專利名稱：轉基因玉米ga21品系的lamp檢測引物及方法
技術領域：
本發明提供了一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法。
背景技術：
隨著全球轉基因產品的日益增多，以及越來越多的轉基因作物特異品系獲得商品化生產，檢測特異性品系已成為國際上轉基因成分檢測的發展趨勢。目前，檢測轉基因特異品系的方法主要有普通PCR方法和實時熒光PCR方 法。普通PCR方法，具有耗時長，操作繁瑣，靈敏度不夠，容易產交叉污染，質控復雜，假陽性、假陰性比例偏高等缺點。實時熒光PCR方法則具有成本昂貴、技術要求高、需要大型的儀器設備等缺點，均已經不能滿足食品中轉基因成分的日常監管和食品生產行業內部質控的需求。因此，目前急需建立能夠普遍適用于檢驗檢疫一線的基層實驗室的快速、簡便、準確的轉基因品系檢測方法。環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是2000年開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4飛條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件￠3 °C左右)保溫30 — 60分鐘，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物(焦磷酸鎂)，形成乳白色沉淀，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定結果。LAMP技術具有簡便、高效、特異、快速等優點，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程，在靈敏度、特異性能媲美甚至優于普通PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。LAMP技術在食源性致病微生物的快速檢測中已得到廣泛應用，但在轉基因產品檢測上的應用研究很少。目前，國內采用LAMP技術對轉基因成分的研究尚處于起步階段，且主要應用于啟動子、外源基因的檢測，極少應用于轉基因特異品系的檢測。目前未見轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測方法的研究報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種普遍適用于基層實驗室的快速、簡便、準確、特異檢測轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法。本發明首先提供了一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物，所述LAMP檢測引物如下
外引物 F3 :5，-GCT GTA GTT GTT GGC TGT-3’
外引物 B3 :5，-CCT TTT AAC TGA TGT TTT CAC TT-3，
內引物 FIP :5’-TGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AGG TGG AAA GTT CCC AGT TGA-3’內引物BIP 5' -GCA GGT CGA GGT CAT TCA TAT GGA CCA GGT AAT CTT ACC TTT G-3’環引物 LF :5’-CTG CAC TTC CTC TTT AGC ATC C-3’
環引物 LB :5’ -CTT GAG AAG AGA GTC GGG ATA GTC-3’。本發明還提供了一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測方法，利用所述的LAMP檢測引物，以fei DNA聚合酶大片段啟動環介導等溫擴增，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定檢測結果。環介導等溫擴增的反應條件為63°C溫育lh，80°C保溫5min ;反應體系為10XThermoPol 緩沖液 2. 5μ ，10 Mmol/L 外引物 F3 O. 5μ ，10 Mmol/L 外引物 Β3 O. 5μ ，40Mmol/L 環引物 LF 0. 5μ Α0 Mmol/L 環引物 LB O. 5μ Α0 Mmol/L 內引物 FIP I. 0μ ,40Mmol/L 內引物 BIP I. OM-L, 10 mmol/L dNTPs 3. 5M-L, 5 mol/L 甜菜喊 4. OM-L, 150 mmol/L硫酸鎂 I. 0μ ,8 υ/μ Bst DNA 聚合酶大片段 I. Ομ , 100 ng/μ DNA 模板 2. Ομ , ddH20 7μ 。本發明建立的LAMP檢測方法的優點①快速、高效擴增約I h即可完成，且產率高；②簡便在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物-焦磷酸鎂沉淀，通過觀察濁度或加入顯色液觀察顏色變化就可判定檢測結果，不需要特殊的、昂貴的儀器設備，操作非常簡便；③高特異性采用六個區段、四條或六條引物，擴增特異性高，保證了結果的準確性。國內外還未見轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法的報道，本發明首次 設計、篩選到了轉基因GA21品系的LAMP檢測引物，并建立了 LAMP檢測方法。
