專利名稱：在酵母中高效表達n-酰基高絲氨酸內酯酶的dna及其構建的工程菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及在酵母中高效表達N-酰基高絲氨酸內酯酶的DNA及其構建的工程菌。
背景技術：
由于遺傳密碼具有簡并性，一種氨基酸可以有1-6個使用頻率不同的同義密碼 子。對于特定的物種，高表達的基因往往使用部分特定的同義密碼子，這些密碼子被認為 是該物種高表達基因的優越密碼子(optimal codon)，這種現象稱為密碼子偏愛性(codon bias)。密碼子的偏愛性使得克隆的外源基因往往難以在異種生物細胞高效表達。在酵母 中獲得高效表達的外源基因往往都是酵母偏愛密碼子所編碼的基因，通過對酵母基因使用 密碼子的統計分析證實所有的61個密碼子中有25個是酵母所偏愛的，因此對密碼子進行 偏愛性改造能大量提高重組蛋白在該系統中的表達量。N-酰基高絲氨酸內酯酶是一類特異性降解N-酰基高絲氨酸內酯類信號分子 (AHLs)的蛋白水解酶，通過水解AHLs生成酰基高絲氨酸，使AHLs失去活性，從而阻斷病原 菌的群體感應機制，使病原菌失去致病能力，其廣泛存在于多種微生物中。近年來N-酰基 高絲氨酸內酯酶作為一種新型抗菌策略(群體感應淬滅策略)的工具酶而成為研究的熱
點ο目前主要是通過構建轉基因植物、轉基因細菌研究其在群體感應淬滅中的作用機 制，而轉基因植物或轉基因細菌在實際應用中存在生物安全和有效性方面的問題。
發明內容
本發明的目的是提供在酵母中高效表達N-酰基高絲氨酸內酯酶的DNA及其構建 的工程菌。本發明提供的DNA分子，為如下(a)或(b)(a)序列表的序列2自5’末端第7至759位核苷酸所示的DNA ；(b)序列表的序列2所示的DNA。含有所述DNA分子的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發 明的保護范圍。所述重組表達載體可為在PPIC9載體的多克隆位點插入所述DNA分子得到的重組 質粒，優選為在PPIC9載體的EcoR I和Not I酶切識別位點之間插入所述DNA分子得到的
重組質粒。所述重組菌可為在宿主菌中導入所述DNA分子得到的重組菌，具體可為在宿主菌 中導入所述重組表達載體得到的重組菌。所述宿主菌可為畢赤酵母(Pichia pastoris), 具體可為畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115，優選巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) AiiA-B546M, CGMCC No. 3975。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) Ai Α-Β546Μ, CGMCC No. 3975 已于 2010 年 7
3月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北 京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No. 3975。所述的重組菌可用于生產N-酰基高絲氨酸內酯酶。本發明還保護一種生產N-酰基高絲氨酸內酯酶的方法，是培養所述重組菌，得到 N-酰基高絲氨酸內酯酶。所述方法具體可為30°C、250-280rpm(4-5Xg)培養所述重組菌，得到N-酰基高 絲氨酸內酯酶；培養過程中采用甲醇誘導。所述甲醇在所述培養液中的濃度優選為0. 5% (體積百分含量)。所述N-酰基高絲氨酸內酯酶的底物具體可為N-3-氧-辛酰高絲氨酸 內酯(3-OXO-C8-HSL)。本發明在現有N-酰基高絲氨酸內酯酶基因aiiaB546的基礎上，對其DNA序列進 行優化，改造成酵母偏愛密碼子所編碼的基因，得到了優化后的基因aiiaB546M，該優化后 基因在畢赤酵母中的表達能力顯著高于優化前基因。本發明構建了含有aiiaB546M的重組 表達質粒，將該重組表達質粒導入畢赤酵母，可以得到高效高絲氨酸內酯酶的重組菌。其中 一株重組菌的表達能力尤為高效。本發明可以降低N-酰基高絲氨酸內酯酶生產成本，提高 應用的安全性和有效性，對于高絲氨酸內酯酶的生產具有重大價值。
圖1為優化前基因和優化后基因的比對。圖 2 為 aiiaB546M/pUC57 的電泳圖；1 為 Ikb plus ladder Marker ；2 為質粒 aiiaB546M/pUC570圖3為酶切后質粒的電泳圖；1為為pPIC9載體雙酶切片段；2為質粒aiiaB546M/ pUC57雙酶切后的兩條片段，目的基因aiiaB546M為753bp ；3為Ikb plusladder Marker。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以 下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例中所用的質粒或菌株如下大腸桿菌(Escherichia coli) Transl 購買自北京全式金生物公司。畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115 購買自北京全式金生物公司。pPIC9 載體購買自 Invitrogen 公司。KYC55 指示菌(Agrobacterium tumefaciens KYC55)中國農業科學院飼 料研究所保證向公眾提供；參考文獻Zhu J，et al. Applied and Environmental Microbiology. 69 :6949_6953。pUC57載體購買自南京金斯瑞生物科技有限公司。實施例中所用的培養基和溶液如下LB培養基1 %蛋白胨、0. 5 %酵母提取物、1 % NaCl，pH7. 0。YPD培養基酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。
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MD固體培養基YNB 13. 4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4X 10_4g/L，瓊脂粉20g/L。BMGY培養基酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，酵母氮源(YNB) 13. 4g/L，生物素 4Xl(T4g/L，甘油 IOmL0BMMY培養基以0.5%甲醇(體積百分含量)代替甘油，其余成份與BMGY相同。葡萄糖基礎培養基葡萄糖0. 75g，瓊脂粉3g，超純水138g，滅菌冷卻后加入ATMM 鹽溶液 15mL, X-gal 溶液 200 μ L0溶液I :50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)，10mmol/L EDTA ；溶液II :0· 2mol/L NaOH, 1 % SDS(現配現用)；溶液III :3mol/L 醋酸鉀，5mol/L 醋酸(ρΗ4· 8)；TAE (50 X) :242g Tris 堿，57. ImL 冰乙酸，IOOmL 0. 5mol/L EDTA (ρΗ8· 0)，用無菌 水定容至1000mL。ATMM 鹽溶液KH2PO4 0. 079mol/L, NaOH 0. 044mol/L, (NH4)2SO4 0. 015mol/ L，MgSO4 · 7H20 0. 6mmol/L, CaCl2 0. 06mmol/L, FeSO4 ‘ 7H20 0. 027mmol/L, MnSO4· H2OO. 007mmol/L。PBS 緩沖液NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HP04 4. 3mmol/L, KH2PO4L 4mmol/L, pH7. 3，121 °C 高壓濕熱滅菌 20min。實施例中X-gal購自Sigma公司，DNA回收試劑盒購自TakaRa公司，各種限制性 內切酶和Taq酶均購自TakaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。實施例中的酶活測定方法如下方格紙邊長為18cm的正方形紙上排列22個長方形，每個長方形的長為15個小 方格，寬為2個小方格，每個小方格為邊長4mm。制備反應液20 μ L待測溶液+180 μ L PBS緩沖液(ρΗ8. 0)+1 μ L lmg/ ml3-oxo-C8-HSL ；30°C水浴，反應 0. 5h。制備瓊脂條將葡萄糖基礎培養基倒入直徑為18cm的大平板中，凝固后，按照方 格紙的線條用無菌小刀將培養基切成間隔4mm的22個長方形細條；在每個細條的前8mm處 用直徑為6mm的無菌打孔器壓成圈環，之后每隔4mm用無菌牙簽接入KYC55指示菌，再將反 應液10 μ L加入到打孔的圈環中，待滲入培養基后，用封口膜封好放入30°C溫箱，培養24h 后觀察結果，計數變藍的點，換算成距離，根據已制好的標準曲線計算酶活。以不加入酶液 的PBS緩沖液為CK。標準曲線制備用無水乙醇將N-酰基高絲氨酸內酯類信號分子(AHLs)稀釋成 系列的濃度梯度，并等體積加入上述瓊脂條的加樣圈內，每個稀釋度設定三個平行，平板置 于30°C培養24h。計數變藍的點，換算成距離，即測量顯色半徑，分析信號分子物質的量 (nmol/L)與半徑(cm)的關系，構建標準曲線。
U = 6.52*(e°_—-e°.:)48_)*50-(待測溶液為20 μ 1);
