一種提高人精子活力的體外培養體系試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明公開一種提高人精子活力的體外培養體系試劑盒及其使用方法。該試劑盒包括9mLmHTF、1mL血清替代物vcl重組蛋白、45～55ugacat2重組蛋白。使用方法是將試劑盒中各試劑置于37℃下混合平衡2～3小時，得到10mL精子培養體系；將用精子分裂液分離出來的精子按1000萬/mL的濃度用上述精子培養體系重懸后，輕輕混勻，置于37℃恒溫箱中放置90～120分鐘，即可。利用本發明精子培養體系重懸后的精子可以顯著提高前向運動活力，在人工授精和體外受精技術中使用，可以改善妊娠結局，提高受精率；同時對嚴重弱精子癥患者的治療又提供了新方法。
【專利說明】一種提高人精子活力的體外培養體系試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種體外培養體系試劑盒，具體是指一種為了提高精子活力，含有活 性重組蛋白的培養體系試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002] 近年來不育不孕癥患者顯著增多，而男性的弱精子癥又是男性不育的重要原因 之一。弱精子癥是指前向運動精子比例低于32%(a+b〈32%)，或者精子總活力低于40% (a+b+c〈40%)。對于輕中度弱精子癥（a+b>10%)，臨床常通過人工授精進行治療，然而對重度 弱精子癥（a+b〈10%)，臨床則要用體外受精甚至單精子卵泡注射等技術。研究表明，較好的 精子動力是輔助生殖技術成功的一個重要因素。
[0003] 精液由精子和精漿組成，精子來源于睪丸，是遺傳信息的承載者，是受精的主體。 而精漿則含有許多從附屬性腺包括附睪、精囊腺和前列腺分泌的活性物質，這其中有一些 活性蛋白，它們對于精子活力的維持具有非常重要的作用。在輔助生殖技術操作實施過程 中，常規的精子處理方式會把精漿洗去，改之用人工合成的培養液作為精子的培養體系， 包括Bffff、mHTF、臺式液等等。上述培養液主要為精子提供了一個緩沖和基本供能環境， 對精子活力的提高作用不明顯。而我們發現精漿中的一些關鍵蛋白對于精子活力的提 高具有重要作用，例如粘著斑蛋白（vinculin)和乙酰輔酶A乙酰基轉移酶（acetyl-CoA acetyltransferase 2)。而這些活性蛋白的加入對于提高精子活力具有非常重要的作用。 因此，在臨床上開發一種提高精子活力的培養體系就顯得尤為重要。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是針對現有技術的不足，提供了一種提高人精子活力的體外培養體 系試劑盒。
[0005] 本發明提高人精子活力的體外培養體系試劑盒包括9mL的Modified Human Tubal Fluid (改良后人輸卵管液，簡稱mHTF)、lmL的serum substitute supplement (血清替代 物，簡稱SSS)、34?45ug的粘著斑蛋白（vinculin，在下文中簡稱vcl重組蛋白）、45?55ug 的乙酰輔酶A乙酰基轉移酶（acetyl-CoA acetyltransferase 2,在下文中簡稱acat2重組 蛋白）。
[0006] 所述的vcl重組蛋白、acat2重組蛋白為人源基因通過酵母表達體系大量表達后 的產物，其性狀為提純后的蛋白干粉；其中vcl重組蛋白中VCL基因 ID:7414, acat2重組 蛋白中ACAT2基因 ID:39 ;本發明所用重組蛋白由南京金斯瑞生物科技有限公司的酵母蛋 白表達服務提供。
[0007] 本發明的另一個目的是提供上述試劑盒的使用方法： 本發明試劑盒針對的作用對象為經精子分離液分離后的精子。
[0008] 將本發明試劑盒中各試劑mHTF、血清替代物SSS、vcl重組蛋白、acat2重組蛋白 置于37°C下混合平衡2?3小時，得到10 mL精子培養體系；將用精子分裂液分離出來的 精子按1000萬/mL的濃度用上述精子培養體系重懸后，輕輕混勻，置于37°C恒溫箱中放置 90?120分鐘，即可。
[0009] 本發明試劑盒試劑中的vcl重組蛋白、acat2重組蛋白為人源重組蛋白，是從天然 酵母表達系統中產生，對于精子本身沒有任何毒害效應，且可以通過成熟的技術方法大量 表達純化，適合大規模生產后投入臨床使用。
[0010] 利用本發明精子培養體系重懸后的精子可以顯著提高前向運動活力，在人工授精 和體外受精技術中使用，可以改善妊娠結局，提高受精率；同時對嚴重弱精子癥患者的治療 又提供了新方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為正常活力精子標本使用目的培養液前后精子動力改善狀況； 圖2為弱精子癥患者標本使用目的培養液前后精子動力改善狀況。
