專利名稱：一種肝原代細胞的分離和培養方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及肝原代細胞的分離和培養方法。
背景技術：
肝臟是藥物代謝的主要場所，大部分藥物經口服或肌注后經血液傳輸首先到達肝 臟進行代謝然后進入血液循環，這就是肝臟的首過效應。因為肝臟是重要的體內代謝部位， 藥物的轉化大部分在肝臟內完成，所以新藥的初期研發必需要研究肝臟對藥物代謝的影 響。其主要內容包括藥物在肝臟內的代謝分解速度，主要的代謝途徑，主要代謝產物以及參 與該化合物代謝主要肝臟酶體系。同時藥物對肝臟的毒性作用也需做出相應的評估，所有 這些信息對于藥物的早期篩選都有著重要的意義。肝原代細胞有以下優點可同時獲得大量性狀同一的標本，與體內情況保持一致， 可以在接近生理狀態的情況之下研究藥物的代謝等等。經過夾心培養處理的長期培養的單 層肝原代細胞可形成類似膽小管結構并表達出肝細胞特有的載體，從而可進一步用于化合 物經膽汁排泄的可能性進行評價。特別是人肝原代細胞可以作為藥物早期篩選的最佳模型 來研究藥物對肝細胞的活性影響。肝原代細胞的分離國外已經有報道，通過進行肝灌流獲得肝原代細胞，采用膠原 凝膠夾層法培養肝原代細胞。國內現在原代肝細胞的分離只能在完整的肝臟組織下才能操 作，對于肝臟組織塊或者細小的肝組織的灌流未見報道，對于夾心法培養原代肝細胞也只 采用膠原凝膠的方法。肝原代細胞的分離和培養在國內還沒有形成一套特定而成熟的分離和培養體系， 特別是對肝臟組織塊的肝細胞分離還沒有報道，國內制備肝原代細胞還屬空白領域，僅僅 具備活體原位灌流技術無法滿足作為藥物篩選的需求，特別是人的肝原代細胞由于倫理方 面的限制，獲得整塊人肝的可能性幾乎為零，但藥物篩選最好的載體就是人的肝原代細胞， 最接近藥物作用的實際情況，國內在人肝細胞的研究這方面幾乎為零，這對國內藥物研發 領域的企業和科研院所來說成為了一個阻礙其藥物研發進度的關鍵點，通過對肝原代細胞 的分離和培養技術難點的突破，將極大的促進藥物研發的進度和效率，也可以降低研發的 成本。
發明內容
本發明的目的是提供一種肝原代細胞的分離和培養方法，它能解決國內制備肝原 代細胞領域的空白，肝細胞的培養采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持較長時間的活力， 解決了肝細胞沒有像細胞系那樣的增殖性而活性無法保持的問題。為了解決背景技術所存在的問題，本發明是采用以下技術方案(a)將切除的不 完整肝臟組織塊通過粘性溶劑封閉多余的血管管路，只保留一個可供灌流的進液血管口和 一個出液血管口 ；(b)插入合適大小的針頭，用粘性溶劑封住，等粘性溶劑干之后再涂一 層粘性溶劑以防漏液；(c)放入36 42°C水浴鍋內漂浮的容器中，開始灌輸36 42°C的3無鈣灌流液，控制灌流速度和灌流時間；(d)清空無鈣灌流液，灌輸36 42°C的0.03 0. 10%膠原酶灌流液，控制灌流速度和灌流時間；(e):將完全消化好組織分離出肝細胞， 通過Percoll溶液離心獲得純化的仍保持活性的原代肝細胞。所述的無鈣灌流液(ρΗ7·4)配方為=NaCl 8. 0 9. Og · Γ1 KC10. 4 0. 6g · Γ1 HEPES2. 0 4. Og · L-1 NaOH 0. 2 0. 4g · L-1 維生素 C 50 100 μ g · mL_1 胰島素 2 4μ g · mL-1，流速 25 50ml/min，時間 5 20min。所述的酶灌流液(ρΗ7·6)配方為NaCl 3. 0 5. Og · L—1 KC10. 2 0. 6g · Γ1 CaCl2O. 5 1. Og · L-1 HEPES 20 30g · L-1 Na0H2. 5 5. Og ·廠1 膠原酶濃度 0. 