30*106U = 6. 52* (1. 4163Eck-l. 4163Es) *50/30/106(待測溶液為 20 μ 1)；e = 2. 718281828459045，R(距離mm)。Rck 不加入酶液的PBS緩沖液的擴散距 離。Rs:反應液樣品的擴散距離。以上兩個公式相同，第二個式子是對第一個式子的簡化。酶活單位⑶的定義在30°C，pH8. 0條件下，每分鐘降解Inmol底物N_3_氧-辛酰高絲氨酸內酯(3-OXO-C8-HSL)所需要的酶量。 實施例1、N-酰基高絲氨酸內酯酶基因密碼子的優化 一、高絲氨酸內酯酶基因密碼子的優化將N-酰基高絲氨酸內酯酶基因aiiaB546 (如序列表的序列1所示)進行密碼子 優化，優化后的基因aiiaB546M如序列表的序列2所示。基因aiiaB546和優化后的基因 aiiaB546M的比對見圖1。二、重組質粒 aiiaB546/pUC57 的構建1、人工合成序列表的序列1所示的aiiaB546基因。2、用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶切步驟1合成的基因，回收酶切產物。3、用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶切pUC57載體，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產物與步驟3的載體骨架連接，得到連接產物。5、將連接產物進行測序，測序結果表明，得到了的重組質粒aiiaB546/pUC57(在 PUC57載體的EcoR I和Not I酶切位點之間插入了序列表的序列1所示的DNA。三、重組質粒aiiaB546M/pUC57的構建1、人工合成序列表的序列2所示的aiiaB546M基因。2、用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶切步驟1合成的基因，回收酶切產物。3、用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶切pUC57載體，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產物與步驟3的載體骨架連接，得到連接產物。5、將連接產物進行測序，測序結果表明，得到了的重組質粒aiiaB546M/pUC57(在 PUC57載體的EcoR I和Not I酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的DNA。實施例2、重組表達載體的構建一、pPIC9_aiiaB546M 的構建1、分別提取重組質粒aiiaB546M/pUC57和質粒pPIC9采用北京天根生物技術公司的質粒小提試劑盒提取質粒，1. 2%瓊脂糖凝膠電泳 檢測(電泳緩沖液1 XTAE，電壓l-5V/cm，時間約30min)。重組質粒aiiaB546M/pUC57的電 泳圖見圖2。2、用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶切質粒pPIC9，回收載體骨架。1.0%瓊脂 糖凝膠電泳檢測，電泳圖見圖3。3、用限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶切重組質粒aiiaB546M/pUC57，回收750bp 左右的DNA片段(aiiaB546M)。1. O%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖見圖3。4、將步驟2回收的載體骨架和步驟3回收的DNA片段用T4DNA連接酶4°C過夜連 接，得到連接產物。5、連接產物的鑒定(1)大腸桿菌(E. coli) Trans 1感受態細胞的制備①取1/100體積的大腸桿菌Trans 1菌液，接種于500mL LB培養液中，37°C振蕩 培養過液，使其OD6tltl約為0. 5-0. 7 ；②將培養液冰浴20min，以后的步驟盡可能保持在0°C，所有的容器在加細胞之前 都預冷。③將步驟②的培養液4000g、4°C離心15min，棄上清；
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④用500mL預冷的10% (10g/100ml)甘油水溶液重懸細胞(沉淀)；4000g、4°C離 心15min，棄上清；用250mL預冷的10% (10g/100ml)甘油水溶液重懸細胞，4000g、4°C離心 15min，棄上清；用20mL預冷的10% (10g/100ml)甘油水溶液重懸細胞，轉移到30mL無菌 離心管中，4000g、4°C離心15min，棄上清；用l_2mL預冷的10% (10g/100ml)甘油水溶液重 懸細胞；將細胞按每管40 μ L分裝，液氮速凍，_70°C保存，備用(感受態細胞)。(2)連接產物的鑒定采用熱激轉化將步驟4的連接產物轉化步驟(1)制備的感受態細胞將40 μ L感 受態細胞與 ο μ L連接產混合，冰浴30min ；42°C水浴60sec，置于冰上2min ；加入500 μ L LB液體培養基，37°C搖床培養Ih ；涂布于含100 μ g/mL氨芐青霉素的固體LB平板，37°C溫 箱培養16h。挑取40個單克隆菌落進行PCR驗證，選取PCR陽性克隆送博邁德公司測序，得到 重組質粒pPIC9-aiiaB546M(在骨架載體pPIC9的EcoR I和Not I酶切位點之間插入了序 列表的序列2所示的DNA)。