轉基因玉米的基因芯片檢測方法

專利名稱：轉基因玉米的基因芯片檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測方法，具體說是利用基因芯片對轉基因玉米產品進行檢測的 方法。
背景技術：
隨著基因工程技術的快速發展，轉基因作物已進入大規模商品化生產階段，轉基 因作物品種達100多個，主要有大豆、玉米、棉花、油菜等，由轉基因作物加工生產的轉基因 食品和食品成分達4000余種。然而轉基因作物在帶來巨大經濟效益的同時也存在許多潛 在問題。由于目前尚缺乏科學依據證明轉基因產品對人類健康和環境的安全性，轉基因產 品對健康和環境潛在的風險引起世界各國政府和公眾的極大關注和廣泛憂慮。農作物中轉 基因成分的安全性問題已由科學問題上升為社會問題。為了保護消費者的知情權與選擇 權，世界很多國家都加強了對轉基因作物及產品的檢測及監管，并要求對含有轉基因成分 的食品進行明確標示。玉米是世界上重要的農作物，國內外對于應用基因工程技術改良玉米，特別是改 良玉米的抗蟲性和品質都非常重視。通過多年努力已經取得很大成績，轉基因玉米研究與 產業化進入了快速發展階段。中國是世界第二大玉米生產國，常年種植MOO萬hm2，我國轉 基因玉米研究進展較快，轉基因玉米在我國即將進入生產階段，轉基因抗蟲、除草劑玉米的 產業化蓄勢待發，轉基因玉米的安全性檢測與監督迫在眉睫。轉基因玉米的檢測，目前用的比較多的是PCR技術與ELISA技術(酶聯免疫法)。PCR檢測技術的基本原理是根據產品中待檢的外源基因核酸序列設計合適引物， 經PCR反應使待檢靶標DNA序列得以擴增放大，最后經凝膠電泳分析靶標PCR產物的有無， 從而對產品中是否含有靶標基因序列成分進行判定。應用PCR技術的關鍵是所設計的DNA 引物的序列必須和轉基因產品中所待擴增的DNA序列互補，因此為了設計有效引物，檢驗 者必須對轉基因產品中所含有的外源基因DNA序列有一定的了解。轉基因生物中被導入的 外源基因序列一般包括標記基因、目的基因、及各自的啟動子、終止子等調控序列。PCR定性篩選檢測方法1996年德國伯恩斯坦大學的Meyer Rolf等論證了 PCR檢 測轉基因產品的可能性。檢測的一般程序①提取待檢品中的DNA ②設計與待測特異DNA片 斷相適的引物③對待測DNA片斷進行PCR擴增④用瓊脂糖凝膠電泳分離擴增的DNA，EB 染色后，分析鑒定轉基因成分。定量PCR檢測方法定性篩選PCR本身具有局限性，所采取的PCR法因其高敏 感性常伴有假陽性現象，而操作上的誤差，加上一些反應抑制因素亦可帶來假陰性現象， 其最大的不足是無法對轉基因成分進行定量分析。為此，研究者們在定性篩選PCR方法 的基礎上，發展了不同的定量PCR檢測方法。目前，國外較為成熟的方法主要有定量競爭 PCR(Quantitative competitive, QC-PCR)禾口 Real-time PCR 法。定量競爭PCR法先構建含有修飾過的內部標準DNA片斷(競爭DNA)，與待測DNA 進行共擴增，因競爭DNA片斷和待測DNA的大小不同，經瓊脂糖凝膠可將兩者分開，并可進行定量分析。①樣品DNA的提取和定量。按常規方法提取DNA。DNA含量可用紫外分光光 度計測定。②競爭DNA的構建。常規分子生物學的方法，用基因重組技術構建競爭DNA片 段作為內部標準DNA，此片段除含有轉基因成分外(如35S啟動子、NOS終止子)，還插入數 +bp的DNA序列(或缺失數+bp的DNA序列)。③標準工作曲線的建立。取定量模板DNA， 所含GMO量分別為0 100%的系列參考樣，分別與一定量的競爭DNA在同一反應體系進 行PCR擴增。特異轉基因DNA與競爭DNA競爭反應體系中的相同底物、引物，PCR反應獲得 相差數+bp的兩條凝膠電泳帶，兩條帶濃度隨轉基因成分含量的不同而有差異。當兩條帶 濃度相等，則說明此參考樣GMO濃度與競爭DNA濃度相等。通常實驗時競爭DNA濃度調整 到與含轉基因成分的參考樣相當。通過凝膠成像分析系統對瓊脂糖凝膠電泳的結果進 行分析，得到每條帶的相對濃度，以此數據作〔目標DNA濃度〕——〔目標DNA濃度〕/〔競 爭DNA濃度〕的對數圖，線性回歸分析后得出工作曲線。④待測樣品的測定，將500ng待測 DNA與經過定量的競爭DNA共擴增，凝膠電泳后經掃描分析得到兩條帶得到〔目標DNA〕/〔 競爭DNA〕的比值，依此數據在工作曲線圖上求得待測樣品的GMO含量。