專利名稱：鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法
技術領域：
本發明屬于獸藥殘留檢測的動物性食品基體標準物質技術領域，更具體涉及一種鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法。
背景技術：
氟甲喹(Flumequine)，CAS42835-25-6。化學名9-氟-6，7-二氫-5-甲基-1-氧代-1H，5H-苯并(i，j)喹嗪-2-羧酸。分子式C14H12NO3F，分子量261.25，結構式如下
氟甲喹結構式 氟甲喹為白色粉末，無臭、無味，不溶于水能在有機溶劑中互溶；用途對革蘭氏陰性菌有較強的抗菌活性，抗菌作用機制為抑制DNA回旋酶，使細菌細胞不再分裂，對細菌顯示選擇性毒性，抗菌作用為殺菌性，主要用于魚、蝦、蟹、鱉由氣單胞菌引起的多種細菌性疾病。如出血病、爛腮病、腸炎等。是目前唯一的不與人類共用的一種廣譜型的抗菌獸藥，也是喹諾酮類產品的第二代抗菌劑，有很強的殺菌活力，對動物細菌性的疾病有很好療效。
水產品主要進口國對水產品中氟甲喹限量要求各不相同，如日本魚片中40μg/kg、鰻魚中600μg/kg，韓國水產品中500μg/kg，歐盟有鰭的200μg/kg、無鰭的600μg/kg，美國則不得檢出，輸美控制2μg/kg，各國限量要求差別很大，該氟甲喹基體標準物擬以接近輸美控制限考慮；而對于用于氟甲喹殘留檢測的動物性食品基體標準物質包括凍干粉樣、加料自然基體標樣、自然(污染)基體標樣等。凍干粉作為質量控制的標準樣品有其優越性，即均勻性好、穩定性好、易保存，但由于凍干粉同實驗室日常分析檢測的樣品形態不同，雖然可采用復水或其它手段使得凍干粉盡可能與日常分析基體相似，但使用凍干粉進行方法驗證與質量控制時常遇到取樣量及提取、凈化行為與日常分析樣品有所不同等缺陷。采用加料(加標)法制備的基體標準物質雖制備簡便，但存在目標物和基體結合情形與真實檢測樣品不完全一致導致提取、凈化行為與日常分析樣本有所不同等問題的可能。
發明目的 本發明的目的是提供一種鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，該方法針對上述凍干粉樣、加料自然基體標樣等的問題和缺陷，采用模擬養殖條件下對生長的活鰻魚給藥后選擇適當時機捕撈、宰殺、勻漿，經均質、阻隔性材料包裝和輻照滅菌、均勻性檢驗、穩定性檢驗和實驗室網絡協同定值，制備出含合適濃度氟甲喹殘留的鰻鱺自然污染基體(非加料、目標物結合狀態與實際檢樣完全一致)、自然原醬狀態(非凍干粉、外觀狀態與實際檢樣完全一致)的實物標樣，避免凍干粉和加料自然基體標準物質的缺陷和問題。可用于相關檢測分析的質量控制，樣品均勻穩定，運輸方便，使用可靠。
本發明鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法采用氟甲喹對活鰻魚進行藥浴，使鰻魚體內含有氟甲喹，將活鰻魚進行宰殺后，取魚肉搗碎勻漿，過篩，裝袋，封口后輻照滅菌，制備得到種鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品；制備的自然基體標準樣品的中氟甲喹的濃度為5～10μg/kg。
本發明的顯著優點是采用模擬養殖條件下對生長的活鰻魚給藥后選擇適當時機捕撈、宰殺、勻漿，經均質、阻隔性材料包裝和輻照滅菌、均勻性檢驗、穩定性檢驗和實驗室網絡協同定值，通過給藥控制和合適采集時機的選擇可獲得預期含量的目標物結合狀態以及外觀狀態與實際檢測樣品一致的含氟甲喹鰻魚自然(污染)基體陽性材料，采用搗碎攪勻、拍擊均質和人工全量攪拌相結合的工藝可以保證材料的均勻性，所用包裝材料和滅菌方法可以防止常溫時魚醬基體腐敗便于實驗室間常溫傳遞，本發明的產品可以在常溫下運輸傳遞，保質期長，該標樣形態及其目標物與基體結合的情形都與真實檢測樣品完全一致，避免了凍干粉和加料自然基體標準物質的缺陷和問題，可用于相關檢測分析的質量控制，樣品均勻穩定，運輸方便，使用可靠，產品具有顯著的經濟價值和市場競爭力。
圖1是鰻魚中氟甲喹含量隨施藥后時間的變化趨勢圖。
