基因phyb在控制水稻干旱脅迫耐性中的用途的制作方法

專利名稱：基因phyb在控制水稻干旱脅迫耐性中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程技術領域，具體涉及一種控制水稻干旱脅迫耐性的基因 PHYB的應用。
背景技術：
干旱已是世界性的問題，世界干旱、半干旱地區已占陸地面積的1/3以上，干旱對 植物的影響在諸多自然逆境因素中占首位。旱災造成的糧食損失要占全部自然災害糧食 損失的一半以上。國務院第二次全國農業普查領導小組辦公室、國土資源部和國家統計局 2008年2月29日發布第二次全國農業普查主要數據公報(第六號)顯示，截至2006年10 月31日，全國耕地面積一半以上是旱地。在自然條件下，干旱脅迫不僅嚴重影響了作物生 長發育和產量，而且限制了植物的分布。因此培育高抗農作物新品種成了一個高度緊迫的 重大問題。隨著分子生物學技術的發展，基因工程已成為當今種質資源創新和改良的強有 力的武器。水稻是世界第一大糧食作物，解決了全世界大約一半以上人口的吃飯問題。然而 干旱也嚴重地影響著水稻的種植和生產，在我國，僅2001年華北、西北和東北地區的466. 7 萬hm2稻田種植面積就因為缺水而減少了 53. 3萬hm2。此外，水稻生產直接受到水資源分 布的影響，我國大部分地區耕地是干旱和半干旱地區，因此水資源的缺乏和水稻需水量大 的矛盾嚴重影響水稻種植面積的推廣。目前用于抗旱基因工程的基因主要包括以下幾類。第一，參與滲透保護物質(如 脯氨酸、甘露醇、甜菜堿、海藻糖等)合成的基因。這樣能夠使植物在水分脅迫下能合成 更多的滲透調節物質，以提高植物的滲透調節能力，從而增強植物的抗旱性。如在水稻中 過量表達脯氨酸生物合成途徑上的關鍵酶基因(P5CS，deltal-pyrroline-5-carboxylate synthase)提高了轉基因植株的抗旱性(Zhu等，Plant Sci，1998，199 :41_48)；第二，與清 除活性氧相關的基因。這類基因的表達增強植物對活性氧自由基的清除能力，使植物在水 分脅迫下過量表達一些酶(如SOD，POD, CAT等)，以有效地排除有害的活性氧自由基，從 而提高細胞耐脫水的能力。這類基因在水稻中的應用未見報道；第三，編碼晚期胚胎富含 蛋白(LEA)的基因。推測LEA蛋白可能有以下三方面的作用①作為脫水保護劑，由于LEA 蛋白在結構上富含不帶電荷的親水氨基酸，它們既能像脯氨酸那樣，通過與細胞內的其他 蛋白發生相互作用，使其結構保持穩定，又可能給細胞內的束縛水提供了一個結合的襯質， 從而使細胞結構在脫水中不致遭受更大的破壞。②作為一種調節蛋白而參與植物滲透調 節。③通過與核酸結合而調節細胞內其它基因的表達。如在水稻中組成型地過量表達大麥 的HVAl基因，導致轉基因植株耐旱性增強(Xu等，Plant Physiol, 1996,110 249-257)；第 四，調控基因。這類基因包括與ABA途徑相關的基因，包括ABA生物代謝相關基因(如NCED 和ABAox)及ABA信號傳導途徑相關的基因(如編碼bZIP類、Myb類、zinc-finger類轉 錄因子的基因)。最近多個bZIP類轉錄因子被證明影響水稻干旱脅迫耐性，如0sbZIP23、 0sbZIP72 和 TRABl 等(Xiang 等，PlantPhysiol，2008，148 :1938_1952 ；Lu 等，Planta，2009， 229 :605-615 ;Hobo 等，Proc Natl AcadSci USA，1999，96 :15348_15353)。其它的調控基因
