專利名稱：在大腸桿菌中無需包涵體復性制備溶栓藥物瑞替普酶的方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域中的重組蛋白質藥物制備技術，具體涉及一種無需包涵 體復性、直接在大腸桿菌中表達生產活性溶栓藥物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。
背景技術：
目前，心血管疾病，尤其是血栓栓塞性疾病是危害人類健康的一大殺手。溶栓治療 是血栓性疾病安全而有效的治療手段。rPA是分子量為39. 6kD的單鏈蛋白，由355個氨基 酸組成，它是人組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑(Tissue type plasminogen activator, tPA)缺失4-175位氨基酸序列的缺失變體。rPA —級結構中不含tPA分子中的Kringlel、 Finger、EGF結構域(domain)，但保留了 Kringle2及絲氨酸蛋白酶結構域。由于rPA缺失 了 tPA的部分結構域，rPA與纖維蛋白的結合能力稍弱，但rPA分子中保留的Kringle2結構 域具有對纖維蛋白適中的親和性，更容易作用于血栓內部的纖溶酶原，溶栓速度快于tPA。 另外rPA與肝細胞受體結合的Kringlel及EGF結構域的缺失使rPA在體內的半衰期較tPA 大大延長，可達18min，因此rPA作為新型溶栓藥物可更好地應用于治療急性心肌梗塞，在 療效和臨床使用等方面均優于tPA，具有纖溶效果強、再通率高、起效迅速和副作用小等優 點，是目前臨床上應用最好的第三代溶栓藥物之一。中國專利CN200710303763. 3公開了一種在大腸桿菌中表達瑞替普酶的方法，盡 管它也是將瑞替普酶基因插入到原核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體，再將該 重組表達載體與質粒PREP4共轉化大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，培養該重組大腸桿菌，表 達得到瑞替普酶。但該方法中存在的問題在于(1)需要兩個質粒共轉化，并因此在培養過 程中需要同時添加氨芐青霉素和卡那霉素兩種抗生素，一方面致使重組大腸桿菌遺傳穩定 性相對降低，另一方面也較大程度上為工業化生產及后續臨床應用中如何避免抗生素殘留 污染增加了困難；(2)所獲得的rPA重組蛋白質僅通過western blot進行鑒定，未能就其 溶栓活性加以驗證，無法確保實現正確的臨床應用。目前，國內外采用基因工程方法生產rPA的研究主要是應用酵母及哺乳動物細胞 等真核表達系統中，成本較高，生產周期長，產率很低，且真核細胞內表達產物易產生糖基 化而影響生物活性。利用大腸桿菌等原核表達系統則可以大大降低生產成本，提高產率，然 而盡管也有不少學者嘗試在大腸桿菌系統中表達rPA基因，但由于rPA富含9對二硫鍵，大 腸桿菌系統很難直接形成正確的空間構象，致使表達產物多以包涵體蛋白形式存在，必須 將細胞破碎后才能將其分離出來，分離過程中要用蛋白質變性劑，最后還要再把蛋白質復 性，復性過程中有許多會錯接形成結構異常的分子，同時，菌體殘余蛋白是基因工程藥物生 產過程中不易消除的物質，不但收率較低，而且容易影響產品的質量，從而影響到藥物的療 效。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種無需包涵體復性、直接在大腸桿菌中表達制備活性 溶栓藥物瑞替普酶(rPA)的方法。本發明是將溶栓藥物瑞替普酶rPA基因插入到原核表達載體pET40b的多克隆位 點，使其位于DsbC信號肽及其編碼基因下游，得到重組表達載體，再將該重組表達載體轉 化大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，培養該重組大腸桿菌，表達、分離純化得到rPA。為實現此 目的本發明提供如下的技術方案—種無需包涵體復性、直接在大腸桿菌中表達瑞替普酶的方法，其特征在于包括 如下的步驟(1)表達載體的構建將rPA編碼基因插入到表達載體pET40b的多克隆位點，使其 位于DsbC信號肽及其編碼基因下游，經T4DNA連接酶連接，構建得到pET40b_rPA重組質粒；(2)將pET40b-rPA轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組大腸桿菌；其中重組大腸桿 菌pET40b-rPA氨基酸序列如序列表4。(3)培養該重組大腸桿菌，誘導表達；(4)收集菌液，超聲離心后，分別對上清及沉淀進行SDS-PAGE檢測；(5)分離純化得到目的融合蛋白DsbC-rPA，或經鎳柱親和層析純化，用Xa因子 (或甲酸、凝血酶)處理，去除DsbC標簽，得到高純度、高活性的rPA目的蛋白。本發明所述的方法，其中步驟(1)中rPA基因片段與載體中的二硫鍵異構酶DsbC 以融合蛋白形式表達，在DsbC的輔助作用下催化二硫鍵形成，無需進行包涵體復性。本發明所述的方法，其中所述的培養該重組大腸桿菌的過程中需加入IPTG或乳 糖進行誘導表達。本發明所述的方法，其中所述的IPTG終濃度為0. 6mM于25°C誘導3h，乳糖終濃度 為30mM于30°C誘導5h。