04 0. 08% 維生素 C 50 ~ 100 μ g · mL_1 胰島素 2 4 μ g · mL-1，流速 25 50ml/min，時間 5 20min。所述的Percoll分離液是90 % Percoll配制是9體積的Percoll力卩1體積的 PBS(10*)，然后加入培養液配成20 70% Percoll溶液。本發明具有以下以下有益效果解決國內制備肝原代細胞領域的空白，肝細胞的 培養采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持較長時間的活力，解決了肝細胞沒有像細胞系 那樣的增殖性而活性無法保持的問題。
圖1是本發明狗肝細胞培養4小時貼壁的示意圖；圖2是本發明狗肝細胞培養M小時后的示意圖；圖3是本發明猴肝細胞培養4小時后的示意圖；圖4是本發明猴肝細胞培養M小時后的示意圖；圖5是本發明人肝細胞培養4小時后的示意圖；圖6是本發明人肝細胞培養M小時后的示意圖。
具體實施例方式本具體實施方式
采用以下技術方案(a)將切除的不完整肝臟組織塊通過粘性 溶劑封閉多余的血管管路，只保留一個可供灌流的進液血管口和一個出液血管口 ；(b)插 入合適大小的針頭，用粘性溶劑封住，等粘性溶劑干之后再涂一層粘性溶劑以防漏液；(C) 放入36 42°C水浴鍋內漂浮的容器中，開始灌輸36 42°C的無鈣灌流液，控制灌流速度 和灌流時間；(d)清空無鈣灌流液，灌輸36 42°C的0.03 0. 10%膠原酶灌流液，控制灌 流速度和灌流時間；(e)將完全消化好組織分離出肝細胞，通過Percoll溶液離心獲得純 化的仍保持活性的原代肝細胞。所述的無鈣灌流液(ρΗ7·4)配方為=NaCl 8. 0 9. Og · Γ1 KC10. 4 0. 6g · Γ1 HEPES2. 0 4. Og · L-1 NaOH 0. 2 0. 4g · L-1 維生素 C 50 100 μ g · mL_1 胰島素 2 4μ g · mL-1，流速 25 50ml/min，時間 5 20min。所述的酶灌流液(pH7.6)配方為NaCl 3. 0 5. Og · Γ1 KC10. 2 0. 6g · Γ1 CaCl2O. 5 1. Og .171 HEPES 20 30g·!^ Na0H2. 5 5. Og 膠原酶濃度 0· 04 0· 08% 維生素 C 50 100 μ g · mL_1 胰島素 2 4 μ g · mL-1，流速 25_50ml/min，時間 5_20min。所述的Percoll分離液是90 % Percoll配制是9體積的Percoll加1體積的PBS(10*)，然后加入培養液配成20 70% Percoll溶液。本具體實施方式
解決國內制備肝原代細胞領域的空白，肝細胞的培養采用“三明 治膠”夾層法，能夠使其保持較長時間的活力，解決了肝細胞沒有像細胞系那樣的增殖性而 活性無法保持的問題。實施例1 狗肝原代細胞分離和培養方法分離和培養方法1)稱重；幻用事先預冷的無鈣灌流液沖洗肝臟，一方面沖洗肝 臟中的血液殘留，另一方面尋找合適的血管，能夠作為主要沖洗肝臟組織塊的血管，為下一 步無鈣和膠原酶灌流液的灌流做準備；幻用無菌紗布擦干肝臟組織塊周圍和切面的水分， 灌流插管采用剪去尖端的黃槍頭插入事先選擇好的血管中，采用膠水把切面包裹起來，使 其成為一個不漏液的肝組織塊，然后在前端剪一個小口，排出所灌流的液體，無鈣和膠原酶 灌流液兩種先后沖洗10 15min，然后停止灌流，撕下膠皮，放入含5%胎牛血清的F12高糖 DMEM培養液中，用鑷子撕掉肝包膜慢慢晃動使肝細胞脫落，用15、30和150目篩子過濾所 消化后的培養液，去除未消化的肝組織；4)消化細胞的培養液放入離心管中，400 500轉 離心％iin，去除上清液，然后加入所配好的Percoll分離液，700 800轉離心％iin，輕輕 吸取上層死細胞和上清液，留下下層活的肝細胞，再用含5 10%胎牛血清的F12高糖DMEM 培養液重懸肝細胞，放入離心管中400 500轉離心％iin，清洗肝細胞，最終獲得純化的肝 原代細胞；5)用臺盼蘭染色計數活的肝細胞數量及存活率，按照1*106個/ml接種到鋪有鼠 尾膠的培養板中，在37°C和5%二氧化碳培養箱中培養4小時后，加入含0. 