3如 SNACl 和 OsSKIPa 也參與水稻干旱脅迫耐性(Hu 等，Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 35 12987-12992 ；Hou 等，Proc Natl AcadSci USA, 2009,106 :6410_6415)。特別是 OsSKIPa 過 量表達的轉基因水稻植株不僅提高了清除活性氧的能力，而且許多脅迫相關基因(SNAC1、 CBF2、PP2C和RD22)轉錄水平也提高。由于人們對植物抗旱的分子機制缺乏了解，抗旱分子育種還有很大的盲目性。而 且水稻抗旱作用是眾多抗旱基因共同表達的結果，采用單基因策略提高植物的抗旱性在實 際生產應用中效果不明顯，如果改變一個基因的表達能夠整體調控植物耐旱反應能力，那 將是一個理想的選擇。光敏色素(phytochrome，phy)是植物體內的一種重要光受體，主要感受紅光和遠 紅光，參與調節植物生命循環中多個重要發育過程(Bae和Choi，Armu Rev Plant Biol, 2008,59 :281-311)。高等植物的光敏色素由一個小基因家族編碼，在擬南芥中光敏色素基 因家族由 5 個成員(PHYA-PHYE)組成(Sharrock 和 Quail，Genes Dev, 1989,3 :1745_1757 ； Clack等，PlantMol Biol，1994，25 :413_427·)。水稻光敏色素基因家族包括3個成員 PHYA、PHYB 和 PHYC (Kay 等，Nucleic Acids Res, 1989，17 :2865_2866 ；Dehesh 等，Mol Gen Genet, 1991,225 :305_313)。圖位克隆和全基因組序列檢索顯示，PHYA、PHYB和PHYC位于 水稻的第3染色體，其中PHYB基因位于短臂，在基因組中以單拷貝形式存在。Takano等人 的研究表明水稻PHYB感受紅光調節水稻幼苗去黃花、幼苗葉片與葉鞘之間的角度和花期 等水稻的生長發育(Takano 等，Plant Cell, 2005，17 :3311_3325)。本發明在水稻日本晴中，降低編碼水稻光敏色素B的PHYB基因的表達水平，顯著 提高了水稻干旱脅迫耐性。因此，在水稻中抑制PHYB基因的表達對于提高水稻干旱脅迫耐 性具有重要意義，這為水稻的高抗旱性育種提供新的思路。

發明內容
本發明的目的在于克服現有的技術缺陷，提供了一種提高水稻干旱脅迫耐性的基 因PHYB的應用。基因PHYB在提高水稻干旱脅迫耐性中的用途，在水稻中利用反義技術降 低PHYB基因的表達后，發現轉基因陽性植株的干旱脅迫耐性提高。在干旱條件下，對照組 水稻幼苗的存活率為百分之五至百分之十，轉反義PHYB基因的轉基因植株的存活率為百 分之七十以上。本發明是這樣實現的本發明利用水稻PHYB基因的cDNA片段作為應用基因，將該基因反向轉入水稻日 本晴中，抑制水稻PHYB基因的表達，轉基因水稻植株表現出較強的干旱脅迫耐性。申請人:在 NCBI 網站(www. ncbi. nlm. nih. gov)上輸入“phytochrome B”和“Oryza sativa”，得到序列號為AB109892的編碼水稻光敏色素B的基因的信使RNA序列。水稻PHYB 基因信使RNA序列為4223個堿基，編碼1171個氨基酸。本發明是通過PCR方法，擴增出水 稻PHYB基因的全長編碼區，包含3516個堿基，反向連接在植物表達載體ρIGl2 lHm-8上。再 進行遺傳轉化至水稻品種日本晴中，抑制水稻內源PHYB基因的表達，得到水稻PHYB基因表 達受到抑制的轉基因植株。在轉基因的T3代植株中發現，陽性水稻植株的干旱脅迫耐性明 顯高于陰性植株。 本發明用于構建反義PHYB基因植物表達載體、能夠抑制內源PHYB基因表達的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發明的優點在于(1)本發明提供了一種提高水稻干旱脅迫耐性的基因PHYB的應用。申請人在水 稻品種日本晴中，抑制水稻PHYB基因表達后，發現轉基因陽性植株的干旱脅迫耐性明顯提 高。在同樣條件下失水和復水處理后，發現70%以上轉基因陽性植株能夠恢復正常生長，而 對應的野生型植株僅僅5% -10%恢復正常生長。(2)本發明首次在水稻中抑制表達水稻PHYB基因。為培育高抗旱水稻品種提供了 新的思路，也為其它作物利用同源基因技術提高抗旱性提供了理論支持。(3)本發明中應用的基因可以為水稻等禾谷類作物以及其它作物抗旱性研究提供 支持。


