩沖液為緩沖 液 E: 100mMTris-HCl，PH7.5，2mMDTT, 0.2%NP-40，100mM NaCl, 0. 2mM EDTA ； 所述結合緩沖液為20mM Tris-HCL，0. 5MNaCl，PH8. 0，5mM咪唑；所述洗滌緩 沖溶液為 20mM Tris-HCL, 0. 5MNaCl, PH8. 0,15mM/50mM 咪唑；所述洗脫液為 20mM Tris-HCL, 0· lMNaCl, ΡΗ8· 0，200mM 咪唑。
【文檔編號】C12R1/19GK104250642SQ201410180381
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】魏劭, 林家旺, 魏超 申請人:廈門安普利生物工程有限公司