Real-time定量PCR法此方法須設計一個內部探針，該探針包含5’端熒光報告 因子和3’端猝滅因子。PCR反應前，由于猝滅因子與熒光報告因子的位置相近，使熒光受 到抑制而檢測不到熒光信號。隨著PCR反應從上游的PCR引物開始，引物和標記探針與目 標DNA分子中對應的互補序列復性，聚合酶與探針相遇，利用其5’核酸外切酶活性使報告 因子釋放，產生的熒光可被內設的激光器記錄，記錄到的熒光強度可反映PCR的產物量，從 而實現實時定量分析。PCR檢測技術靈敏度高，檢測迅速。但現今的篩選方法，只是對特定啟動子、終止子 和標記基因進行PCR檢測，而PCR方法因其高敏感性常伴有假陽性現象。另一方面，隨著轉 基因技術的發展，越來越多的轉基因生物采用全新的啟動子、終止子和標記基因，使得現在 常用的篩選因子的覆蓋面減小，失去篩選的意義。ELISA技術是建立在抗體抗原免疫學反應的基礎上的。抗原抗體反應是一種非共 價鍵特異性吸附反應，即在通常情況下，抗原只和它自己(或具有相同抗原決定簇)誘導產 生的抗體發生反應，因此具有高度特異性，抗體抗原反應雖然產生肉眼可見的凝集反應，但 靈敏度太低而且需要大量的抗體和抗原。ELISA分析法特異性高，獲得的結果很快，儀器簡單，儀器操作，對人員要求不高； 免去了對樣品進行核酸提取的麻煩，同時可降低檢測的成本；由于酶具有很高的催化效率， 可極大的放大反應效果，從而使測定達到很高的靈敏度和穩定性。但是也有其局限性(1) 檢測范圍窄，需要轉基因食品中含有待檢測范圍，如EPSPS基因的耐除草劑大豆，轉Bt基因 的抗蟲玉米等，因此只能在商業化GMF品種較少的情況下使用。目前商品化ELISA試劑盒 只能檢測少數幾種GMF，且一種試劑盒只針對某一特定轉基因產物，無法高通量、快速的檢 測具有多種混合成分的食品樣品；( 易出現假陰性結果，一方面轉基因產品中“新蛋白” 含量通常很低，難以檢出，另一方面蛋白質在食品加工過程中易變性，已加工食品中的蛋白 質很可能失去抗體所針對的抗原表位，從而造成ELISA檢測結果假陰性。此外，蛋白質在受 體生物基因組內表達前后如進行新的修飾，也可導致檢測敏感性降低及假陰性結果。就目前轉基因產品檢測中常用的ELISA和PCR技術而言，最大的缺點是檢測范圍 窄，效率低，無法高通量大規模地同時檢測多種樣品，尤其是對轉基因背景一無所知的情況下，對各種候選待檢基因序列或蛋白的逐一篩查幾乎是不可能的。因此，對轉基因產品的檢 測，需要有更有效、快速、特別是高通量的檢測方法。

發明內容
本發明旨在提供一種高通量、微型化、自動化、快速高效、靈敏度高的轉基因玉米 的基因芯片檢測方法，涵蓋的轉基因玉米產品檢測面很廣，可一次性同時對目前我國批準 的轉基因玉米中常用的啟動子、終止子、抗蟲基因、抗草甘膦基因等7種主要的外源DNA序 列進行檢測分析的方法。本發明實現的步驟如下1)確定引物和探針2)采用多聚賴氨酸處理芯片載體，浸泡烘干。3)芯片制備探針與TE buffer充分混勻，采用芯片點樣儀點樣于處理過的芯片載體上，芯片經 過烘干，UV交聯，化學封閉以及變性后，置于干燥箱中室溫保存。4) PCR 擴增反應體系含有反應緩沖液，dNTP，引物，TITANUIM擴增酶，DNA模板，MgCl2,滅菌超 純水。5) PCR產物標記反應體系含有反應緩沖液，Cy3_dNTP，Thermo sequence DNAPolymerase, SBE 引 物，多重PCR產物，滅菌超純水。6)芯片雜交標記的PCR產物變性取出放置于冰上，加入雜交液，然后將雜交混合液滴于制備 的芯片上，雜交爐中雜交2h，雜交后的芯片經洗滌，離心，晾干。7)芯片掃描及數據處理利用芯片掃描儀對雜交反應后的芯片進行掃描，輸出數據進行分析處理。本發明選擇了最佳的的雜交條件和擴增、雜交引物，能使多基因PCR產物與芯片 上的雜交探針處于最佳的反應狀態，大大提高了外源DNA的檢出率，結果表明，靈敏度達 0. 01%。本發明通過一次性檢測啟動子、終止子、抗蟲基因、抗除草劑基因等常見的7種外 源基因來判定待檢樣品是不是轉基因玉米，是不是我國已批準的轉基因玉米種類。本發明可廣泛應用于進出口檢驗檢疫。實施方式實施例1針對轉基因玉米中常用的7個外源基因以及對照基因(18SrRNA、Invertase內源 基因)的序列，通過引物設計軟件primer5. 0和oligo6. 0來設計引物和探針，并在ncbi進 行核苷酸序列的比對，從中選出符合要求的引物和探針，所選用的引物和探針信息詳見表1 和表2。表 權利要求