具體實施例方式 制備方法的具體步驟如下 (1)在成鰻的水池中加入氟甲喹藥劑溶液后進行藥浴飼養，飼養條件為空氣泵24h増氧；水溫23℃；每立方米水中飼養375條鰻魚，鰻魚大小約為4條/kg；換水率加入氟甲喹藥劑溶液后24小時整100％換清水，此后每天換清水1次，換清水時均不再加入氟甲喹藥劑溶液；飼養時間為投藥后3-6天；所述氟甲喹藥劑溶液的配制為在20mL碳酸氫鈉飽和水溶液中加入0.0420g的純度為99％以上氟甲喹粉，溶解，加水稀釋至200mL；所述氟甲喹藥劑溶液的投放量按照每立方米的水中投放125ml的氟甲喹藥劑溶液； (2)撈出步驟(1)捕撈飼養時間完成后的鰻魚，立即冷凍處死，宰殺去內臟、去頭、去尾、去骨，切段， (3)搗碎勻漿；將切段后的魚肉置于勻漿機中，3000rpm轉速攪成醬樣并勻漿3min，混合所有魚醬；人工攪拌30min混勻；然后進行第二輪的勻漿機3000rpm轉速下3min勻漿； (4)再采用拍擊式均質器進行均質將步驟(3)勻漿后的魚醬裝入拍擊袋，置于拍擊式均質器中，按180/min的頻率，每次拍擊2min后取下揉混袋中醬樣，再拍擊，如此反復拍擊三次；拍擊后醬樣混置于大桶中，再次人工攪拌混合30min； (5)過篩均質后魚醬擠壓通過10目網篩，棄去篩余； (6)將步驟(5)過篩后的魚醬裝入內袋中，再套上外袋；用真空封口機，對裝好醬樣的外袋熱封口； (7)輻照滅菌將包裝好的醬樣輻照滅菌，輻照劑量為12kGy。
所述步驟(2)的階段的長度為每段長3cm。
所述步驟(6)的每袋中裝魚醬25g。
所述步驟(7)滅菌后樣本置于20℃冰箱中貯存。
所述裝袋的包裝材料采用內袋和外包裝袋；所述外包裝袋采用耐蒸煮復合膜袋；所述內袋采用聚乙烯袋；所述耐蒸煮復合膜袋為尼龍-聚丙烯耐蒸煮復合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm；聚乙烯袋為4號聚乙烯膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口。
實施例 實施例1 制備方法的具體步驟如下 (1)在成鰻的水池中加入氟甲喹藥劑溶液后進行藥浴飼養，飼養條件為空氣泵24h増氧；水溫23℃；每立方米水中飼養375條鰻魚，鰻魚大小約為4條/kg；換水率加入氟甲喹藥劑溶液后24小時整100％換清水，此后每天換清水1次，換清水時均不再加入氟甲喹藥劑溶液；飼養時間為投藥后3天；所述氟甲喹藥劑溶液的配制為在20mL碳酸氫鈉飽和水溶液中加入0.0420g的純度為99％以上氟甲喹粉，溶解，加水稀釋至200mL；所述氟甲喹藥劑溶液的投放量按照每立方米的水中投放125ml的氟甲喹藥劑溶液； (2)撈出步驟(1)捕撈飼養時間完成后的鰻魚，立即冷凍處死，宰殺去內臟、去頭、去尾、去骨，切段， (3)搗碎勻漿；將切段后的魚肉置于勻漿機中，3000rpm轉速攪成醬樣并勻漿3min，混合所有魚醬；人工攪拌30min混勻；然后進行第二輪的勻漿機3000rpm轉速下3min勻漿； (4)再采用拍擊式均質器進行均質將步驟(3)勻漿后的魚醬裝入拍擊袋，置于拍擊式均質器中，按180/min的頻率，每次拍擊2min后取下揉混袋中醬樣，再拍擊，如此反復拍擊三次；拍擊后醬樣混置于大桶中，再次人工攪拌混合30min； (5)過篩均質后魚醬擠壓通過10目網篩，棄去篩余； (6)將步驟(5)過篩后的魚醬裝入內袋中，再套上外袋；用真空封口機，對裝好醬樣的外袋熱封口； (7)輻照滅菌與微生物檢測將包裝好的醬樣輻照滅菌，輻照劑量為12kGy。
所述步驟(2)的階段的長度為每段長3cm。
所述步驟(6)的每袋中裝魚醬25g。
所述步驟(7)滅菌后樣本置于20℃冰箱中貯存。
所述裝袋的包裝材料采用內袋和外包裝袋；所述外包裝袋采用耐蒸煮復合膜袋；所述內袋采用聚乙烯袋；所述耐蒸煮復合膜袋為尼龍-聚丙烯耐蒸煮復合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm；聚乙烯袋為4號聚乙烯膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口。
實施例2 制備方法的具體步驟如下 (1)在成鰻的水池中加入氟甲喹藥劑溶液后進行藥浴飼養，飼養條件為空氣泵24h増氧；水溫23℃；每立方米水中飼養375條鰻魚，鰻魚大小約為4條/kg；換水率加入氟甲喹藥劑溶液后24小時整100％換清水，此后每天換清水1次，換清水時均不再加入氟甲喹藥劑溶液；飼養時間為投藥后6天；所述氟甲喹藥劑溶液的配制為在20mL碳酸氫鈉飽和水溶液中加入0.0420g的純度為99％以上氟甲喹粉，溶解，加水稀釋至200mL；所述氟甲喹藥劑溶液的投放量按照每立方米的水中投放125ml的氟甲喹藥劑溶液； (2)撈出步驟(1)捕撈飼養時間完成后的鰻魚，立即冷凍處死，宰殺去內臟、去頭、去尾、去骨，切段， (3)搗碎勻漿；將切段后的魚肉置于勻漿機中，3000rpm轉速攪成醬樣并勻漿3min，混合所有魚醬；人工攪拌30min混勻；然后進行第二輪的勻漿機3000rpm轉速下3min勻漿； (4)再采用拍擊式均質器進行均質將步驟(3)勻漿后的魚醬裝入拍擊袋，置于拍擊式均質器中，按180/min的頻率，每次拍擊2min后取下揉混袋中醬樣，再拍擊，如此反復拍擊三次；拍擊后醬樣混置于大桶中，再次人工攪拌混合30min； (5)過篩均質后魚醬擠壓通過10目網篩，棄去篩余； (6)將步驟(5)過篩后的魚醬裝入內袋中，再套上外袋；用真空封口機，對裝好醬樣的外袋熱封口； (7)輻照滅菌將包裝好的醬樣輻照滅菌，輻照劑量為12kGy。