本發明所述的方法，其中所述的融合標簽DsbC和rPA間是通過凝血酶、Xa因子及 甲酸蛋白質切割位點相連，融和蛋白DsbC-rPA利用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理后即可 將二者分離獲得獨立的rPA蛋白質。本發明所述的方法，其中所述的rPA編碼基因克隆插入pET40b載體所用PCR引物 序列為上游引物5，-CGGgEatccGATCGAAGGTCGTTCTTACCAAGGAAACAGTG-3'；下游引物5，-GGGctcgagATTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3，。其中在上下游引 物中分別引入BamHI和Xhol酶切位點；同時在上游引物中同時引入了 Xa因子蛋白酶切位 點和甲酸蛋白切割位點的編碼DNA。本發明為了確保目的蛋白形成正確的二硫鍵與空間構象，將rPA編碼基因克隆到 二硫鍵異構酶DsbC信號肽及其編碼基因下游。DsbC信號肽可將融合蛋白轉運到大腸桿菌 細胞周質空間，然后在DsbC的輔助作用下催化二硫鍵的形成，成功的實現了 rPA重組蛋白 的高效可溶性表達，目的蛋白在不需進行包涵體復性操作且在未切去DsbC標簽的情況下， 即可表現出明顯的溶栓活性，進一步經鎳柱親和層析純化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶) 處理可獲得高純度、高活性的rPA目的蛋白。從而大大簡化了利用大腸桿菌這一目前最為 成熟、成本最低廉的表達系統制備可溶性、活性rPA的操作方法。
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本發明的方法成功實現了 rPA重組蛋白的高效可溶性表達，用BCA蛋白定量法計 算得到在上清液中的可溶性目的蛋白的含量占總蛋白量的40%左右，且目的蛋白在不需進 行包涵體復性操作且在未切去DsbC標簽的情況下，即可表現出明顯的溶栓活性，進一步經 鎳柱親和層析純化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理可獲得高純度、高活性的rPA目的 蛋白。本發明的制備方法簡單易行，回收率高，縮短了 rPA生產工藝，降低了生產成本， 為更好的大規模工業化生產rPA奠定了堅實的基礎，對其它富含二硫鍵的蛋白質的工業化 生產也具有重要的指導意義。
圖1是乳糖和IPTG誘導DsbC-rPA在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE檢測。1 蛋白 質Marker ；2 :IPTG誘導rPA重組大腸桿菌；3 :IPTG誘導pET40b空質粒轉化的大腸桿菌； 4 乳糖誘導rPA重組大腸桿菌。圖2是鎳柱法親和層析純化DsbC-rPA融合蛋白。圖3是用Xa因子處理DsbC-rPA融合蛋白釋放rPA蛋白質的SDS-PAGE檢測。1 Xa因子切割融合蛋白DsbC-rPA 2 :DsbC_rPA融合蛋白3 蛋白質Marker。圖4是DsbC-rPA和rPA的溶栓活性檢測。1 :pET40b空質粒轉化的大腸桿菌的表 達產物2 :DsbC-rPA融合蛋白3 經Xa因子處理獲得的rPA蛋白質4 :tPA標準品5 經凝血 酶處理獲得的rPA蛋白質6 尿激酶(uPA)標準品。
具體實施例方式為了簡單和清楚的目的，下文恰當的省略了公知技術的描述，以免那些不必要的 細節影響對本技術方案的描述。在下述實施例中所給出的實驗方法，如無特別說明，均為常 規方法。其中所用試劑均有市售。實施例1rPA基因工程菌的構建1、以本實驗室前期研究中構建的pMD18T-tPA質粒作為模板(江潔，江成英，杜連 祥等.Reteplase基因的克隆及在甲醇畢赤酵母中的表達.華南理工大學學報自然科學版， 2006,34(12) 25-29)。采用上游引物5‘ -CGGggatccGATCGAAGGTCGTTCTTACCAAGGAAACAGTG-3‘(序列表；1)；下游引物5，-GGGctcgagATTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3，，(序列表2)進行 PCR 擴增， 將擴增得到的PCR產物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠純化方法純化回收獲得rPA 基因片段。為方便后續操作，在上下游引物中分別引入了 BamHI和Xhol酶切位點(黑體小寫 部分)，同時為便于切割去除DsbC融合標簽，在上游引物中同時引入了 Xa因子蛋白酶切位 點(黑體斜體部分)和甲酸蛋白切割位點(下劃線部分)的編碼DNA。經過序列比較證實PCR擴增得到的rPA編碼基因序列與已知的rPA基因序列完