圖1為本發明的反義PHYB基因表達載體的構建示意圖。具體為把pIG121Hm 植物表達載體上的SacI位點替換成KpnI酶切位點，構建成pIG121Hm-8植物表達載 體。將克隆在PMD18-T載體上的PHYB基因利用KpnI和XbaI酶切，替換pIG121Hm-8植 物表達載體上KpnI和XbaI之間的DNA片段，這樣PHYB基因反向插入35S啟動子后，即 pIG121Hm-anti-PHYB 植物表達載體。圖2為用Western blot檢測T3代轉基因陽性植株中PHYB蛋白質的表達水平結 果圖。其中anti-PHYB表示轉反義PHYB基因的植株；1_6代表不同陽性轉基因株系。圖3為轉反義PHYB基因植株和野生植株的干旱脅迫耐性比較圖。其中anti-PHYB 表示轉反義PHYB基因的植株。圖4為轉反義PHYB基因植株和野生植株的根系長度比較圖。其中anti-PHYB表 示轉反義PHYB基因的植株。圖5為轉反義PHYB基因植株和野生植株的氣孔導度和蒸騰速率比較圖。其中 anti-PHYB表示轉反義PHYB基因的植株。A圖表示氣孔導度，B圖表示蒸騰速率。
具體實施例方式以下實施例定義了本發明，并描述了本發明在分離克隆用于構建反義PHYB基因 植物表達載體的DNA片段，以及驗證功能的方法。根據以下的描述和這些實施例，本領域技 術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下，可以對本 發明做出各種改變和修改，以使其使用不同的用途和條件。實施例1 分離克隆用于構建反義PHYB基因植物表達載體的DNA片段采用TRIZOL試劑(Invitrogen)從水稻品種日本晴(公開報道的一個品種)的葉 片中提取總RNA。具體步驟如下將20毫克葉片放至液氮預冷的研缽中，加入液氮快速磨成 粉末，將粉術裝入1. 5ml離心管中，迅速加入Iml Trizol (Invitrogen)顛倒混勻，室溫靜置 5分鐘。在4°C，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1. 5ml離心管中。加入200 μ 1 氯仿，用手劇烈搖動15秒鐘，室溫靜置2-3分鐘。4°C，12000rpm離心15分鐘。取無色水相 至一新的1. 5ml離心管中，加入250 μ 1異丙醇，250 μ 1高鹽溶液，顛倒混勻，室溫靜置10分 鐘。40C，12000rpm離心10分鐘，吸除上清液。加入Iml冰冷的75%乙醇，上下倒置幾次，然后4°C，7500rpm離心5分鐘，棄上清，在室溫干燥至沉淀變透明。加入適量的DEPC水(一 般為60 μ 1)溶解沉淀，利用紫外分光光度計測定RNA的濃度。利用反轉錄酶SuperScript II (Invitrogen)將其反轉錄成cDNA，具體步驟如下 依次加入 1 μ 1 500 μ g/ml oligo (dT) 12-18,2μ g 總 RNA、1 μ 1 IOmM dNTP 混合物和 DEPC 水至12μ 1，在65°C水浴中5分鐘，迅速冰浴5分鐘，稍微離心收集樣品于管底。然后依次 加入 4μ1 5 X 第一鏈緩沖液、2 μ 1 0. IM DTTiPlyl RNaseOUT (40U/μ 1)，42°C，2 分鐘。 然后加入1 μ ISuperScript II，輕微混合均勻，42°C反應50分鐘，然后70°C水浴15分鐘 使酶失活，這樣就合成了第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板擴增目的基因。用帶有酶切 位點的上游引物 PHYBF(5’ -ATG GTA CCA TGG CCT CGG GTA GCC-3，(SEQ ID N0:3)，序列 特異引物外加KpnI位點和兩個保護堿基)和下游引物PHYBR(5’ -ATT CTA GAT CAG CTT GTC CCCCTAC-3，(SEQ ID NO :4)，序列特異引物外加XbaI位點和兩個保護堿基)。利用 PrimerSTARHS DNA polymerase with GC buffer (TaKaRa)進行擴增目的片段，PCR 反應條 件是94°C預變性1分鐘；98°C 10秒，68°C 4分鐘，30個循環。