25 5. Omg/ml Matrigen的無血清培養液，使肝原代細胞的培養采用夾層法培養，每天換無血清培養液。解 決國內制備肝原代細胞領域的空白，肝細胞的培養采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持 較長時間的活力，解決了肝細胞沒有像細胞系那樣的增殖性而活性無法保持的問題。實施例2 猴肝原代細胞分離和培養方法分離和培養方法1)稱重；幻用事先預冷的無鈣灌流液沖洗肝臟，一方面沖洗肝 臟中的血液殘留，另一方面尋找合適的血管，能夠作為主要沖洗肝臟組織塊的血管，為下一 步無鈣和膠原酶灌流液的灌流做準備；幻用無菌紗布擦干肝臟組織塊周圍和切面的水分， 灌流插管采用剪去尖端的黃槍頭插入事先選擇好的血管中，采用膠水把切面包裹起來，使 其成為一個不漏液的肝組織塊，然后在前端剪一個小口，排出所灌流的液體，無鈣和膠原酶 灌流液兩種先后沖洗10 15min，然后停止灌流，撕下膠皮，放入含5%胎牛血清的!^12高糖 DMEM培養液中，用鑷子撕掉肝包膜慢慢晃動使肝細胞脫落，用15、30和150目篩子過濾所 消化后的培養液，去除未消化的肝組織；4)消化細胞的培養液放入離心管中，400 500轉 離心％iin，去除上清液，然后加入所配好的Percoll分離液，700 800轉離心％iin，輕輕 吸取上層死細胞和上清液，留下下層活的肝細胞，再用含5 10%胎牛血清的F12高糖DMEM 培養液重懸肝細胞，放入離心管中400 500轉離心％iin，清洗肝細胞，最終獲得純化的肝 原代細胞；5)用臺盼蘭染色計數活的肝細胞數量及存活率，按照1*106個/ml接種到鋪有鼠 尾膠的培養板中，在37°C和5%二氧化碳培養箱中培養4小時后，加入含0. 25 5. Omg/ml Matrigen的無血清培養液，使肝原代細胞的培養采用夾層法培養，每天換無血清培養液。解 決國內制備肝原代細胞領域的空白，肝細胞的培養采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持 較長時間的活力，解決了肝細胞沒有像細胞系那樣的增殖性而活性無法保持的問題。實施例3 人肝原代細胞分離方法
分離和培養方法1)稱重；幻用事先預冷的無鈣灌流液沖洗肝臟，一方面沖洗肝 臟中的血液殘留，另一方面尋找合適的血管，能夠作為主要沖洗肝臟組織塊的血管，為下一 步無鈣和膠原酶灌流液的灌流做準備；幻用無菌紗布擦干肝臟組織塊周圍和切面的水分， 灌流插管采用剪去尖端的黃槍頭插入事先選擇好的血管中，采用膠水把切面包裹起來，使 其成為一個不漏液的肝組織塊，然后在前端剪一個小口，排出所灌流的液體，無鈣和膠原酶 灌流液兩種先后沖洗10 15min，然后停止灌流，撕下膠皮，放入含5%胎牛血清的!^12高糖 DMEM培養液中，用鑷子撕掉肝包膜慢慢晃動使肝細胞脫落，用15、30和150目篩子過濾所 消化后的培養液，去除未消化的肝組織；4)消化細胞的培養液放入離心管中，400 500轉 離心％iin，去除上清液，然后加入所配好的Percoll分離液，700 800轉離心％iin，輕輕 吸取上層死細胞和上清液，留下下層活的肝細胞，再用含5 10%胎牛血清的F12高糖DMEM 培養液重懸肝細胞，放入離心管中400 500轉離心％iin，清洗肝細胞，最終獲得純化的肝 原代細胞；5)用臺盼蘭染色計數活的肝細胞數量及存活率，按照1*106個/ml接種到鋪有鼠 尾膠的培養板中，在37°C和5%二氧化碳培養箱中培養4小時后，加入含0. 