所述步驟(2)的階段的長度為每段長3cm。
所述步驟(6)的每袋中裝魚醬25g。
所述步驟(7)滅菌后樣本置于-20℃冰箱中貯存。
所述裝袋的包裝材料采用內袋和外包裝袋；所述外包裝袋采用耐蒸煮復合膜袋；所述內袋采用聚乙烯袋；所述耐蒸煮復合膜袋為尼龍-聚丙烯耐蒸煮復合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm；聚乙烯袋為4號聚乙烯膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口。
以下是本發明的具體實施實驗和效果數據，以進一步充分說明本發明，但是本發明不僅限于此。
1材料與方法 1.1材料 實驗用鰻魚，福建省長樂海林水產養殖場人工條件下飼養的成鰻(約4條/kg)，人工轉移至給藥實驗池；實驗用藥為氟甲喹粉，純度99％，杭州久恒生物化學科技有限公司；飽和碳酸氫鈉溶液適量(稍過量)碳酸氫鈉(AR)加水溶解配制飽和溶液。
包裝材料為尼龍/聚丙烯(PA/CPP)耐蒸煮復合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm，為外包裝袋；4號聚乙烯(PE)膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口用作內袋。
1.2儀器設備 高效液相液相色譜儀，Agillent 1100型；液相色譜串聯質譜儀，WatersUPLC/Premier，帶電噴霧電離(ESI)源；渦旋振蕩器，德國IKA；離心機，ANKE TDL-5，5000r/min，上海安亭科學儀器廠；5000r/min；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；攪拌型勻漿機，丹麥FOSS 2094型；拍擊均質器，stomacher3500型，英國Seward；真空包裝機，SC-300A型，安溪縣三和茶葉機械廠；培養箱，KB720型，德國Binder；Co60-γ射線輻照裝置，設計容量50萬居里，福建省康普頓輻照技術有限公司；冰柜，BC/BD-718A，青島海爾特種電冰柜有限公司。給藥實驗用空氣泵，漁亭牌ACO-002型，浙江森森實業有限公司。不銹鋼網篩10目。
1.3給藥實驗 給藥實驗條件小實驗池，0.67m×0.47m，注水深0.10m。空氣泵24h増氧；水溫23℃；每池12條鰻魚(4條/kg)；換水率施藥24小時后100％換水；此后每天換水1次，換清水時均不再加入氟甲喹藥劑溶液。
給藥方式藥浴。稱取0.0210g氟甲喹粉，加10mL飽和碳酸氫鈉溶液溶解，加水稀釋至100mL。分別取該溶液4.00mL、10.0mL潑灑于不同小實驗池中。
監控樣品給藥后2.5h、5h、10h、24h、29h、34h、48h、58h、72h、96h、120h各取一條鰻魚，立即冷凍處死。宰殺去內臟、去頭、去尾、去骨，切段(每段長約3cm)，搗碎勻漿，裝入PE自封袋中，置于20℃冰箱保存。檢測時于4℃冰箱解凍后取出回溫。
1.4鰻魚中氟甲喹檢測 1.4.1提取與凈化 稱取5g(精確到0.01g)均質好的試樣于50mL具塞塑料離心管，加入15mL樣品提取劑，于渦旋振蕩器振蕩提取1min，然后超聲10min，振搖5min，4500r/min離心5min，移出上清液。在殘渣中再加入10mL提取液，重復以上步驟。合并上清液并定容至25mL。取10mL于氮吹管，40℃下氮吹至近干，加入2mL 0.1％甲酸水溶液，渦旋振蕩30s，為待凈化提取液。
待凈化提取液以約1mL/min的流速全部過已經用甲醇(3mL)和水(3mL)活化、平衡過的Oasis HLB固相萃取小柱，再以2×3mL的5％甲醇水溶液洗滌氮吹管(盛待凈化提取液的容器)后淋洗固相萃取小柱，繼續抽干約10min，以3mL甲醇洗脫，收集洗脫液置于40℃下氮吹至近干，以乙腈+0.1％甲酸水溶液(2+8，v/v)定容至2mL，渦旋振蕩2min，3500r/min離心5min，過0.22μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜進行上機測定分析。
