專利名稱：一種提高beta葡聚糖酶活力持續性的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程領域，特別涉及一種在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細胞壁外表面展露表達β葡聚糖酶以提高該酶活力持續性的方法。
背景技術：
谷物及其加工副產物是常用的飼料原料，但這些飼料含有高含量β葡聚糖，會提高單胃動物消化道粘度，妨礙動物消化酶對飼料的消化利用。添加外源β葡聚糖酶具有提高單胃動物消化率、報酬率和生產性能的效果。外源β葡聚糖酶在飼料中已廣泛應用，但酶活力持續性不足是目前應用的β葡聚糖酶存在的一個問題。包括β葡聚糖酶在內的各種酶的重組表達方式有細胞內表達和分泌表達兩種，這兩種酶的重組表達方式使酶分子與宿主細胞之間沒有關聯，即酶分子不是宿主細胞的組成部分，從而很容易失活。如果使酶分子成為細胞的有機組成部分，則只要細胞保持存活狀態酶分子也會保持活力，從而可以顯著提高酶的活力持續性。本發明開發一種使β葡聚糖酶成為釀酒酵母細胞有機組成的技術，即將β葡聚糖酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細胞的組成部分，只要釀酒酵母細胞保持存活則β葡聚糖酶始終保持活性狀態，從而顯著提高了 β葡聚糖酶活力持續性。
發明內容
針對現有的β葡聚糖酶活力持續性不足的問題，本發明提供一種使β葡聚糖酶成為釀酒酵母細胞有機組成部分的技術，使β葡聚糖酶只要釀酒酵母細胞保持存活即可保持活力，從而顯著提高β葡聚糖酶活力持續性。將beta葡聚糖酶基因(Genbank號U60830)連接(常規方法連接)在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列(Genbank號S73336)的N端，然后插入(通過常規方法插入)釀酒酵母表達載體GALl啟動子(Genbank號AY42807》下游MFa 1信號肽序列(Genbank號 M17301)的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端641^啟動子+1^^ 1信號肽序列+beta 葡聚糖酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。將包含“權利要求1”所述表達框的釀酒酵母細胞培養于添加有3-5% (重量百分比)半乳糖(普通半乳糖)的YPD培養基中。本發明的優點將β葡聚糖酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細胞保持存活狀態，β葡聚糖酶即可保持活力。
具體實施例方式以下通過實施例進一步對本發明進行描述
實施例1 β葡聚糖酶展露表達
將β葡聚糖酶基因(來自Bacillus subtilis，Genbank號U60830)連接在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列的N端(來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae, Genbank 號S73336)，然后插入釀酒酵母表達載體GALl啟動子下游(來自釀酒酵母表達載體 PYES263，Genbank號AY428072)MF α 1 信號Jft (來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae, Genbank號M17301)序列的C端，構建成表達框(從N端到C端):GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+β葡聚糖酶基因+FLO序列。將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞 (Saccharomycescerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)JlJMFa 1信號肽將引導β葡聚糖酶向釀酒酵母細胞外分泌，而β葡聚糖酶下游的FLO序列則錨定在釀酒酵母細胞壁中， 從而使β葡聚糖酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面。實施例2 β葡聚糖酶展露表達的誘導在培養釀酒酵母的YPD培養基中，添加3-5 %半乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & ServicesCo. , Ltd.), 1 '] 表達框“GALl啟動子+MFa 1信號肽序列+ β葡聚糖酶基因+FLO序列”中的GALl啟動子就會活化，誘導β葡聚糖酶在釀酒酵母細胞壁外表面展露表達。實施例3半乳糖對β葡聚糖酶展露表達的作用在培養釀酒酵母的YPD培養基中，如果不含半乳糖，則未檢測到β葡聚糖酶活性， 這是因為表達框“GAL1啟動子+MFa 1信號肽序列+ β葡聚糖酶基因+FLO序列”中的GALl 啟動子無法活化。實施例4β葡聚糖酶展露表達后其活力持續性顯著提高按照實施例1和實施例2所示步驟進行展露表達的β葡聚糖酶活性為867U/ mL(3%半乳糖)和827U/mL(5%半乳糖)，半衰期均為62天，即第62天時能保持起始活性的一半。而如果在實施例1和實施例2所示的展露表達表達框“GALl啟動子+MFa 1信號肽序列+β葡聚糖酶基因+FLO序列”中去除FLO序列序列，則β葡聚糖酶進行分泌表達， 活性為338U/mL(3%半乳糖)和341U/mL(5%半乳糖)，半衰期均僅為6天，即第5天時能保持起始活性的一半。因此，將β葡聚糖酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細胞的組成部分，只要釀酒酵母細胞保持存活則β葡聚糖酶始終保持活性狀態，從而顯著提高了 β葡聚糖酶活力持續性。對β -葡聚糖酶活性測定采用還原糖測定法，活性單位定義為在ρΗ 5. 0,40°C 條件下，每分鐘從β-葡聚糖(購自上海生工生物工程有限公司，Sianghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co. , Ltd.) J^WMMrP ^MWM 1 μ mol還原糖所需要的酶量為一個酶活單位，簡稱為U。最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種提高beta葡聚糖酶活力持續性的方法，其特征在于包括以下步驟將beta葡聚糖酶基因連接在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GALl啟動子下游MFa 1信號肽序列的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端 GALl啟動子+MF α 1信號肽序列+beta葡聚糖酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于將包含“權利要求1”所述表達框的釀酒酵母細胞培養于添加有重量百分比3-5%半乳糖的YPD培養基中。
全文摘要
本發明提供一種使β葡聚糖酶成為釀酒酵母細胞有機組成部分的技術，使β葡聚糖酶只要釀酒酵母細胞保持存活即可保持活力，從而顯著提高β葡聚糖酶活力持續性。將beta葡聚糖酶基因(Genbank號U60830)連接(常規方法連接)在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列(Genbank號S73336)的N端，然后插入(通過常規方法插入)釀酒酵母表達載體GAL 1啟動子(Genbank號AY428072)下游MFα1信號肽序列(Genbank號M17301)的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端GAL1啟動子+MFα1信號肽序列+beta葡聚糖酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。本發明的優點將β葡聚糖酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細胞保持存活狀態，β葡聚糖酶即可保持活力。
文檔編號C12N15/81GK102242097SQ20101017281
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者何國慶, 周陳偉, 廖文艷, 徐娟, 王睿之, 阮暉, 陳美齡, 陳赟, 馬風蘭 申請人:浙江大學