圖I為GA21品系外源基因的序列，加框部分是mepsps基因，陰影部分是linker基因，加下劃線部分是r-act基因。圖2為GA21品系在植物基因與外源基因組合連接處的序列。圖3為3套引物反應溫度的測試結果，A. setl引物；B. set2引物；C. set3引物；Γ6.反應溫度分別為60. 0°C、61. 2°C、61. 9°C >63. 3°C >64. 1°C、64. 8°C。圖4為3套引物在反應溫度為63°C的特異性測定結果，A. setl引物；B. set2引物；C. set3引物；I. ddH20 ；2.非轉基因玉米；3.非轉基因小麥；4.非轉基因大豆；5.5% GA21標準品。圖5為LAMP方法的特異性試驗結果，Al 7分別為ddH20、非轉基因大米、非轉基因小麥、非轉基因玉米、非轉基因大豆、非轉基因番茄、非轉基因馬鈴薯；Bfe分別為 轉基因玉米Mon89034品系、轉基因玉米Tcl507品系、轉基因玉米Mir604品系、轉基因玉米Mon810品系、轉基因玉米Btll品系、5%GA21標準品。圖6為LAMP法靈敏度測定實時監控結果，I. 0. 1% GA21 ；2. 1% GA21 ；3. 5%GA21 ；4. 0. 5% GA21 ；5. 0. 05% GA21 ；6. 0. 01% GA21 ；7.非轉基因玉米。圖7為LAMP法靈敏度測定結果，I.非轉基因玉米；2. 0. 01% GA21 ；3. 0. 05%GA21 ；4. 0. 1% GA21 ；5. 0. 5% GA21 ；6. 1% GA21 ；7. 5% GA21。圖8為送檢樣品中GA21品系的LAMP檢測結果，ΑΓ Ο分別為ddH20、非轉基因玉米、真空玉米棒、冷凍甜玉米、奶香味韓味玉米(進口)、辣味韓味玉米、玉米淀粉、黃大豆、油豆腐、脫脂大豆10分別為香干、正康雞蛋豆奶、正康草莓豆奶、大米、白稞干、米粉干、小麥、面粉、餅干、馬鈴薯淀粉；Cf 10分別為薯片、番茄醬、進口轉基因玉米酒糟柏、進口轉基因玉米I、進口轉基因玉米2、進口轉基因玉米3、進口轉基因玉米4、進口轉基因玉米5、0. 1% GA21、5% GA21。
具體實施方式
I試驗材料
5%、1%、0. 1%GA21標準品購自北京世紀奧科生物技術有限公司。非轉基因玉米、真空玉米棒、冷凍甜玉米、奶香味韓味玉米(進口)、辣味韓味玉米、玉米淀粉、黃大豆、油豆腐、脫脂大豆、香干、正康雞蛋豆奶、正康草莓豆奶、大米、白稞干、米粉干、小麥、面粉、餅干、馬鈴薯淀粉、薯片、番茄醬、進口轉基因玉米酒糟柏、進口轉基因玉米I、進口轉基因玉米2、進口轉基因玉米3、進口轉基因玉米4、進口轉基因玉米5由本實驗室收集。采用CTAB法提取試驗材料的DNA，_20°C保存備用。2主要試劑、耗材
dNTPs溶液(每種核苷酸濃度10 mmol/L)購自廈門泰京公司'Bst DNA聚合酶大片段(8 U/μυ及lOXThermolPol緩沖液為美國NEB公司產品；甜菜堿(5mol/L)、硫酸鎂溶液(lmol/L)為Sigma公司產品；SYBR Green I熒光染料(10000X )為廈門百維信生物科技有 限公司產品；LAMP專用薄壁管、穩定液購自廣州華峰生物科技有限公司。3主要儀器與設備
冷凍混合研磨儀、渦旋儀、水浴鍋、臺式離心機、生物安全柜、梯度PCR儀、實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司的7500)。4 LAMP引物的設計
根據GA21品系特異性序列(圖1)，設計了 2套引物。根據GA21品系在植物基因與外源基因組合連接處(圖2)設計了 I套引物。所有引物(表I)由廣州迪澳生物科技有限公司設計，委托上海生工公司合成。用ddH20將外引物稀釋至lOMmol/L，環引物、內引物稀釋至40Mfflol/L。按外引物環引物內引物體積比為I :1 2的比例混勻內、外、環引物(配制第3套引物混合液時，用ddH20代替另一條環引物)，作為引物混合液，分別標記為Setl、Set2和set30
表I LAMP引物
權利要求
1.一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物，其特征在于所述LAMP檢測引物如下外引物 F3 :5，-GCT GTA GTT GTT GGC TGT-3’外引物 B3 :5，-CCT TTT AAC TGA TGT TTT CAC TT-3，內引物 FIP :5’-TGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AGG TGG AAA GTT CCC AGT TGA-3’內引物BIP :5，-GCA GGT CGA GGT CAT TCA TAT GGA CCA GGT AAT CTT ACC TTT G-3’環引物 LF :5’-CTG CAC TTC CTC TTT AGC ATC C-3’ 環引物 LB :5’ -CTT GAG AAG AGA GTC GGG ATA GTC-3’。
2.—種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測方法，其特征在于利用權利要求I所述的 LAMP檢測引物，以ifei DNA聚合酶大片段啟動環介導等溫擴增，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定檢測結果。
3.根據權利要求2所述的轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測方法，其特征在于環介導等溫擴增的反應條件為63°C溫育lh，80°C保溫5min ;反應體系為10 X ThermoPol緩沖液 2. 5μ ，10 Mmol/L 外引物 F3 O. 5μ ，10 Mmol/L 外引物 Β3 O. 5μ Α0 Mmol/L 環引物 LF.0.5μ Α0 Mmol/L 環引物 LB O. 5μ Α0 Mmol/L 內引物 FIP I. 0μ ,40 Mmol/L 內引物 BIP.1.Ομ , 10 mmol/L dNTPs 3. 5μ ,5 mol/L 甜菜堿 4· Ομ ，100 mmol/L 硫酸鎂 L Ομ ，8 υ/μ Bst DNA 聚合酶大片段 I. Ομ , 100 ng/μ DNA 模板 2· Ομ , ddH20 7μ 。
全文摘要
本發明提供了一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法。所述LAMP檢測引物如SEQ ID NO1-6，利用所述的LAMP檢測引物，以BstDNA聚合酶大片段啟動環介導等溫擴增，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定檢測結果。本發明提供的一種普遍適用于基層實驗室的快速、簡便、準確、特異檢測轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法，快速、高效、簡便，擴增特異性高，保證了結果的準確性。
文檔編號C12N15/11GK102965445SQ20121053089
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者邵碧英, 陳文炳, 曾瑩, 繆婷玉, 彭娟 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心