一種與香味性狀共分離的分子標記的制作方法

專利名稱：一種與香味性狀共分離的分子標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種與香味性狀共分離的分子標記，屬分子遺傳學領域，專用于水稻 香味品種的選育與遺傳研究，并可用于克隆香味基因。
背景技術：
香味是水稻重要的食味品質性狀。許多優良的水稻品種具有令人愉快的香氣，備 受消費者的歡迎，世界上每個水稻生產國或地區均有香稻種植。目前對香味的測定方法主要有咀嚼籽粒法、氫氧化鉀法、高效液相色譜法，前兩種 方法是通過嗅覺來進行的，咀嚼籽粒法大批量鑒定時會對舌頭和鼻子造成影響，氫氧化鉀 法對香味的釋放也有一定的局限性，鑒定不準。高效液相色譜為香味的測定提供了客觀的 方法，但該方法需要大批的樣品量，而且費時(Jin et al.，2003)。在香稻選育方面，利用分子標記輔助選擇可以準確、簡單、快速地選育香稻。許多 研究者對香味基因的遺傳分析和定位進行了研究，并為香稻育種提供了一些有用的分子標 記，但是目前所利用的分子標記距離較遠，對香味不能準確鑒定。到目前為止，大部分研究表明稻米香味是受一個隱性單基因控制的。Ahnet al. (1992)利用一對近等基因系Lemont和香Lemont，香Lemont的香味基因來自供體 Delia,以有香味分離的F3群體為材料，通過RFLP分析表明，香味基因與位于第8染色體 上的RG28連鎖，遺傳距離為4.5cM。李欣等(1995)以秈型及粳型標記基因系為材料，分 別與武進香秈、武進香粳雜交，以堿浸法測定雙親和Fp F2、及部分F3組合的葉香，結果表明 香味基因與位于第8染色體上的標記基因v-8表現連鎖，估算兩者的重組值約為38. 03% ±3. 84%0 Jin etal. (1995)用 CT9993/KDML105 的 F2 分離群體為材料，找到一個 RAPD 引 物，這個引物只在非香群體中擴增到1.5kb片段，并表現與香味性狀緊密連鎖，用該引物 對兩親本、F2分離群體單株和其它不同品種進行分析，進一步證明了這種多態的可靠性。 Lorieux et al. (1996)以DH群體為材料，利用RFLP、RAPD、STS和同工酶標記及氣相色 譜測定AcPy的濃度，證實了 AcPy是香味的主要成分，且香味基因與RG28相連鎖，距離為 5. 8cM，同時鑒定出2個QTL，一個位于第4染色體，另一個位于第12染色體。Garland et al. (2000)根據RG28在一對香稻與非香稻品種之間的多態性區域發展了一個微衛星標記 S⑶-RICE-SSR-I，并選擇附近區域的4個SSR標記對24個香稻和非香品種進行標記的多態 信息量分析，研究表明，S⑶-RICE-SSR-1、RM42和RM223可以用來區別不同品種中的香味 基因的復等位基因。Jin et al. (2003)找到了一個與香味基因連鎖的SNP標記RSP04，用 RSP04對50個單株構成的F2分離群體進行基因型分析，發現RSP04與香味基因之間有兩個 重組株，RSP04與香味基因相距2cM ；用RSP04對另外一個163個單株構成的F2分離群體進 行基因型分析，發現RSP04與香味基因之間有6個重組株，RSP04與香味基因相距約2cM。