利用TArget Clone -Plus 試劑盒(Τ0Υ0Β0)在PCR產物末端加Α。然后連接到pMDIS-T載體(TaKaRa)。篩選陽性克隆 并測序，獲得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO 1所示)，將該克隆命名為pMD18_PHYBcDNA。實施例2 反義PHYB基因植物表達載體的構建和遺傳轉化為了能更好地分析PHYB的功能，申請人通過反義技術使PHYB基因在水稻中的表 達水平降低。根據轉基因植株的表型和生理特征研究該基因的功能。反義PHYB基因植物表達載體的構建方法如下首先將實施例1中得到的陽 性克隆PMD18-PHYB cDNA用KpnI和XbaI雙酶切，回收插入片段；同樣，用同樣的方法 酶切pIG121Hm-8的植物表達載體，回收載體片段。用回收的插入片段和載體片段做連 接反應，轉化大腸桿菌XLl-Blue。通過酶切篩選陽性克隆，獲得植物表達載體，命名為 pIG121Hm-anti-PHYB(見圖1)。pIG121Hm_8是在國際常用的植物遺傳轉化載體pIG121Hm 基礎上，用KpnI酶切位點取代⑶S基因編碼區和終止區之間的SacI位點所得到的(見圖 1)。將 pIG121Hm-anti-PHYB 轉化至 EHA105 宿主菌。通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系(參見本發明后面的實施例)將其導入到水 稻品種日本晴中，經過預培養、侵染、共培養、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、移苗 得到轉基因植株。農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系在Hiei等人報道的方法基礎上改良進 行(Hiei等，Plant J，1994，6 :271_282)。轉化共獲得30株獨立的轉基因水稻植株。具體步驟(1)愈傷誘導去殼的野生型日本晴水稻種子，用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗4-5次；播種于愈傷誘導培養基 (成分見后)，于25-26°C暗培養4-7天后，將從成熟胚盾片處誘導出初生愈傷組織，用鑷子 去掉胚上長出的胚芽，繼代于愈傷誘導培養基繼續培養2周，直至長出色澤淡黃，質地堅硬 呈顆粒狀的胚性愈傷組織。(2)愈傷組織的預培養將愈傷組織轉至新鮮的愈傷誘導培養基，于25-26°C暗培 養4天。(3)農桿菌培養挑取農桿菌單克隆接種到5ml YEP液體培養基中(含有50mg/L 卡那霉素、25mg/L鏈霉素和50mg/L潮霉素)，28°C，220rpm,培養至對數生長晚期(大約培養18-24小時)。將獲得的菌液按接種量轉接到50ml新鮮的、含抗生素的AB液體培養 基中(成分見后)，28°C，220rpm,培養至0D600值為0. 5左右(大約培養5_6小時)。(4)農桿菌侵染把50ml菌液轉入離心管，4°C，4000g離心10分鐘，棄上清。加入 等體積的AAM培養基(成分見后)重懸菌體。把(2)的日本晴胚性愈傷組織浸入上述AAM 菌液，侵染2分鐘，緩慢搖動。用無菌吸水紙將愈傷組織吸干，置于共培養培養基(成分見 后)上(培養基上鋪一層無菌濾紙)，26°C，黑暗共培養2-3天。(5)愈傷洗滌和選擇培養共培養后的愈傷組織用無菌水洗4次，然后再用含 500mg/L羧芐青霉素Cb的無菌水洗2次，再用無菌吸水紙吸干后置于工作臺吹30分鐘。將 愈傷組織置于含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧芐青霉素的固體篩選培養基(成分見后)上， 26°C暗培養2周。然后轉移到含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧芐青霉素的固體篩選培養基 (成分見后)上，26°C暗培養，每2周繼代一次，篩選4周。(6)分化培養把抗性愈傷組織轉移至分化培養基(成分見后)上，28°C光照培養 7天，轉接一次后，培養至產生再生苗。