一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法

專利名稱：一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法。
背景技術：
當前國內對甲殼素的利用，主要以殼聚糖為主，而甲殼低聚糖作為一種功能性低 聚糖，在醫藥、食品等領域具有廣泛的應用前景，其市場價格比殼聚糖高10倍左右。甲殼低 聚糖在國內已有生產，大多是采用酸堿水解法，也有采用酶解法，但都是采用復合酶法，其 成本昂貴、規模較小。國外也只有日本等少數幾個國家有規模生產。近年對甲殼低聚糖的 功能、性質研究的深入，其應用在國內外受到廣泛的關注，市場前景廣闊。甲殼低聚糖生產的原料，來源于海產品加工廠的蝦、蟹殼等廢料。我國海域面積極 其遼闊，海產品生產量很大，這些資源很好很充足，但卻迄今仍未有效地被開發和利用，因 而對環境造成潛在的威脅。所以合理開發利用這一資源，不僅具有經濟學意義，還有很重要 的生態學意義。傳統的制備甲殼低聚糖的方法是脫乙酰基化學法，由于生產過程耗費能源多、所 需設備復雜、采用大量的酸堿用量，同時也污染環境。因此，人們開始尋找生物方法脫乙酰 基，現在大都采用酶解法，由于至今沒有單一、高效、專一性的酶，需要采用復合的酶解，成 本較昂貴，而且在酶解過程沒有科學、規范化、合適的酶反應系統，離大規模工業化生產尚
有一定距離。

發明內容
針對傳統的制備方法是脫乙酰基化學法，其生產過程耗費能源多、所需設備復雜、 采用大量的酸堿用量，同時也污染環境等問題，以及現在采用的生物酶解法，該生產法缺乏 廉價、高效、專一性酶和合理的反應系統，使生產缺乏產業化能力的現狀。本發明提供一 種用微生物菌發酵生產甲殼低聚糖的方法，該方法利用一種用微生物菌即淡紫擬青霉菌 Paecilomyces Iilacinus耗氧深層發酵降解蝦、蟹殼，并在發酵中后期通過再流加工藝，生 產出較高濃度甲殼低聚糖，有效避免了傳統甲殼低聚糖生產過程采用大量的酸堿用量，有 效地提高了能源的利用率，同時又能實現廉價、低成本工業化生產甲殼低聚糖。本發明的目的是這樣實現的—種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其以新鮮的蝦殼或蟹殼為原料，經原 料的制備、發酵原液配制、發酵原液滅菌、接種發酵、流加補料、離心去菌體、真空濃縮、噴霧 干燥、產品精制，獲得產品甲殼低聚糖。將新鮮的蝦殼或蟹殼曬干，粉碎成120目的干粉，然后以重量比2. 5%的蝦、蟹殼 干粉與水混合均勻，再加入0.02%蛋白胨，制成發酵原液。把配制好的發酵原液泵入發酵 罐，密閉罐體，加入蒸汽進行滅菌，使料溫升至121°C，保溫30分鐘，然后逐漸冷卻至28°C ； 往滅菌好的發酵液中接種入種子罐培養好的發酵菌，攪拌通風發酵，剛接種后通風量為1 0. 05v/v. min,在發酵的過程，再根據二氧化碳的產生量，逐步增加通風量，并逐步提高發酵
3溫度，在發酵過程定期測定還原糖含量，和甲殼低聚糖的生成量。其中本發明篩選的微生 物菌即淡紫擬青霉菌，能分泌一定量的胞外甲殼素酶，在人為的發酵調控條件下，使其具有 持續降解甲殼素的能力，使甲殼素被降解形成一定分子量(3000 4000)和濃度的甲殼低 聚糖。在發酵過程中蝦、蟹殼(甲殼素)一方面為該菌繁殖提供C/N營養，另一方面轉化為 發酵代謝產物(甲殼低聚糖)。在發酵的生產過程中，我們再通過人為控制發酵生產工藝 和流加工藝的辦法，流加補料為10%蝦、蟹殼粉混合懸浮液，置于流加罐中，通入蒸汽升溫 至121°C，保溫30分鐘滅菌，冷卻后備用，在發酵的中后期時，分三次逐步流加入發酵罐；使 發酵產物的含量得到一定程度的富集。