5全一致，具體序列如下所示(序列表3)TCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTAA2、將rPA基因和pET40b質粒(購買于Novagen公司)用BamHI和Xhol雙酶切 后，經T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5 a，在含有50 u g/mL卡那霉素的LB培養基平 板上，培養12h后挑取單克隆，提取質粒用BamHI和Xhol雙酶切驗證，瓊脂糖凝膠電泳檢測 有1. lkb rPA目的片段的重組質粒經測序鑒定正確后，命名為pET40b-rPA。在該重組質粒 pET40b-rPA中，rPA被置于DsbC信號肽及其成熟肽下游，以同一讀碼框以融合蛋白形式表 達，且在DsbC與rPA間存在組氨酸標簽(His Tag)以及凝血酶、甲酸及凝血因子Xa等蛋白 質切割位點。(序列表:4，下劃線部分為rPA氨基酸序列)MKKGFMLFTLLAAFSGFAQADDAAIQQTLAKMGIKSSDIQPAPVAGMKTVLTNSGVLYITDDGKHIIQGPMYDVSGTAPVNVTNKMLLKQLNALEKEMIVYKAPQEKHVITVFTDITCGYCHKLHEQMADYNALGITVRYLAFPRQGLDSDAEKEMKAIWCAKDKNKAFDD
VMAGKSVAPASCDVDIADHYALGVQLGVSGTPAVVLSNGTLVPGYQPPKEMKEFLDEHQKMTSGKGSTSGSGHHHHHHSAGLVPRGSTAIGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKSPGFSSTMAISDPIEGRSYQGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPffNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPffCHVLKNRRLTffEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPffQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCfflLSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDffTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTD匪LCACTITRSGGPQANLHDACQ⑶SGGPLVCLNDGRMTLVGIISffGLG
CGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRD匪RP3、采用氯化鈣轉化法，將pET40b-rPA轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞(天 津科技大學工業微生物教育部重點實驗室提供)，獲得rPA重組大腸桿菌。實驗同時轉化 pET40b空質粒作為對照。4、實驗結果表明rPA原核表達質粒構建完全成功。實施例2rPA在大腸桿菌中的誘導表達1、將rPA重組大腸桿菌及轉化pET40b空質粒的大腸桿菌分別接種到5mL含有終 濃度50 u g/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37 °C，220rpm培養過夜。2、將上一步驟中所得過夜培養物分別按的體積比轉接到200mL含有終濃 度為50 y g/mL卡那霉素的LB液體培養基中，培養至其0D600為0. 6時加入IPTG(異丙 基-0-D-硫代半乳糖苷)或乳糖進行誘導表達。具體最佳誘導表達條件IPTG為終濃度 0. 6mM于25°C誘導3h，乳糖為終濃度30mM于30°C誘導5h。3、誘導表達結束后，分別收集菌液，超聲破碎后于12000rpm離心后，分別對上清 及沉淀進行SDS-PAGE檢測，見圖1。4、實驗結果表明rPA主要以可溶性成分表達，在上清中的可溶性目的蛋白的含 量占總蛋白量的40%左右。實施例3DsbC-rPA融合蛋白的分離純化1、利用pET_40b載體上帶有His-Tag，可采用Ni離子親和色譜法純化融合蛋白。 首先將鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1. 6 X 20cm,柱床體積為10mL。2、用緩沖液 l(20mmol/L Tris-HCl pH7. 9,0. 5mol/L NaCl，10%甘油)以 2mL/min 平衡2-5個床體積后，將20ml細胞破碎液(50mM PBS, pH7. 4，0. 5M NaCl) 0. 45 u m濾膜過 濾，上樣，流速為lmL/min。3、用緩沖液1再洗2-5個床體積，流速為2mL/min。然后用分別含10、20、50、 100、200、300、400mM咪唑的緩沖液3進行階段洗脫，流速為2mL/min，收集各階段洗脫峰， 用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度。結果表明融合蛋白DsbC-rPA主要被含 10mM咪唑緩沖液從鎳柱上洗脫下來，見圖2。4、對所獲得的DsbC-rPA目的蛋白質，利用Xa因子(或甲酸、凝血酶)進行處理以 去除DsbC融合標簽，釋放rPA蛋白質。以Xa因子為例，具體操作為先用BCA蛋白濃度測定 試劑盒對樣品進行定量，然后按照1U Xa因子能夠有效裂解50 u g融合蛋白計算，于離心管 中混合Xa因子與純化后的融合蛋白，裂解緩沖液含有50mmol/L Tris-HCl,PH8. 0,0. lmol/ L NaCl,5mmol/L CaCl2。21°C孵育 16 小時，隨后取 20 ii L 進行 Tricine-SDS-PAGE 電泳分 析鑒定。5、實驗結果表明DsbC_rPA經Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理后，能夠釋放出目 的蛋白rPA和DsbC標簽蛋白質。見圖3。實施例4重組蛋白質溶栓活性檢測1、制備纖維蛋白平板稱取0. 02g纖維蛋白迅速加到裝有5mL PBS的小錐形瓶中，