二、pPIC9_aiiaB546 的構建用重組質粒aiiaB546/pUC57代替重組質粒aiiaB546M/pUC57，其它同步驟一，得 到重組質粒pPIC9-aiiaB546 (在骨架載體pPIC9的EcoR I和Not I酶切位點之間插入了 序列表的序列1所示的DNA)實施例3、重組菌的制備一、轉aiiaB546M基因重組菌的制備和篩選1、質粒DNA的大量提取①取實施例2中得到的經過測序驗證的含有重組質粒pPIC9-aiiaB546M的大腸桿 菌Transl，接種于含100 μ g/mL氨芐青霉素的50mL LB培養基中，37°C振蕩過夜培養；②取過夜培養液50mL，10, 000rpm、4°C離心5min，棄上清，倒置離心管于吸水紙 上，吸去多余的液體；③將沉淀重懸于2mL溶液I中，劇烈振蕩，充分懸浮；加入4mL新鮮配置的溶液II， 顛倒混勻，冰上放置4min ；加入3mL溶液III，顛倒混勻，冰上放置5min，13，000rpm、4°C離 心 IOmin ；④移出上清，用擦鏡紙過濾；上清中加入0. 6-1倍體積的異丙醇，室溫放置IOmin ； 13，000rpm、4°C離心IOmin ；棄上清，70%乙醇洗沉淀，稍離心后傾去乙醇，將沉淀真空干燥 IOmin ；⑤在干燥后的離心管中，每管加入500 μ L ΤΕ，把沉淀打散，移入Eppendorf管 中，加入10 μ L RNase (20 μ g/mL)，37°C保溫30min ；每管加入500 μ L Tris飽和酚，混勻， 12，OOOrpm離心IOmin ；吸取上層水相于新Eppendorf管中，加入500 μ L酚氯仿混合液， 混勻，12，OOOrpm離心IOmin ；小心吸取上層水相于新Eppendorf管中，加入500 μ L氯仿混 勻，12，OOOrpm離心IOmin ；取上清，加入等體積異丙醇，冰上放置15min, 14，OOOrpm離心 15min ；棄上清，沉淀加500 μ L 70%乙醇洗，離心3min。⑥棄去乙醇，沉淀(pPIC9-aiiaB546M質粒)于真空干燥器中干燥IOmin ；離心管 中加入50 μ L TE液，-20°c保存備用。2、質粒的線性化
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取50 μ L pPIC9-aiiaB546M質粒，用限制性內切酶BglII37°C酶切2_3h，得到酶 切產物。向100 μ L酶切產物加入1/10體積的乙酸鈉(ρΗ5. 2)及2_3倍體積的無水乙醇 沉淀，13，OOOrpm離心15min，用70 %乙醇漂洗，真空干燥，離心管中加入10 μ L無菌水，置 于-20°C待用(線性化質粒)。3、畢赤酵母GS115感受態細胞的制備①挑取YPD平板上的畢赤酵母GS115單菌落于5mL YPD液體培養基中，30°C、 250rpm搖床過夜；②將搖床過夜的新鮮GSl 15菌液按1/1000接種量轉接至IOOmL YPD液體培養基 中，30°C、250rpm搖床過夜，0D600約為1. 3-1. 5時，停止振蕩；③將預冷的菌液轉移至冰預冷的離心管中，4°C、1500g離心5min ；沉淀用200mL預 冷的無菌水重懸，4°C、1500g離心5min ；沉淀用IOOmL預冷的無菌水重懸，4°C、1500g離心 5min ；沉淀用20mL預冷的lmol/L山梨醇水溶液重懸，4°C、1500g離心5min ；沉淀用ImL預 冷的lmol/L山梨醇水溶液重懸，按每管80 μ L分裝，液氮速凍，_70°C保存，備用(感受態細 胞)。4、重組菌的制備①將80 μ L步驟3的感受態細胞與10 μ L步驟2的線性化質粒混合，并將其轉至 電轉化杯中；②將裝有混合液的轉化杯冰浴5min ；調整好基因導入儀的參數(置于PIC檔)，電 擊一次，電壓2000V，時間約為5ms ；③立即往轉化杯中加入700 μ L預冷的lmol/L山梨醇水溶液，混勻，并將其轉至滅 過菌的離心管中；④將混合液涂于MD板上，將MD板置于30°C培養箱中培養2_3天，直到長出菌落為 止，即為轉aiiaB546M基因重組菌(轉化子)。5、高效表達菌株的篩選①用滅過菌的牙簽從長有轉化子的MD板上挑取單菌落，按照編號點到MD平板上， 每個平板上一般點100個單菌落；②按編號挑取MD平板上的單克隆接種于3mL BMGY培養基中，30°C、250_280rpm搖 床培養2-3天；③將搖床培養2-3天的培養液3250rpm離心5min，取沉淀(盡量將上清除盡)，再 往沉淀中加入ImL BMMY培養基，重新在30°C、250_280rpm誘導培養；④誘導培養48h后，將菌體離心，取上清作為待測溶液檢測酶活，篩選出酶活高的 菌株。設三組平行實驗，篩選出較穩定的高表達菌株。篩選得到一株高效表達高絲氨酸內酯酶的重組菌，將其命名為巴斯德畢赤酵母 (Pichiapastoris)AiiA-B546M。該菌株已于2010年7月02日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保 藏號為 CGMCC No. 3975。巴斯德畢赤酵母AiiA-B546M得到的待測溶液的酶活為36. 1 士0. 9U/mL,較對照菌 得到的待測溶液的酶活提高了 6. 92%。二、轉aiiaB546基因重組菌的制備