1.4.2儀器參數及測定條件 1.4.2.1色譜測定條件 1)色譜柱Acquity UPLC BEH C18柱，55mm×2.1mm×1.7μm； 2)色譜柱溫度35℃； 3)流動相A5mmol/L乙酸銨+0.2％甲酸溶液，B甲醇； 4)流速0.2mL/min； 5)進樣量10μL。流動相梯度見表1。
表1喹諾酮類藥物色譜分離梯度洗脫條件 1.4.2.2質譜條件 根據喹諾酮類藥物的分子結構，選擇ESI(+)作為電離模式，將標準品配成濃度為100ng/mL的乙腈-水溶液(1∶1)，分別對電離電壓、錐孔電壓、源溫度、脫溶劑溫度、碰撞能量等條件進行了優化，采用全掃描方式。其質譜條件參數為 電離方式ESI正離子模式；電離電壓(Capillary)3.50kV；錐孔電壓(Cone)35V；離子源溫度(Source Temperature)120℃；錐孔反吹氣流量(Cone Gas Flow)45L/h；脫溶劑氣溫度(Desolvation Temperature)350℃；脫溶劑氣流量(Desolvatipn Gas Flow)852L/h。
監測離子對見表2 表2監測離子對
1.4.3定性和定量分析 1.4.3.1定性測定 進行樣品測定時，如果檢出的質量色譜峰保留時間與標準品一致，并且在扣除背景后的樣品譜圖中，各定性離子的相對豐度與濃度接近的同樣條件下得到的標準溶液譜圖相比，誤差不超過表3規定的范圍，則可判斷樣品中存在對應的被測物。
表3定性確證時相對離子豐度的最大允許誤差 1.4.3.2定量分析 以0.00、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00ng/mL標準溶液進樣繪制標準工作曲線。進樣等體積的試劑空白，陰性控制樣、待測樣(不超過20個)、陽性控制樣，記錄峰面積或峰高，外標法定量。
僅在滿足以下條件時定量是有效的 1)標準溶液的保留時間與未知物的保留時間相差不超過0.15min； 2)未知物響應信號的信噪比大于10； 3)標準曲線的相關系數大于0.9900。
1.5候選陽性材料的采集、均質 采集5μg/kg-10μg/kg氟甲喹含量水平的鰻魚，冷凍處死。宰殺去內臟、去頭、去尾、去骨，切段(每段長約3cm)，-20℃冷凍保存，作為候選陽性材料。
將冷凍狀態鰻魚樣本轉移至4℃冰箱解凍后置于勻漿機中，轉速3000rpm攪成醬樣并勻漿3min，混合所有醬樣。人工攪拌約30min混勻。然后進行第二輪的勻漿機3min勻漿。
取適量醬樣裝入拍擊袋，置于拍擊式均質器中，按180/min的頻率，每次拍擊2min后取下揉混袋中醬樣，再拍擊，如此反復拍擊三次。拍擊后醬樣混置于大桶中，再次人工攪拌混合30min。
過篩，均質后樣本擠壓通過10目網篩。棄去篩余。
1.6均勻性材料的裝袋、封口、上簽 取均質過篩后醬樣裝入內袋中，每袋中裝25g，再套上外袋。用真空封口機，對裝好醬樣的外袋熱封口。貼上帶編號的樣品標簽。
1.7輻照滅菌與微生物檢測 將包裝好的醬樣輻照滅菌，輻照劑量為12kGy。滅菌后樣本置于-20℃冰箱中貯存。包裝好樣品在輻照前后取樣進行微生物學檢測以評價滅菌與包裝防菌效果。
1.8均勻性檢驗 按總樣本單元數N的2×N1/3隨機抽取樣本，按1.4進行樣品前處理和液相色譜-串聯質譜檢測，每個樣品重復測試三次。
將測試結果進行均勻性統計，采用方差分析法(F-檢驗)檢驗樣品的均勻性。
1.9穩定性檢驗 穩定性實驗設計為經典穩定性研究，即同時制備的樣品在相同條件下隨著時間的推移進行測量。
在沒有嚴格確定的動力學機理時，采用線性擬合作為穩定性穩定性研究的基本模型Y＝β0+β1X+ε，其中β0和β1為回歸系數，ε為隨機誤差分量；X為時間變量，Y為AOZ含量。按照GB 15000.3給出第一種方法可以計算可以回歸參數b1(斜率)和b0(截距)，通過誤差分析計算b1的標準偏差s(b1)。用s(b1)和t0.95，n-2檢驗b1的顯著性以判斷樣品穩定性。即|b1|＜t0.95，n-2·s(b1)時斜率是不顯著的，判為未觀測到不穩定性，反之亦然。第二種方法采用F檢驗法檢驗一元線性回歸模型的顯著性。通過評估最后的回歸方差分析表，對于95％置信水平，當Significance F≥0.05時表示回歸是不顯著的，判為未觀測到不穩定性。如第一部分1.9所述，此時計算s(b1)所用的直線上點的標準偏差s可以方便地從線性回歸方差分析表所給出的殘差MS開平方得到。因此，我們采用了第二種方法進行穩定性研究的分析計算以判斷樣品的穩定性。同時也可以計算s(b1)。