發酵結束時測含甲殼低聚糖含量，直接泵入離心機， 在離心機5000rpm中，離心30分鐘，獲得上清液，把上清液泵入儲罐中備用；發酵液經離心 除菌，得到的上清液即為一定濃度的甲殼低聚糖產品。其次再經濃縮罐濃縮，把上清液泵入 雙效蒸發濃縮罐中，進行真空濃縮，濃縮至濃縮液甲殼低聚糖含量在10 15%時，泵入儲 罐備用，可使甲殼低聚糖的濃度進一步提高，最后再通過低溫噴霧干燥的方法，將甲殼低聚 糖濃縮液，采用噴霧干燥機，通過調節進料口溫度為150°C，出料口溫度70 75°C，進行噴 霧干燥，制得甲殼低聚糖干燥粉產品，甲殼低聚糖收率可達96%以上，水溶性好。噴霧干燥 的粉末中，還含有一定量的無機鹽成分，因此甲殼低聚糖3000 4000分子量的含量純度為 93.6%。該產品作為農用、畜牧食用，純度已完全可行，如需進一步提高含量產品精制，可通 過2倍的食用乙醇進行純化，即可獲得99%含量甲殼低聚糖產品，完全水溶。本發明具有本項目綜合運用微生物發酵法技術生產甲殼低聚糖，有效避免了傳統 甲殼低聚糖生產過程采用大量的酸堿用量，有效地提高了能源的利用率，以及避免用酶法 較高昂生產成本。可以較廉價地獲取純度較高的甲殼低聚糖產品，該產品可應用于醫藥、農 業、食品等領域，技術達到國際先進水平。


圖1為本發明一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法工藝流程圖。
具體實施例方式實施例1:往滅菌好的發酵液中接種入種子罐培養好的發酵菌，攪拌通風發酵，剛接種后通 風量為1 :0. 05v/v.min，在發酵的過程，再根據二氧化碳的產生量，逐步增加通風量，當二 氧化碳含量每立方氣體體積每增加5克當量時，通風量就增加0. 05v/min，并逐步提高發酵 溫度，分四次提高溫度，初溫為28°C，10小時第一次提溫為29°C，16小時左右第二次提溫 30 0C，20小時左右第三次提溫31°C，28至30小時左右第四次提溫33. 5 °C。實施例2:菌種的制備從冰箱中取出淡紫擬青霉菌種的保藏斜面，轉接到生產斜面上，一般 一根保藏斜面轉接5根生產斜面，進行菌種活化，再把轉接好的生產斜面放入28°C的培養 箱中培養3天；當長滿斜面后即可接種入一級三角瓶中28°C培養3天，三角瓶中的培養基 為2. 5%蝦、蟹殼粉水懸浮液和0. 02%蛋白胨制成培養基；經鏡檢如菌絲健壯即可接入二 級三角瓶中28°C培養2天，二級三角瓶培養基與一級相同；經鏡檢如菌絲健壯即可接入種 子罐中28°C培養36小時，接種量為5% V/V。
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實施例3:為進一步提高甲殼低聚糖的含量，可用噴霧干燥完的粉末甲殼低聚糖固體體積 1. 5倍量的食用乙醇進行溶解，使可溶于乙醇的無機鹽和其他可溶性雜質溶于乙醇中因為 甲殼低聚糖不容乙醇，攪拌20min，板框過濾，得到干物質，低溫抽真空干燥，就可得到99% 含量甲殼低聚糖。實施例4:菌種從多種土壤中分離獲得多種淡紫擬青霉菌株，用平板分析甲殼降解能力好的 菌株，此菌株為來源南靖亞熱帶原始森林土壤，分離獲得的淡紫擬青霉菌株，再通過鈷-60 和紫外線交替誘變，獲取能直接降解蝦、蟹殼粉末，形成甲殼低聚糖(3000 4000分子量) 產品的新淡紫擬青霉菌株，通過多次的接種三角瓶蝦、蟹殼粉發酵和接種種子罐發酵，采用 流量計、二氧化碳檢測儀、溫度計、酸度計、液相色譜儀等儀器的測定，得到一組發酵參數， 根據發酵工程原理，確定出合適的發酵溫度和發酵通風量。發酵條件即初始溫度28°C、一 次提溫至29°C、二次提溫至30°C、三次提溫至31°C、四次提溫至33°C;發酵周期為60小時； 發酵通風量為初始風量1 :0. 05、二次風量1 :0. 1、三次風量1 :0. 15、四次風量1 :0. 2、五次 風量1 :0.25。最終獲得一定含量的產品，基本滿足工業化生產所需要的濃度，生產成本較 低，產品純度較高，水溶性好。