(7)壯苗、移栽將再生的小植株轉至新鮮的1/2MS培養基(成分見后)上，于培養 瓶中生根壯苗。待小苗長至IOcm左右，打開封口膜，煉苗2-3天，將再生苗移至土中培養。試劑配方(1)試劑和溶液縮寫本發明中作用到的植物激素的縮寫表示如下 Cb (Cabenici 11 in，羧節青霉素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；DMSO (Dimethyl sulfoxide，二甲基亞砜)。(2)用于水稻遺傳轉化的培養基配方1)YEP液體培養基2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，Ig NaCl，加水定容至200ml，用 5N NaOH 調 PH 至 7. 0。2)愈傷誘導培養基N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，0. 5g/L酸水解酪蛋白， 30g/L 蔗糖，2mg/L 2,4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH 5.8。3)AB 液體培養基3g/L K2HPO4, lg/L NaH2PO4, lg/L NH4Cl, 300mg/L MgSO4 · 7H20， 150mg/L KCl, lOmg/L CaCl2 · 2H20, 2. 5mg/L FeSO4 · 7Hx0，5g/L 葡萄糖，pH 7. 0。4) AAM培養基AA大量，AA微量，0. 9g/L L-谷氨酰胺，0. 3g天冬氨酸，MS維生素， 0. 5g/L 酸水解酪蛋白，36g/L 葡萄糖，68. 5g/L 蔗糖，20mg/L AS, pH 5.2。5)共培養培養基N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖， 0. 5g/L 酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D, 20mg/LAS, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH 5.8。6)固體篩選培養基N6大量、N6微量和N6維生素，0. 5g/L酸水解酪蛋白，30g/L 蔗糖，2mg/L 2,4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH 5. 8，合適濃度的潮霉素和羧芐青霉素。7)分化培養基MS大量，MS微量，鐵鹽和MS維生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗 糖，30g/L 山梨醇，2mg/L KT, 0. 2mg/L NAA, pH 5. 8，30mg/L 潮霉素 B，200mg/L 羧芐青霉素。8) 1/2MS 培養基:1/2MS 大量，1/2MS 微量，MS 維生素，30g/L 蔗糖，4g/L Gelrite， 30mg/L潮霉素B，200mg/L羧芐青霉素，pH 5. 8.(3)主要溶液配方1)N6 大量元素(IOX)
7
KNO328. 3gKH2PO44. OgMgSO4 · 7H201. 85gCaCl2 · 2H201. 66g(NH4) 2S044. 63g用水定容IL2)N6 微量(1000X)MnSO4 · 4H204. 400gZnSO4 · 7H201. 500gH3BO31. 600gKI0. 800gNaMoO4 · 2H200. 250g用水定容IL3) N6 維生素(1000 X)甘氨酸200mg鹽酸硫胺素BlIOOmg鹽酸吡哆素B650mg煙酸50mg肌醇IOg用水定容IOOml3)MS 大量元素(IOX)KNO319. OgNH4NO316. 5gKH2PO41. 7gMgSO4 · 7H203. 7gCaCl2 · 2H204. 4g用水定容IL4)MS 微量(1000X)MnSO4 · 4H2022. 300gZnSO4 · 7H208. 600gH3BO36. 200gKI0. 830gNaMoO4 · 2H200. 250gCuSO4 · 5H200. 025gCoCl2 · 6H200. 025g用水定容IL5) MS 維生素(1000X)甘氨酸2OOmg鹽酸硫胺素BlIOmg