1.10定值與不確定度評估 按上述研制的技術路線制得一批鰻鱺肌肉原醬樣，根據中華人民共和國國家標準GB/T15000.3-2008“標準樣品工作導則(3)標準樣品定值的一般原則和統計方法”中有關技術及要求，對氟甲喹殘留質量控制樣品進行定值。
廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心食品實驗室等12個實驗室認證認可實驗室參加了協同定值。均采用LC-MSMS方法檢測。檢測結果經過經柯克倫檢驗、格拉布斯檢驗后取平均結果定值。特性值不確定度(UCRM)由測定值標準不確定度(uchar)、瓶間標準不確定度(ubb)、長期穩定性標準不確定度(ulis)和短期穩定性標準不確定度(usts)合成并擴展(包含因子k＝2)而得。
2結果與分析 2.1給藥實驗 按表4進行了給藥實驗。給藥后按1.3取監控樣、按1.4檢測，繪制不同給藥量試驗的鰻魚肌肉中氟甲喹含量，檢測結果隨施藥后時間的變化趨勢線見圖1。
表4給藥實驗
圖1顯示，施藥后，鰻魚體內氟甲喹濃度隨時間推移而升高，24h后魚池全量換新鮮水(不含氟甲喹)，之后鰻魚體內氟甲喹濃度隨時間推移而降低。約50h后鰻魚體內氟甲喹濃度降至較低濃度，基本降至拐點，此后魚體內氟甲喹濃度變化緩慢。
希望所制樣品中氟甲喹含量落在5～10μg/kg范圍的預期值。根據以上試驗，試驗號1(水體中氟甲喹初始濃度65.2μg/kg)施藥2天后(50h后)至藥后第6天，鰻魚體內氟甲喹濃度仍達20μg/kg以上，不適宜于用作候選陽性材料；實驗號1(水體中氟甲喹初始濃度26.2μg/kg)施藥2天后(50h后)至藥后第6天，鰻魚體內氟甲喹濃度基本維持在10μg/kg以下，均適于采集陽性材料，尤其是施藥3天后。
在鰻魚養殖過程中，用藥方式主要有全池潑灑與混入餌料投喂兩種。為便于觀測與實驗，我們原計劃在福州附近的長樂海林養鰻場進行施藥實驗，然而，一個大池中的養殖鰻魚以數噸計，由于成本因素顯然不宜為獲取本項目所需的一定量的候選陽性材料對大池施藥。為此改用塑料箱作實驗池，由大池移取12條左右成鰻于小實驗池中進行施藥實驗。由于鰻魚轉移至實驗池后拒絕進食，因此不能采取混入餌料投喂的方式施藥；曾采取口灌方式用藥，結果口灌的每只鰻魚由于回吐、掙扎、滑溜等實際上難以在有限的口灌時間內使之攝入基本等量的藥物，致使后續的監測數據波動太大而無法評估實驗結果；最后選擇潑灑藥浴的給藥方式進行給藥試驗。由于小池試驗投魚量及成本限制，藥浴后每次只取單條鰻魚作為檢測樣品，鰻魚的個體差異也會使監測結果有所波動。試驗發現，初始施藥濃度越高監測結果波動幅度越大。然而在本發明適配的初始施藥濃度水平下，鰻魚的個體差異導致監測結果波動的幅度是可以接受的(參見圖1)。
2.2輻照與包裝阻隔性效果 按1.7所述述取樣進行微生物學檢驗以考察輻照滅菌和包裝防菌效果，檢驗結果見表5。
表5輻照前、后及保溫后微生物檢驗結果
從上述檢驗結果看，樣品經一系列制備操作步驟后，菌落總數達到108cfu/g，須經12kGy輻照后才能達到＜10cfu/g的理想滅菌效果。對12kGy輻照后已完全滅菌的成品進行保溫試驗，按商業無菌保溫試驗時間10天后菌檢結果＜10cfu/g，為保險起見加做了37℃37天的保溫試驗菌檢結果仍＜10cfu/g，可見本發明采用的包裝的阻隔性可以滿足防菌要求。
常用滅菌方法有加熱滅菌和輻照滅菌等方法，考慮到加熱滅菌有容易引起基體物質變性、熱漲壓力導致包裝物破損等缺點(如對熱敏感物質也不適用)，本發明選用輻照滅菌的工藝。
由于當地能提供輻照服務的輻照公司以3kGy整數倍的劑量提供輻照服務，從輻照結果數據(表3)可知，每3kGy劑量的輻照大約可使菌落總數下降2個數量級。輻照前應先檢測樣品中菌落總數含量，并以每3kGy劑量的輻照使菌落總數下降2個數量級推算合適的輻照劑量。
2.3均勻性研究 按1.8所述隨機抽取均勻性檢驗樣本，均勻性實驗的總樣本數共436個，順序編號后利用隨機數表隨機抽取16個樣本進行均勻性實驗。均勻性檢驗數據見表6，按F檢驗法進行均勻性統計分析，統計匯總數據見表7，方差分析結果見表8。
表6均勻性檢驗結果
表7每瓶樣品的統計匯總數據
表8鰻魚中氟甲喹的瓶間均勻性研究方差分析
表8方差分析結果表明F＝1.382＜1.992＝F0.05(15，30)，P-value＝0.215＞0.05。結果表明瓶間差異不顯著。即氟甲喹含量瓶間均勻性符合要求。
由于機械勻漿受到容器容量的限制，無法全量一次勻漿，因此需要在各輪機械勻漿后增加人工全量攪拌操作以保證整體均勻。同時由于鰻魚肉醬中小骨刺和小部分未攪碎鰻魚皮片的存在影響樣品均勻性，同時小骨刺是導致包裝物破損的潛在威脅，應當將小骨刺和小部分未攪碎鰻魚皮片從醬樣中剔除，本項目遂采用過篩辦法予以解決，即均質后樣本擠壓通過10目網篩，棄去篩余。