3Dong etal. (2001)對三個日本當地香稻品種的三體遺傳分析表明，這三個香稻品種的香味 是由一個隱性基因控制的，均屬等位基因，位于第8染色體上。Siddiqet al. (1986)對一個 印度品種進行三體遺傳分析，發現有兩個隱性香味基因，分別位于第5和第9染色體。Chen 等(2006)把香味基因座定位在一個69kb的區間內。施軍瓊(2004)利用單片段代換系對 香味基因進行了初步定位，在兩個分離群體中香味基因均與RM223共分離，在以Basmati 385為供體的分離群體中，香味基因距兩側標記RM515和RM284分別為2. 7cM和3. 3cM，在 以美國茉莉香為供體的分離群體中，香味基因距兩側標記冊515和RM210分別為2. 9cM和 11. 8cM。利用分子標記對水稻香味基因的分子標記輔助選擇的技術國內外均有報道，但迄 今為止，關于水稻香味基因共分離的標記還未見報道，利用TPS溶液鑒定香味性狀也是第 一次報道。我國香稻資源豐富，從不同的水稻品種中發掘、鑒定和定位香味基因，找到鑒定香 味性狀準確可靠的方法，克服目前咀嚼法、KOH法和儀器分析法鑒定香味中不準的缺點，建 立共分離的香味基因分子標記，并利用與香味基因共分離的分子標記進行輔助育種，判斷 香味基因是以雜合和純合存在，能準確地選擇在香味基因座上純合和雜合的具有優異性狀 單株，而且能夠有目標地將香味基因在實驗室選擇得到，大大提高選擇的效率。

發明內容
本發明的目的是克服現有鑒定水稻香味的方法的不足之處，而提供一種鑒定水稻 香味的方法，以及為分子標記進行輔助育種提供一種與香味性狀共分離的分子標記，提高 選育效率。本發明該種鑒定水稻香味的方法如下(1)在分蘗期取水稻單株上部1-2片幼葉，保存于-80°C冰箱中備用；(2)取2-4cm長的水稻葉片放入1.5ml離心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液 900 μ 1，75°C水浴 20 分鐘；其中 TPS 溶液為=IOOmM Tris-HCl (ρΗ8. 0), IOmM EDTA (pH8. 0), IM KCl ；(3)打開蓋，用鼻聞，即可判定香味的有無。本發明所提供的與香味性狀共分離的分子標記，是由特異性PCR引物LOl上游端自5，-3，的核苷酸序列為CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT下游端自5，-3，的核苷酸序列為GTGTGCACTGGTCACTGTTTT或特異性PCR引物L02上游端自5，_3，的核苷酸序列為 ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT下游端自5，-3，的核苷酸序列為 CCAGACATAAATAATGGCATCTT經PCR擴增水稻基因組DNA得到的。其中引物LOl在香粳9407中擴增出280bp 的特異片段，在IRBB60中擴增出271bp的特異片段。引物L02在香粳9407中擴增出210bp 的特異片段，在IRBB60中擴增出200bp的特異片段。利用本發明提供的鑒定水稻香味的方法對曲阜香稻、明水香稻、香粳9407(均為 公知公用品種，國家種子庫均有保存，可對外提供)分別和水稻品種IRBB60(公知公用品 種，國家種子庫均有保存，可對外提供)雜交的F2分離群體進行香味性狀鑒定。在分蘗期
4取水稻單株上部1-2片幼葉，保存于_80°C冰箱中備用。取2-4cm長的水稻葉片放入1. 5ml 離心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液900μ 1，75°C水浴20分鐘。打開蓋，用鼻聞，可準確 判定香味的有無。TPS 溶液配方IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)，IOmM EDTA (pH8. 0)，IM KCl。此外本發明人設計出了 2對特異性的PCR引物，它能對水稻苗期香味性狀進行標 記鑒定，檢測是否具有香味基因fgr，其檢測的準確性高，操作簡單。由于曲阜香稻、明水香 稻、香粳9407是普遍應用的雜交品種的親本，因此該分子標記還具有檢測是否具有香味性 狀的普遍意義，可以作為其他以香稻品種作為親本育種材料的檢測工具。本發明該種鑒定水稻香味的方法及與香味性狀共分離的分子標記，具有以下優占.