權利要求
一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其特征是以新鮮的蝦殼或蟹殼為原料，經原料的制備、發酵原液配制、發酵原液滅菌、接種發酵、流加補料、離心去菌體、真空濃縮、噴霧干燥、產品精制，獲得產品甲殼低聚糖；(1)原料的制備新鮮的蝦殼或蟹殼曬干，粉碎成120目的干粉備用；(2)發酵原液配制以重量比2.5％的蝦、蟹殼粉與水混合均勻，再加入0.02％蛋白胨，制成發酵原液；(3)發酵原液滅菌把配制好的發酵原液泵入發酵罐，密閉罐體，加入蒸汽進行滅菌，使料溫升至121℃，保溫30分鐘，然后逐漸冷卻至28℃；(4)接種發酵往滅菌好的發酵液中接種入5％種子罐培養好的發酵菌，攪拌通風發酵，剛接種后通風量為10.05v/v.min，在發酵的過程，再根據二氧化碳的產生量，逐步增加通風量，并逐步提高發酵溫度，在發酵過程定期測定還原糖含量，和甲殼低聚糖的生成量；(5)流加補料流加料為10％蝦、蟹殼粉混合懸浮液，置于流加罐中，通入蒸汽升溫至121℃，保溫30分鐘滅菌，冷卻后備用，在發酵的中后期時，分三次逐步流加入發酵罐；(6)離心去菌體發酵結束時需測含甲殼低聚糖含量，直接泵入離心機，在離心機5000rpm中，離心30分鐘，獲得上清液，把上清液泵入儲罐中備用，抽樣檢測含甲殼低聚糖量；(7)真空濃縮把上清液泵入雙效蒸發濃縮罐中，進行真空濃縮，濃縮至濃縮液甲殼低聚糖含量在10～15％時，泵入儲罐備用；(8)噴霧干燥將甲殼低聚糖濃縮液，采用噴霧干燥機，通過調節進料口溫度為150℃，出料口溫度70～75℃，進行噴霧干燥，制得甲殼低聚糖干燥粉產品，甲殼低聚糖收率可達96％以上，水溶性好。(9)產品精制噴霧干燥的粉末中，還含有一定量的無機鹽成分，因此甲殼低聚糖3000～4000分子量的含量純度為93.6％。該產品作為農用、畜牧食用，純度已完全可行，如需進一步提高含量，可通過2倍的食用乙醇進行純化，即可獲得99％含量甲殼低聚糖產品，完全水溶。
2.根據權利要求1所述的一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其特征是2.5% 蝦、蟹殼粉混合懸浮液為1. 5%的蝦殼粉和蟹殼粉與水混合與0. 02蛋白胨制成發酵液， 流加液是10%蝦、蟹殼粉混合懸浮液為6%的蝦殼粉和4%的蟹殼粉與水混合成懸浮液。
3.根據權利要求1所述的一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其特征是種入 種子罐培養好的發酵菌，其發酵菌是為培養成熟的淡紫擬青霉菌菌種的制備斜面保藏菌 種一活化生產斜面一一級三角瓶擴培一二級三角瓶擴培一種子培養為成熟菌種，接種量為 5%發酵液量。
全文摘要
本發明公開了一種用微生物菌即淡紫擬青霉菌Paecilomyces lilacinus為發酵菌，以蝦殼粉為原料，通過微生物發酵生產甲殼低聚糖的工藝。該工藝包括利用微生物菌即淡紫擬青霉菌Paecilomyces lilacinus的耗氧深層發酵，降解蝦、蟹殼，并在發酵中后期通過再流加工藝，使發酵產物的含量得到一定程度的富集，發酵液經離心除菌，得到的上清液即為一定濃度的甲殼低聚糖產品，再經濃縮，即可進一步產生高濃度甲殼低聚糖。所得到的甲殼低聚糖可用于醫藥、農業、食品領域，整個生產工藝簡便高效，具有廣泛的工業化發展前景，為蝦、蟹殼找到了一條綠色的應用途徑。
文檔編號C12R1/79GK101880699SQ201010212749
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者尤越, 林克明, 林明煌 申請人:尤越;林克明;林明煌