2.4穩定性研究 2.4.1短期穩定性 安排了兩次短期穩定性試驗。第一次為冬天2月份由出差赴京人員來回全程(2月23日、24日，福州-北京飛機來回，兩城市中心-機場分別來回兩次汽車運輸)攜帶樣品，樣品(標記為“京來回”)回福州后與正常凍藏樣同條件保管，5月份同時檢測。第二次為夏季7月7日將樣品交由“中鐵快運”發送至海南省海口市，海南檢驗檢疫局技術中心于7月14日收到后再交由“申通快遞”發回福建省福州市，福建檢驗檢疫局技術中心于7月17日收到抵達福州的樣品，樣品(標記為瓊來回)收到后置于儲存正常凍藏樣品的冰箱中至8月份檢測。兩次短期穩定性試驗樣品在傳遞途中均未采取任何降溫和保溫措施，第二次短期穩定性運輸試驗時值7月份，南方氣溫高，短期穩定性試驗樣品來回福州-海口間樣品運輸時間長達整整10天。測試時每個樣品均進行三平行測定。測定數據見表9。第一次、第二次短期穩定性試驗檢測數據單因素統計分析結果分別見表10、表11。在α＝0.05顯著性水平下，“京來回”樣與“凍藏樣”的結果比較、“瓊來回”樣與“凍藏樣”比較，均無顯著性差異。
表9兩次短期穩定性試驗檢測結果
表10第一次短期穩定性單因素方差分析
表11第二次短期穩定性單因素方差分析
此外因協同定值和組織能力驗證及實驗室檢測質量控制技術培訓需要在常溫條件下給19個實驗室共29次傳遞了本文研制樣品(其中省外4家，省內15家)從反饋的樣品接收狀態看，所有實驗室均未有諸如脹包、樣品變質等不正常樣品狀態的報告。14個省內外認可實驗室參加了協同定值實驗，定值檢測檢測結果均通過了科克倫檢驗和格拉布斯檢驗，均為正確值；15個省內實驗室參加了能力驗證計劃，其中一個實驗室結果為可疑值，其余均為滿意值。從保溫試驗結果看也沒有微生物腐敗情況出現。綜合評估認為所制樣品可以常溫傳遞。
2.4.2長期穩定性 樣品長期凍藏于20℃冰箱中。每月取樣一次進行檢測。從1月份就已開始穩定性研究，其中5月份測定樣品為實際經過運輸過程的“京來回”樣品。8月份測定樣品是夏季郵寄到海南海口后再回寄到福建福州的“瓊來回”樣品。另外，由于測量是在(實驗室內)再現性條件下進行的，其中也包括了測量的不穩定性。
穩定性研究的測量數據見表12，由于定值(7月份定值)之前已經開始了穩定性研究，因此以定值時間X值為0，則之前時間的X值為負值。回歸系統R、R平方、修正R平方、標準誤差、觀測值個數等分析結果摘要見表13；根據表13的匯總數據，進行方差分析，結果見表14。
表12鰻魚中氟甲喹穩定性研究的測量數據
表13鰻魚中氟甲喹的穩定性研究的分析結果摘要
表14鰻魚中氟甲喹的穩定性研究方差分析
Significance F＝0.556＞0.05，表示回歸是不顯著的，認為未觀測到不穩定(對于95％置信水平，Significance F＜0.05就成為顯著的)。
2.4.3穩定性不確定度 長期穩定性試驗中在第5個月和第8個月測定時樣品分別為冬天北方、夏天南方運輸條件的實際運輸樣。另外，由于測量是在(實驗室內)再現性條件下進行的，其中也包括了測量的不穩定性。
應用GB/T 15000.3-2008標準8.5方法，即穩定性不確定度 ults＝s(b1)×t 然而， 由表14得到殘差的MSres值，因此s(b1)可以計算出。結果如表15。
表15s(b1)計算結果
2.5定值與不確定度評定 2.5.1定值 有廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心食品實驗室等共12個認可實驗室為本殘留質量控制樣品協同定值。本項目向每一個參加協同定值的實驗室發放實驗樣品、結果報告單，參與定值的實驗室雖然檢測環境不同、檢測儀器條件不同、檢測人員不同，但均采用LC-MSMS進行測定(n＝3)，具體數據見附件2。定值結果匯總于表16。
表16定值結果
對所得數據進行檢驗分析，包括的步驟有(1)檢驗實驗室平均值之間顯著性差異以此來決定是否應該求出單個數值的平均值或實驗室平均值的均值；(2)檢驗根據(1)中決定選取的數據組的正態性并找出異常值；(3)檢驗全部數據組中異常的實驗室的方差。檢驗過程如下 (1)先對所有數據進行柯克倫(Cochran)檢驗。
給定p個由相同的n次重復測試結果計算的標準偏差Si，柯克倫(Cochran)檢驗的定義為
柯克倫的結果判定規則為
在p＝12，n＝3時，柯克倫的臨界值為C0(1％)＝0.475，C0(5％)＝0.392，12個實驗室的柯克倫(Cochran)檢驗的結果為0.3358，即C＝0.3358＜0.392＝C0(5％)。則12個實驗室結果通過了科克倫檢驗。