^ \\\ ·(1)利用本發明鑒定水稻香味的方法(TPS法)鑒定水稻香味，簡單易行，準確方 便。利用KOH法不能準確判定香味性狀的單株，利用TPS法可準確判定。(2)標記穩定，不受環境影響。通過本發明設計的特異性PCR引物，2007年在不同 生育期取樣，用這兩標記進行檢測，標記表現穩定，不受環境影響。(3)輔助育種選擇目標明確，節約成本。通過PCR標記的擴增，可以判定香味基因 是以純合或雜合狀態基因型存在的單株，加快香味性狀分子標記輔助育種，大大提高選擇 的效率。


圖1 標記LOl對香粳9407X IRBB60雜交的F2代分子標記輔助選擇電泳圖譜M 為 Marker，P1，香粳 9407 ；P2, IRBB60 ；1-20, F2 分離單株。圖2 標記L02對香粳9407 X IRBB60雜交的F2代分子標記輔助選擇電泳圖譜M 為 Marker，P1，香粳 9407 ；P2, IRBB60 ；1-20, F2 分離單株。
具體實施例方式1、F2群體的創建和表型鑒定2005年利用曲阜香稻、明水香稻、香粳9407分別與IRBB60雜交，年底F1種子送海 南島三亞加代，自交產生F2種子。2006年將F2分離群體播種于山東省水稻研究所實驗農 場，5月1號播種，6月20號插秧，單株插植。插秧20天抽提F2分離群體的單株DNA，并利 用本發明鑒定水稻香味的方法(TPS法)鑒定水稻單株的香味性狀，分有香味和無香味兩種 表型，每個分離群體種植3000株，共9000株。2、F2分離群體的分子標記分析(1)用CTAB法提取曲阜香稻/IRBB60、明水香稻/IRBB60、香粳9407/IRBB60雜交 的F2各單株DNA。(2) SSR分析參照Panaud et al. (1996)的方法。20 μ 1 PCR反應體系為模板DNA IOng/μ 1,0. 15 μ 1 IOmM dNTPs，1· 5 個單位的 Taq 酶，2μ 1 10 X PCRbuffer (含 MgCl2)， 1. 5 μ 1的2uM正向和反向引物，反應體積20 μ 1。PCR反應程序為DNA 94°C預變性5min， 然后 94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，最后 72°C延伸 5min。在 PTC-200PCR 儀 上進行擴增，擴增產物在6%聚丙烯酰胺膠上進行分離電泳，銀染參照李文濤等(2002)的 方法進行顯色觀察，記錄實驗結果。
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(3)水稻香味基因fgr已經被定位在水稻第8染色體RMl 109和PSM465之間(Chen et al. 2006，Fen, 2005)。在此基礎上，利用RMl 109和PSM465對三個組合F2分離群體的 9000個單株進行擴增，在兩個標記之間共篩選到106個交換株，利用本發明鑒定水稻香味 的方法(TPS法)鑒定水稻交換株的香味。同時根據所在區域日本晴和9311的基因組序 列，利用Primer Premier Version5設計PCR引物對LOl (上游端自5’ -3’的核苷酸序列 為 CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT，下游端自 5，-3，的核苷酸序列為 GTGTGCACTGGTCACTGTTTT)和 L02(上游端自5，-3，的核苷酸序列為ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT，下游端自5，-3，的核 苷酸序列為CCAGACATAAATAATGGCATCTT)，進行擴增。結果表明在曲阜香稻、明水香稻、香粳 9407和IRBB60之間LOl和L02表現多態性，其中在香粳9407和IRBB60的擴增結果如附 圖1，2所示。通過分析交換株的基因型與香味表型，沒有發現這兩標記與香味基因fgr出 現交換，表現共分離。因此LOl和L02兩標記可用于篩選香稻品種。
權利要求
一種與香味性狀共分離的分子標記，其特征在于，是由特異性PCR引物L01上游端自5’ 3’的核苷酸序列為CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT下游端自5’ 3’的核苷酸序列為GTGTGCACTGGTCACTGTTTT或特異性PCR引物L02上游端自5’ 3’的核苷酸序列為ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT下游端自5’ 3’的核苷酸序列為CCAGACATAAATAATGGCATCTT經PCR擴增水稻基因組DNA得到的。
全文摘要
本發明涉及一種與香味性狀共分離的分子標記，屬分子遺傳學領域。在分蘗期取水稻單株上部1-2片幼葉，保存于-80℃冰箱中備用。取2-4cm長的水稻葉片放入1.5ml離心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液900μl，75℃水浴20分鐘。打開蓋，用鼻聞，可準確判定香味的有無。用特異性PCR引物L01或L02經PCR擴增即可得到該分子標記。本發明專用于水稻香味品種的選育與遺傳研究，并可用于克隆香味基因。
文檔編號C12N15/11GK101921761SQ20101028769
公開日2010年12月22日 申請日期2008年4月18日 優先權日2008年4月18日
發明者姚方印, 姜明松, 張曉東, 李廣賢, 李潤芳, 王文英 申請人:山東省水稻研究所