[0012]
【具體實施方式】： 以下的實施例可以使本專業技術人員更全面的理解本發明，但不以任何方式限制本發 明。
[0013] 實施例1 : 樣本來源：三份正常活力精子標本(標準按WHO五版） 精子處理： 1.預熱10mL含體積分數為10% SSS的mHTF (作為培養前對照組)，2mL Isolate精子 分離液和10mL本發明精子培養體系。
[0014] 2.將收集有精液的取精杯置于37°C水浴，待液化后取出。
[0015] 3.將預熱的含體積分數為10% SSS的mHTF與液化后精液混勻，緩緩加入到 Isolate精子分離液上，300g離心10分鐘。
[0016] 4.離心后棄上清，取下層分離后精子鏡檢，記錄精子活力，作為培養前對照組。
[0017] 5.將步驟（4)剩余精子按1000萬/mL的濃度與本發明精子培養體系混勻，置于 37 °C溫箱90?120分鐘。
[0018] 6.取精子鏡檢，記錄精子活力。
[0019] 最終結果（圖1):本發明精子培養體系培養前平均前向運動精子比例為64. 6%，培 養后平均前向運動精子比例為76%，（p〈0. 01) 實施例2 : 樣本來源：三份弱精子癥患者精子標本(標準按WHO五版） 精子處理： 1.預熱10mL含體積分數為10% SSS的mHTF (作為培養前對照組)，2mL Isolate精子 分離液和10mL本發明精子培養體系。
[0020] 2.將收集有精液的取精杯置于37°C水浴，待液化后取出。
[0021] 3.將預熱的含體積分數為10% SSS的mHTF與液化后精液混勻，緩緩加入到 Isolate分離液上，300g離心10分鐘。
[0022] 4.離心后棄上清，取下層分離后精子鏡檢，記錄精子活力，作為培養前對照組。
[0023] 5.將步驟（4)剩余精子按1000萬/mL的濃度與本發明精子培養體系混勻，置于 37 °C溫箱90?120分鐘。
[0024] 7.取精子鏡檢，記錄精子活力。
[0025] 最終結果（圖2):本發明精子培養體系培養前平均前向運動精子比例為33. 3%，培 養后平均前向運動精子比例為45. 4% (p〈0. 01) 上述使用的mHTF為Irvine Scientific，購買自美國，貨號：90126 ; 上述使用的本發明精子培養體系制備如下：9mL mHTF、lmL SSS、34?45ug vcl重組蛋 白、45?55ug acat2重組蛋白置于37°C下混合平衡2?3小時，得到10 mL精子培養體系； 其中vcl重組蛋白、acat2重組蛋白為人源基因通過酵母表達體系大量表達后的產物，其性 狀為提純后的蛋白干粉；其中vcl重組蛋白中VCL基因 ID:7414, acat2重組蛋白中ACAT2 基因 ID:39 ;本發明所用重組蛋白由南京金斯瑞生物科技有限公司的酵母蛋白表達服務提 供。
[0026] 以上所述的僅是本發明的優選實施方式。應當指出，在不脫離本發明原理的前提 下，還可以做出若干改進和潤飾，這些都視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1. 一種提高人精子活力的體外培養體系試劑盒，其特征在于包括9mL改良后人輸卵管 液mHTF、lmL血清替代物SSS、34?45ug的粘著斑蛋白、45?55ug的乙酰輔酶A乙酰基轉 移酶。
2. 如權利要求1所述的一種提高人精子活力的體外培養體系試劑盒，其特征在于vcl 重組蛋白、acat2重組蛋白為人源基因通過酵母表達體系大量表達后的產物，其性狀為提 純后的蛋白干粉；其中vcl重組蛋白中VCL基因 ID:7414, acat2重組蛋白中ACAT2基因 ID:39。
3. 如權利要求1所述的一種提高人精子活力的體外培養體系試劑盒，其特征在于該試 劑盒針對的作用對象為經精子分離液分離后的精子。
4. 如權利要求1所述的一種提高人精子活力的體外培養體系試劑盒的使用方法，其特 征在于將試劑盒中各試劑改良后人輸卵管液mHTF、血清替代物SSS、粘著斑蛋白、乙酰輔酶 A乙酰基轉移酶置于37°C下混合平衡2?3小時，得到精子培養體系；將用精子分裂液分離 出來的精子按1000萬/mL的濃度用上述精子培養體系重懸后，輕輕混勻，置于37°C恒溫箱 中放置90?120分鐘，即可。
【文檔編號】C12N5/076GK104195105SQ201410409370
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月19日 優先權日:2014年8月19日
【發明者】吳亦波, 陳玲, 王英男, 張帆, 金帆 申請人:杭州安體科技有限公司