(2)對12個實驗室的均值進行單值格拉布斯(Grubbs)檢驗 將p個數據由小到大排列為x1、x2、……xp-1、xp，用下列公式計算統計量G1
在n＝p＝12時，單值格拉布斯(Grubbs)的臨界值G1(1％，12)＝2.636，G1(5％，12)＝2.412，而單值格拉布斯(Grubbs)檢驗結果G11＝1.518，G1p＝1.326，均＜G1(5％，n)。即各實驗室的均值均可保留以參加下一步雙值格拉布斯(Grubbs)檢驗。
(3)對12個單元的均值進行雙值格拉布斯(Grubbs)檢驗 雙值格拉布斯(Grubbs)統計量G2p用于檢驗最大的兩個值是否為離群值，
其中S02是原數組的方差，S(p-1，p)2是p個數據去除最大兩值后的方差。統計量G21用于檢驗最小兩值是否為離群值，
其中S(1，2)2是p個數據去除最小兩值后方差。雙值格拉布斯檢驗結果判定如下
在n＝12時，雙值格拉布斯(Grubbs)的臨界值G0(1％)＝0.1738，G0(5％)＝0.2537，而雙值格拉布斯(Grubbs)結果G21＝44.17，G2p＝39.20，因此所有單元的數據均為正確值，均可以保留并參與定值。
本項目定值最終是協同定值實驗室提供結果的平均值。見表16。
2.5.2不確定度評定 特性值不確定度的評定按照GB/T 15000.3-2008，考慮了測定、均勻性、穩定性對特性值總不確定度的貢獻，即通過測定值標準不確定度(uchar)、瓶間標準不確定度(ubb)、長期穩定性標準不確定度(ults)和短期穩定性標準不確定度(ustsk)的合成并擴展(包含因子k＝2)來評定特性值不確定度(UCRM)。用下式表示 式中各不確定度分量及其合成計算如下 2.5.2.1由協同定值實驗室所帶來的批測定的不確定度uchar的計算 實驗室數p＝12，檢測結果總平均值即
與平均值的總均值有關的合成標準不確定度的主要分量是標準偏差
而合成不確度為
計算結果s為1.011，uchar＝0.292。
2.5.2.2由瓶間均勻性所帶來的不確定度ubb的計算 在均勻性研究中，瓶間均勻性已被驗證(見表6～表8)。
表8顯示，MSamong＝0.587，MSwithin＝0.425， 瓶間方差用的計算 瓶間標準偏差是該方差的平方根 重復性標準偏差 由瓶間均勻性所帶來的不確定度 2.5.2.3由穩定性所帶來的不確定度ults的計算 如在穩定性數據中無顯著趨勢，假設特性值Y從初始值Y0以一個常數b1線性降解，b1是相對降解速率，為時間X的函數Y(b0，b1，X)＝Y0(1+b1X)。特性值的不確定度可通過將自變量Y0、X和b1的不確定度傳播給因變量Y得到。在給定的有效期X沒有顯著降解的情況下，參考Thomas P.J.Linsinger等人的報道，穩定性不確定度ults＝X×u(b1)。
表15已給出S(b1)＝0.1364，有效期X＝6(月)(即t＝6)的長期穩定性的不確定度為ults＝sb·t＝sb×6＝0.1364×6＝0.8184。
2.5.2.4特性值不確定度的合成與擴展 綜上，由于采用協同定值，通過郵政網絡將候選標準樣品分發給各參加協同定值的實驗室，所得到的一系列測量值已包含了運輸不穩定性造成的附加不確定度，另外，在進行穩定性實驗時，第5個月和第8個月測定時樣品已是實際傳遞后樣品，在穩定性不確定度中也包括了運輸不穩定性造成的不確定度，即ults的計算已經包含了usts，這里不再單獨考慮usts。
合成不確定度由上述各不確定度分量計算合成不確定度 在置信水平為95％時，k＝2。特性值擴展不確定度為UCRM＝2×0.638＝1.28。
該不確定度是根據6個月的有效期確定的。如果材料的穩定性得到進一步證明，則有效期還可延長。
本候選標準樣品特性值為(7.08±1.28)μg/kg。
2.6實際應用 已有2個實驗室試用本文研制的標準物質進行檢測質量控制，繪制質量控制圖。福建檢驗檢疫局技術中心應用本標準物質成功組織了省域相關實驗室的鰻魚中氟甲喹檢測能力驗證，參考英國中央實驗室(FAPAS)方法，以Michael Thompson提出的再現性標準偏差方程抓本含量水平為σp＝0.22C(式中C抓中位置)計算的標準偏差靶值σp代替標準四分位距，按穩健統計技術統計得Z比分數分布圖(直方圖)見圖2。實際應用時樣品均為常溫傳遞。結果表明，樣品應用有效，比同類醬樣使用更加方便。
3小結 通過給藥控制和合適采集時機的選擇可獲得預期含量的代表實際樣品原狀態的原漿態含氟甲喹鰻魚自然(污染)基體陽性材料，采用搗碎攪勻、拍擊均質和人工全量攪拌相結合的工藝可以保證材料的均勻性，所用包裝材料和滅菌方法可以防止常溫時醬樣腐敗便于實驗室間常溫傳遞。
權利要求