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取實施例2中得到的經過測序驗證的含有重組質粒pPIC9-aiiaB546的大腸桿菌 Transl，代替步驟一的1的①中的大腸桿菌，其它同步驟一，得到轉aiiaB546基因重組菌 (對照菌)。挑取MD平板上的對照菌單克隆接種于3mL BMGY培養基中，30°C、250_280rpm搖床 培養2-3天；將搖床培養2-3天的培養液3250rpm離心5min，取沉淀(盡量將上清除盡)， 再往沉淀中加入ImL BMMY培養基，重新在30°C、250-280rpm誘導培養；誘導培養48h后，將 菌體離心，取上清作為待測溶液檢測酶活；設三組平行實驗。對照菌得到的待測溶液的酶活為35. 6士 1. lU/mL。實施例4、重組菌的酶活測定分別將巴斯德畢赤酵母Ai iA_B546M和對照菌進行如下培養和酶活測定1、將菌株接種于裝有150mL BMGY培養基的500mL三角瓶，30°C、250_280rpm搖床 培養2-3天；2、取培養液，3250rpm離心5min，取沉淀(盡量將上清除盡)；3、往沉淀中加入80mL BMMY培養基，30°C、250_280rpm誘導培養；為補償甲醇的揮 發損失，每隔12h補加甲醇溶液，使菌液中的甲醇濃度保持在0.5% (體積百分含量)；每隔 12h取樣一次，直至48h ；4、將取樣的菌液離心，上清液作為待測溶液進行酶活測定；設三組平行實驗。巴斯德畢赤酵母AiiA-B546M得到待測溶液的酶活為36. 2 士 1. OU/mL。對照菌得 到的待測溶液的酶活為33. 1 士0. 7U/mL。即密碼子改造后，比改造前菌株的酶活性提高了 9. 53%，顯著性(P < 0. 05)。
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權利要求
DNA分子，為如下(a)或(b)(a)序列表的序列2自5’末端第7至759位核苷酸所示的DNA；(b)序列表的序列2所示的DNA。
2.含有權利要求1所述DNA分子的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3.如權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為在PPIC9載 體的多克隆位點插入權利要求1所述DNA分子得到的重組質粒。
4.如權利要求3所示的重組表達載體，其特征在于所示重組表達載體為在pPIC9載 體的EcoR I和Not I酶切識別位點之間插入權利要求1所述DNA分子得到的重組質粒。
5.如權利要求2所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是在宿主菌中導入權利要求1 所述DNA分子得到的重組菌；所述宿主菌為畢赤酵母(Pichia pastoris)，優選為畢赤酵母 (Pichia pastoris)GS115。
6.如權利要求5所述的重組菌，其特征在于權利要求1所述DNA分子通過權利要求3 或4所述重組表達載體導入所述宿主菌。
7.如權利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)AiiA-B546M, CGMCC No. 3975。
8.權利要求2、5、6或7所述的重組菌在生產N-酰基高絲氨酸內酯酶中的應用。
9.一種生產N-酰基高絲氨酸內酯酶的方法，是培養權利要求2、5、6或7所述的重組 菌，得到N-酰基高絲氨酸內酯酶。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中，30°C、250-280rpm培養所述重 組菌，培養過程中采用甲醇誘導，所述甲醇在所述培養液中的濃度優選為0. 5% (體積百分 含量)；所述N-酰基高絲氨酸內酯酶的底物為N-3-氧-辛酰高絲氨酸內酯。
全文摘要
本發明公開了在酵母中高效表達高絲氨酸內酯酶的DNA及其構建的工程菌。本發明提供的DNA為序列表的序列2所示的DNA。本發明在現有高絲氨酸內酯酶基因aiiaB546的基礎上，對其DNA序列進行優化，得到了優化后的基因aiiaB546M，該優化后基因在畢赤酵母中的表達能力顯著高于優化前基因。本發明構建了含有aiiaB546M的重組表達質粒，將該重組表達質粒導入畢赤酵母，可以得到高效高絲氨酸內酯酶的重組菌。其中一株重組菌的表達能力尤為高效。本發明對于高絲氨酸內酯酶的生產具有重大價值。
文檔編號C12N1/19GK101914556SQ201010239510
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者何夙旭, 劉玉春, 周志剛, 姚斌, 孟昆, 張宇婷, 張美超, 曹雅男 申請人:中國農業科學院飼料研究所