80089]鹽酸吡哆素B650mg
0090]煙酸50mg
0091]肌醇IOg
0092]用水定容IOOml
0093]6)鐵鹽(200 X)
0094]FeSO4. 7H205. 56g
0095]Na2EDTA. 2H207. 46g
0096]7) AA 大量(200 X)
0097]MgSO4. 7H205g
0098]CaCl2 · 2H203g
0099]NaH2PO43g
0100]KCl60g
0101]8)AA 微量(1000X)
0102]MnSO4 ‘ H2O10. Og
0103]ZnSO4 · 7H202. Og
0104]H3BO33. Og
0105]KI0. 75g
0106]NaMoO4 ‘ H2O0. 250g
0107]CuSO4 · 5H200. 025g
0108]CoCl2 · 6H200. 025g
0109]用水定容IL9)2，4-0儲存液(211^/1111)稱取2，4-D lOOmg，溶于Iml DMSO，加入蒸餾水定溶至49ml，然后加入0. 5N NaOH， 至完全溶解，于-20°C保存。10) Kinetin 儲存液(0. 2mg/ml)稱取Kinetin 10mg，溶于Iml IN K0H，加蒸餾水定溶至50ml，于4°C保存。11)離八儲存液(0.211^/1111)稱取NAA 10mg，溶于0.5ml IN K0H，加蒸餾水定溶至50ml，于4°C保存。12)乙酰丁香酮(100mg/ml)稱取乙酰丁香酮lOOmg，溶于Iml DMS0，于_20°C保存。實施例3 檢測轉基因水稻植株和野生型水稻的PHYB蛋白質水平以水稻品種日本晴和5個獨立的T3代轉基因水稻植株為材料，提取5葉期水稻 葉片的可溶性蛋白質，利用western blot檢測水稻葉片中PHYB蛋白質水平。具體方法如 下；從上述材料收集Ig水稻葉片，在液氮中充分研磨，加入2ml蛋白質提取緩沖液(IOOmM Tris-HCl，pH8. 3，5mM EDTA, 0. 2% β -巰基乙醇和蛋白酶抑制劑混合物)，混勻，在冰上放 置30分鐘。然后12000 Xg 4°C離心15分鐘。轉移上清液至另一管中，加入2/3體積的飽和 硫酸銨，混勻，冰上靜止30分鐘。12000Xg 4°C離心30分鐘。棄上清，沉淀用200 μ 1蛋白 質提取緩沖液懸浮。利用 Coomassie PLUS Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL) 測定蛋白質濃度。利用10% SDS-PAGE進行蛋白質電泳，每個上樣孔50 μ g蛋白質。電泳結束后，通過印跡法轉移到PVDF膜(Millip0re，Billerica，MA)。然后按照Takano等人的方法 進行免疫化學分析，檢測PHYB蛋白質水平(Takano等，Plant Cell, 2005,17 :3311_3325)。 結果表明，在6個獨立的轉基因水稻植株中，PHYB蛋白質的水平都明顯低于野生型(見圖 2)。實施例4 轉反義PHYB基因植株具有較強的干旱脅迫耐性將轉基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量) NaClO溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗4-5次；播種于含有0. 4%的瓊脂培養基的玻璃 培養瓶。在光照培養箱(14小時光照，28°C ；10小時黑暗，23°C )生長6天后，挑選生長一 致的幼苗轉移至土中，在溫室中培養(自然條件)至4葉期，停止澆水30天，轉基因植株比 野生型更早出現萎蔫現象，至所有植株均出現萎蔫現象后，加水恢復5天后統計結果顯示， 70%的轉基因植株能夠恢復正常生長，僅僅5. 7%野生型能夠恢復正常生長(如圖3)。