7混勻后置于37°C預熱lOmin使其溶解。同時另取適量凝血酶放入裝有lmL PBS的EP管，輕 吹一下，放入37°C預熱。2、稱取0. 07克瓊脂糖用7mL PBS溶解，加熱使溶解后，冷卻至適宜溫度。將凝血 酶溶液迅速混入纖維蛋白溶液中，立即混勻后加入至瓊脂糖溶液中搖勻后，將混合液倒入 平板中使其冷卻固化。3、用打孔器在事先準備好的纖維蛋白平板上打孔，加入10yL待測樣品，37°C下 孵育12h，檢測溶栓圈大小。實驗同時檢測pET40b轉化大腸桿菌的誘導表達產物作為陰性 對照，檢測人組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑tPA(中國藥品生物制品檢定所提供)及尿激 酶uPA(天津市藥品檢驗所提供)標準品作為陽性對照。4、實驗結果表明經鎳柱親和層析純化，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理去除 DsbC標簽后所獲得的獨立rPA目的蛋白具有顯著的溶栓活性。而且，DsbC-rPA融和蛋白在 無需進行包涵體復性操作且在未切去DsbC標簽的情況下，也可以表現出明顯的溶栓活性， 且二者與陽性對照品tPA和uPA相比，活性相當。具體見圖4。
權利要求
一種無需包涵體復性、直接在大腸桿菌中高效表達瑞替普酶的方法，其特征在于包括如下的步驟(1)將rPA編碼基因插入到表達載體pET40b的多克隆位點，使其位于DsbC信號肽及其編碼基因下游，構建得到pET40b rPA重組質粒；(2)將pET40b rPA轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組大腸桿菌；(3)培養該重組大腸桿菌，誘導表達；(4)收集菌液，超聲離心后，分別對上清及沉淀進行SDS PAGE檢測；(5)分離純化得到目的融合蛋白DsbC rPA，或經鎳柱親和層析純化，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理，去除DsbC標簽，得到高純度、高活性的rPA目的蛋白。
2.權利要求1所述的方法，其中步驟(1)中rPA基因片段與載體中的二硫鍵異構酶 DsbC以融合蛋白形式表達，在DsbC的輔助作用下催化二硫鍵形成，無需進行包涵體復性。
3.權利要求1所述的方法，其中所述的培養該重組大腸桿菌的過程中需加入IPTG或乳 糖進行誘導表達。
4.權利要求3所述的方法，其中所述的IPTG終濃度為0.6mM于25°C誘導3h，乳糖終濃 度為30mM于30°C誘導5h。
5.權利要求1所述的方法，其中重組大腸桿菌pET40b-rPA的氨基酸序列如序列表4。
6.權利要求1所述的方法，其中所述的融合標簽DsbC和rPA間是通過凝血酶、Xa因子 及甲酸蛋白質切割位點相連，融合蛋白DsbC-rPA利用Xa因子、甲酸或凝血酶處理后即可將 二者分離獲得獨立的rPA蛋白質。
7.權利要求1所述的方法，其中所述的rPA編碼基因克隆插入pET40b載體所用PCR引 物序列為上游引物5，-CGGggatccGATCGAAGGTCGTTCTTACCAAGGAAACAGTG-3'；下游引物5，-GGGctcgagATTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3，。其中在上下游引物中分別引入BamHI和Xhol酶切位點；同時在上游引物中同時引入 Xa因子蛋白酶切位點和甲酸蛋白切割位點的編碼DNA。
全文摘要
本發明涉及一種無需包涵體復性、直接通過大腸桿菌表達系統制備溶栓藥物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。通過PCR擴增得到rPA的基因片斷，將該基因片斷克隆到載體pET40b中，構建得到pET40b-rPA重組質粒，且使rPA與載體pET40b中的二硫鍵異構酶DsbC融合表達。將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，分別優化確立了IPTG及乳糖的誘導表達條件。所獲得目的融合蛋白主要以可溶性成分表達，經鎳柱親和層析純化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)處理可獲得高純度的rPA目的蛋白。纖維蛋白平板法檢測結果顯示本方法所獲得的融合蛋白DsbC-rPA及去除標簽純化所得rPA蛋白均具有顯著的溶栓活性。
文檔編號C12N15/70GK101892253SQ20101021283
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者姜勇, 張同存, 王楠, 田文靜, 羅學剛, 路福平 申請人:天津科技大學