1.一種轉基因玉米的基因芯片檢測方法，檢測步驟如下1)確定引物和探針2)采用多聚賴氨酸處理芯片載體，浸泡烘干。3)芯片制備探針與TE buffer充分混勻，采用芯片點樣儀點樣于處理過的芯片載體上，芯片經過烘 干，UV交聯，化學封閉以及變性后，置于干燥箱中室溫保存。4)PCR擴增反應體系含有反應緩沖液，dNTP，引物，TITANUIM擴增酶，DNA模板，MgC12，滅菌超純水。5)PCR產物標記反應體系含有反應緩沖液，Cy3_dNTP，Thermo sequence DNAPolymerase, SBE引物,多 重PCR產物，滅菌超純水。6)芯片雜交標記的PCR產物變性取出放置于冰上，加入雜交液，然后將雜交混合液滴于制備的芯 片上，雜交爐中雜交2h，雜交后的芯片經洗滌，離心，晾干。7)芯片掃描及數據處理利用芯片掃描儀對雜交反應后的芯片進行掃描，輸出數據進行分析處理。
2.如權利要求1所述的轉基因玉米的基因芯片檢測方法，其特征是步驟1所選用引物 如下1)18SrRNA.TAA TAG AGC AAT GAA CAG TCG G CTT TCA ACA ACG GAT CTC TTG G2)intervase內源基因GGC CGG ATC GTC ATG CTC TAC A TTG GCG TCC GAC TTG ACC CAC T3)CaMV 35S啟動子GAT TCC ATT GCC CAG CTA TCT G TAG AGG AAG GGT CTT GCG AAG G4)T-nos終止子GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG CGA ATT CCC GAT CTA GTA AC5)修飾型CP4-EPSPSCGT CTT GAA GGT CGT GGT A GCA ACA GCG AGA ATT GGA TA6)殺蟲毒蛋白CryIAb基因 TCG ACA TCA GCC TGA GCC TG TGG TTG ATC AGC TGC TCG ATC7)耐除草劑Ivrl基因CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC TGGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C8)抗蟲kin基因GCT TGC ATT GTT CGC TCT C CGA TGG CAT GTC AAC TCA TTA9)抗蟲zSSnb基因CGG TGG ATG CTA AGG CTG ATG AAA GGG CCA GGT TCA TTA TCC TC。
3.如權利要求1所述的轉基因玉米的基因芯片檢測方法，其特征是步驟1所選用探針 如下TTC AGA CCT CCA CCC TTG AATCGA GCA GAC CGC CGT GTA CTT CTA CCGGC CAT CGT TGA AGA TGC CTC TGC CAAT GTA TAA TTG CGG GAC TCT AAT CTGG CTG ACT TGC GTG TTC GTT CTT CTA CTT TGATG GTG CTC CGC GAT GTC TCCACT TTA ATA GCA TAC GTT ATT CCAGGT ATG AAC CCA GCA GGA ATT GGACGT GTA CTT CTA CC GTG TTC TTG。
全文摘要
一種轉基因玉米的基因芯片檢測方法，主要步驟包括確定引物和探針、芯片制備、PCR擴增、PCR產物標記、芯片雜交、芯片掃描及數據處理。該檢測方法可一次性對轉基因玉米中常用的啟動子、終止子、抗蟲基因、抗草甘膦基因等7種主要的外源DNA序列進行檢測分析，是一種高通量、微型化、自動化、快速高效、靈敏度高的轉基因玉米的檢測方法，可廣泛應用于進出口檢驗檢疫等相關領域。
文檔編號C12Q1/68GK102115783SQ200910256119
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月31日 優先權日2009年12月31日
發明者孫煒偉, 杜蕾蕾 申請人:威海華康生物芯片有限公司