相 同實驗重復3次，結果表明，發現70%以上轉基因陽性植株能夠恢復正常生長，而對應的野 生型植株僅僅5% -10%恢復正常生長。實施例5 轉反義PHYB基因植株主根較長本實施例將T3代轉基因植株和野生型植株播種在0. 4%瓊脂培養基上生長，以測 量主根長度。具體步驟如下去殼的轉基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分鐘； 5% (活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗4_5次；播種于含有0. 4%的 瓊脂培養基的玻璃培養瓶。為了模擬土壤生長條件，在播種后的種子上面加上一層無菌蛭 石，同時把培養瓶含有培養基的部分陷進蛭石中，以保證根免受光照。在光照培養箱(14小 時光照，28°C ;10小時黑暗，23°C)生長10天。測定主根長度。實驗設置3次重復。結果 顯示，轉反義PHYB基因植株的主根明顯長于野生型(圖4)。實施例6 轉反義PHYB基因植株蒸騰速率和氣孔導度降低。本實施例測定了 5葉期野生型和轉反義PHYB基因植株的蒸騰速率和氣孔導度。 具體步驟如下轉基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量) NaClO溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗4-5次，在暗條件下萌發3天。隨后轉移到土壤 中，在溫室中生長至5葉期。采用美國便攜式光合儀(LI-COR LI-6400)于晴朗無風的天氣， 上午9:30-11:00在強制光源(ΙδΟΟηπιοΙπ^ Γ1)下測定水稻野生型和轉反義PHYB基因植株 的第4片葉的氣孔導度(mol H2O Hi-2S-1)和蒸騰速率(mmol H2O. HT2iT1)。野生型和轉基因植 株分別測定至少5個植株，相同的實驗重復3次。結果顯示，轉反義PHYB基因植株的氣孔 導度和蒸騰速率都顯著低于野生型(圖5)。實施例7 轉反義PHYB基因植株產量不會降低本實施例分析了大田中生長的轉反義PHYB基因株系和野生型的千粒重和穗數和 產量。具體步驟如下轉基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯 含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗4-5次，在暗條件下萌發3天。隨后轉移到 土壤中生長至3葉期，移栽至大田中，2個水稻植株之間的距離是30cm χ 30cm。收獲時分 析轉基因植株和野生型的每個植株上的有效穗數、每個穗的重量和千粒重。結果表明，這些 參數在野生型和轉基因植株之間沒有差異。可見盡管轉基因植株蒸騰速率降低，但是轉基 因植株的產量并沒受影響。
權利要求
基因PHYB在控制水稻干旱脅迫耐性中的應用。
2.基因PHYB在控制水稻干旱脅迫耐性中的應用方法，其特征是，通過PCR方法，擴增出 水稻PHYB基因的全長編碼區，反向連接在植物表達載體pIG121Hm-8上，再進行遺傳轉化至 水稻品種日本晴中，抑制水稻內源PHYB基因的表達，得到水稻PHYB基因表達受到抑制的轉基因植株。
全文摘要
本發明公開了基因PHYB在控制水稻干旱脅迫耐性中的用途，屬于基因工程技術領域。本發明通過PCR方法，擴增出水稻PHYB基因的全長編碼區，反向連接在植物表達載體pIG121Hm-8上，再進行遺傳轉化至水稻品種日本晴中，抑制水稻內源PHYB基因的表達，得到水稻PHYB基因表達受到抑制的轉基因植株。在轉基因的T3代植株中發現，陽性水稻植株的干旱脅迫耐性明顯高于陰性植株在同樣條件下失水和復水處理后，發現70％以上轉基因陽性植株能夠恢復正常生長，而對應的野生型植株僅僅5％-10％恢復正常生長。
文檔編號C12N15/82GK101899449SQ20101021202
公開日2010年12月1日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者劉婧, 周晉軍, 畢玉平, 范仲學, 謝先芝, 錢鳳芹 申請人:山東省農業科學院高新技術研究中心