25 5. Omg/ml Matrigen的無血清培養液，使肝原代細胞的培養采用夾層法培養，每天換無血清培養液。解 決國內制備肝原代細胞領域的空白，肝細胞的培養采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持 較長時間的活力，解決了肝細胞沒有像細胞系那樣的增殖性而活性無法保持的問題。
權利要求
1.一種肝原代細胞的分離和培養方法，其特征在于(a)將切除的不完整肝臟組織塊 通過粘性溶劑封閉多余的血管管路，只保留一個可供灌流的進液血管口和一個出液血管 口 ；(b)插入合適大小的針頭，用粘性溶劑封住，等粘性溶劑干之后再涂一層粘性溶劑以 防漏液；(c)放入36 42°C水浴鍋內漂浮的容器中，開始灌輸36 42°C的無鈣灌流液，控 制灌流速度和灌流時間；(d)清空無鈣灌流液，灌輸36 42°C的0. 03 0. 10%膠原酶灌 流液，控制灌流速度和灌流時間；(e)將完全消化好組織分離出肝細胞，通過Percoll溶液 離心獲得純化的仍保持活性的原代肝細胞。
2.根據權利要求1所述的一種肝原代細胞的分離和培養方法，其特征在于所述的無鈣 灌流液(pH7. 4)配方為NaCl 8. 0 9. Og 'L-1KCl 0. 4 0. 6g .171 HEPES2. 0 4. Og .Γ1 NaOH 0. 2 0. 4g · L-1 維生素 C 50 100μ g Γ1 胰島素 2 4μ g ·πι Λ 流速 25_50ml/ min,時間 5-20min ；酶灌流液(ρΗ7· 6)配方為=NaCl 3. 0 5. Og · Γ1 KC10. 2 0. 6g · Γ1 CaCl2O. 5 1. Og .171 HEPES 20 30g·!^ Na0H2. 5 5. Og 膠原酶濃度 0· 04 0· 08% 維生素 C 50 100μ g · mL_1 胰島素 2 4μ g · mL-1，流速 25_50ml/min，時間 5_20min ； Percoll分離液是90% Percoll配制是9體積的Percoll加1體積的PBS (10*)，然后加入 培養液配成20 70% Percoll溶液。
3.根據權利要求1所述的一種肝原代細胞的分離和培養方法，其特征在于通過在細胞 上下層鋪上相應的膠使其能建立類似活體肝臟實質的三維結構并保持長時間的活力及其 穩定的代謝功能；(a)在空白培養板上鋪上0. 01 0. lmg/ml鼠尾膠，體積按照培養板每孔 表面積的大小加入；(b)在鋪上細胞等待4 10小時之后，加入Matrigel膠或鼠尾膠，形 成一個夾層，使肝細胞能模擬肝板樣生長結構。
4.根據權利要求3所述的一種肝原代細胞的分離和培養方法，其特征在于經過鼠尾膠 處理的培養板表面會形成一層蛋白薄膜，有利于肝細胞貼壁。
5.根據權利要求3所述一種肝原代細胞的分離和培養方法，其特征在于加入上層 Matrigel膠或鼠尾膠之后，可以固定肝細胞的形狀，形成肝板樣結構，使肝細胞具有較長的 生存周期。
全文摘要
一種肝原代細胞的分離和培養方法，它涉及生物技術領域。解決國內制備肝原代細胞領域的空白，肝細胞的培養采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持較長時間的活力，解決了肝細胞沒有像細胞系那樣的增殖性而活性無法保持的問題。
文檔編號C12N5/071GK102041242SQ201010169838
公開日2011年5月4日 申請日期2010年5月12日 優先權日2010年5月12日
發明者劉鴻君, 沈國林 申請人:北京匯智泰康醫藥技術有限公司