1.一種鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，其特征在于采用氟甲喹對活鰻魚進行藥浴，使鰻魚體內含有氟甲喹，將活鰻魚進行宰殺后，取魚肉搗碎勻漿，過篩，裝袋，封口后輻照滅菌，制備得到種鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品。
2.鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，其特征在于所述方法制備的自然基體標準樣品的中氟甲喹的濃度為5～10μg/kg。
3.根據權利要求1所述的鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，其特征在于所述裝袋的包裝材料采用內袋和外包裝袋；所述外包裝袋采用耐蒸煮復合膜袋；所述內袋采用聚乙烯袋。
4.根據權利要求2所述的鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，其特征在于所述耐蒸煮復合膜袋為尼龍-聚丙烯耐蒸煮復合膜袋，120mm×110mm，膜厚0.06mm；聚乙烯袋為4號聚乙烯膜自封袋，120mm×85mm，膜厚0.04mm，剪去自封口。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，其特征在于制備方法的具體步驟如下(1)在成鰻的水池中加入氟甲喹藥劑溶液進行藥浴飼養，飼養條件為空氣泵24h增氧；水溫23℃；每立方米水中飼養375條鰻魚，鰻魚大小為4條/kg；換水率加入氟甲喹藥劑溶液后24小時整100％換清水，此后每天換清水1次，換清水時均不再加入氟甲喹藥劑溶液；飼養時間為投藥后飼養3-6天；所述氟甲喹藥劑溶液的配制為在20mL碳酸氫鈉飽和水溶液中加入0.0420g的純度為99％以上的氟甲喹粉，溶解，加水稀釋至200mL；所述氟甲喹藥劑溶液的投放量按照每立方米的水中投放125ml的氟甲喹藥劑溶液；
(2)撈出步驟(1)飼養時間完成后的鰻魚立即冷凍處死，宰殺去內臟、去頭、去尾、去骨，切段，
(3)搗碎勻漿；將切段后的魚肉置于勻漿機中，3000rpm轉速攪成魚醬并勻漿3min，混合所有魚醬；人工攪拌30min混勻；然后進行第二輪的勻漿機3000rpm轉速下3min勻漿；
(4)再采用拍擊式均質器進行均質將步驟(3)勻漿后的魚醬裝入拍擊袋，置于拍擊式均質器中，按180/min的頻率，每次拍擊2min后取下揉混袋中魚醬，再拍擊，如此反復拍擊三次；拍擊后魚醬混置于大桶中，再次人工攪拌混合30min；
(5)過篩均質后魚醬擠壓通過10目網篩，棄去篩余；
(6)將步驟(5)過篩后的魚醬裝入內袋中，再套上外袋；用真空封口機，對裝好魚醬的外袋熱封口；
(7)輻照滅菌將包裝好的魚醬輻照滅菌，輻照劑量為12kGy。
6.根據權利要求5所述的鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的階段的長度為每段長3cm。
7.根據權利要求5所述的鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，其特征在于所述步驟(6)的每袋中裝魚醬25g。
8.根據權利要求5所述的鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，其特征在于所述步驟(7)滅菌后樣本置于-20℃冰箱中貯存。
全文摘要
本發明提供一種鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品的制備方法，屬于獸藥殘留檢測的動物性食品基體標準物質技術領域。解決了合適濃度的自然基體動植物陽性候選材料難以自由獲取、動物肌肉原醬基體標準樣品容易腐敗變質的問題。本發明采用氟甲喹對活鰻魚進行藥浴，使鰻魚體內含有氟甲喹，將活鰻魚進行宰殺后，取魚肉搗碎勻漿，過篩，裝袋，封口后輻照滅菌，制備得到種鰻鱺肌肉原醬中氟甲喹殘留自然基體標準樣品；制備的自然基體標準樣品的中氟甲喹的濃度為5～10μg/kg。本發明制備出的鰻鱺自然污染基體實物標樣，避免凍干粉和加料自然基體標準物質的缺陷和問題。可用于相關檢測分析的質量控制，樣品均勻穩定，運輸方便，使用可靠。
文檔編號A23L1/015GK101696918SQ20091030958
公開日2010年4月21日 申請日期2009年11月12日 優先權日2009年11月12日
發明者余孔捷 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心