專利名稱：一種水稻香味基因的分子標記方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種水稻香味基因的分子標記方法與其應用，特別涉及利用四引物擴 增水稻香味基因的引物和標記方法，與它們在常規水稻和育種中間材料基因型鑒定及分子 標記定向培育香稻品種中的應用。
背景技術：
香稻是一種自身含有香味物質，其香味超過人對香味的識別閾的特種稻。美國農 業部西部地區研究中心與國際水稻研究所的Juliano聯合研究的結果認為，香味的主要成 分是易揮發的有機物質2-乙酰-1-吡咯啉(2-acet yl-l-pyrroline, 2-AP)。其主要分布 在種子和葉片中，為白色晶體或結晶粉末，易溶于熱水、乙醇、乙醚，但不溶于冷水。許多香 稻從苗期起就能發出這種香味，尤其在稻花盛開的時候香味更濃。根據國內外學者對水稻香味性狀的遺傳學研究結果認為，香味是一個受細胞核隱 性基因控制的遺傳性狀。Bradbury等人(2005)對米香基因區域的17個基因進行序列測定 發現控制甜菜醛脫氫酶(BADH2)的基因Badh2在香和非香水稻品種中有明顯區別，其中香 稻品種在Badh2的編碼區中出現了一個8bp的缺失，結果導致翻譯提前終止，產生無功能的 截短BADH2蛋白。在所有檢測的香稻品種中這一 8bp的缺失都存在。據此，預測Badh2基 因是控制米香性狀的基因。選擇是育種中最重要的環節之一。選擇實質是指在一個群體中選擇符合目標要 求的基因型。利用易于鑒定的遺傳標記來輔助選擇有助于提高選擇效率和降低育種盲目 性。分子標記為實現對基因型的直接選擇提供了可能，因為分子標記的基因型是可以識別 的。如果目標基因與某個分子標記緊密連鎖，那么通過對分子標記基因型的檢測，就能獲知 目標基因的基因型。因此，能夠借助分子標記對目標性狀的基因型進行選擇，這就是所謂的 “分子標記輔助選擇”。為了達到定向培育香稻品種，很大程度上依賴于選擇，然而進行高效準確選擇就 要做水稻育種材料的基因型檢測。由于大多數香稻品種在Badh2基因的編碼區中出現了一 個8bp的缺失。聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測只有一個堿基的差異。因此，目前水稻香味基 因的基因型檢測方法主要通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行。但是，聚丙烯酰胺凝膠電泳制膠 過程繁鎖，銀染技術環節技術要求要高，這給進行育種這樣大規模基因型檢測帶來很大困 難。專利200810015264. 9所述的方法是直接用兩條引物進行香味基因擴增的方法，其不足 是采用技術要求較高的銀染方法，且缺少對照，結果中排除不了因擴增失敗出現的假陽性。 瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學常用的手段，制膠簡便，檢測過程方便快捷。但它本身由于技 術特點分辨率達不到檢測只有8BP的片段不同的要求。本發明結合常規水稻與香稻的Badh2基因核苷酸序列，利用四條引物在同一管DNA聚合酶鏈式反應(PCR)中擴增，利用瓊脂糖凝膠電泳達到快速準確的基因型檢測，提高 的選育的效率和準確性。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能在瓊脂糖凝膠電泳上進行常規稻與香 稻基因型檢測的方法。四引物擴增受阻突變體系 PCR(tetra primer amplification refractory mutation systemPCR, tetraprimer ARMS PCR)技術的出現，在很大程度上彌補了上述檢 測方法的不足。該技術是一種在普通PCR基礎上發展起來、專門用于檢測SNP的技術，綜 合了擴增受阻突變體系(amplification refractory mutation system, ARMS)禾Π四引物 PCR(TetraprimerPCR)技術的優點，對SNP檢測具有準確、快速、簡便、可以區分等位基因是 否純合以及費用低廉等特點。其依據的基本原理是Taq DNA聚合酶缺少3' -5'外切酶 活性，因此對于3'末端錯配的引物，以低于正常未端配對引物的速度延伸，當錯配堿基的 數目達到一定程度或者條件達到一定的嚴謹程度時，3'末端堿基則因磷酸二酯鍵形成困 難而不能延伸，反應終止，也就得不到特異長度的擴增條帶，從而表明模板DNA沒有與引物 3'末端相應的突變；如果PCR結果能得到特異長度擴增條帶，表明模板DNA上具有與引物 3'末端相應的突變。根據大多數香稻品種在Badh2基因的編碼區中出現了一個8bp的缺失，設計序列 表中SEQ ID N2 1-4的引物，按照以下反應體系和程序放入PCR儀中進行反應。PCR 反應體系(25 μ L)PCR reaction buffer (10X) 2. 5 μ LdNTP (2. 5mM/each)1· 5 μ LTAQ0. 5μ LPrimer (A-D)0. 5 μ L/ 條DNA1 μ LH2O17. 5μ LPCR反應程序95 °C 5 分鐘95°C 30 秒，64°C 30 秒，72°C 30 秒，循環 35 個，72°C 最后延長 10 分鐘。PCR產物進行0. 8%瓊脂糖電泳，電壓為20V/cm。本發明的判讀結果A) 一株水稻DNA樣品經上反應體系和反應程序，瓊脂糖凝膠電泳結果中同時出現 1025bp, 743bp兩條片段判定為常規水稻，不攜帶香味基因。B) 一株水稻DNA樣品經上反應體系和反應程序，瓊脂糖凝膠電泳結果中同時出現 1025bp，332bp兩條片段判定為香稻，且為香味基因純合體。C) 一株水稻DNA樣品經上反應體系和反應程序，瓊脂糖凝膠電泳結果中同時出現 1025bp，743bp，332bp三條片段判定為攜帶香味基因的雜合體。本發明具有制膠簡單、快速、技術要求較低、結果鑒定準確的特點。本發明的四引物擴增與判定方法可應用于常規稻和育種中間材料的基因型鑒定中，在分子標記定向培育香稻品種各環節中起到重要作用。
圖1 該發明對粳稻品種的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。M為DNA marker, 1為 曲阜香稻，2為03Y-22香稻，3為03Y-245香稻，4為寧粳28，5為日本晴。圖2 該發明對秈稻品種的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。M為DNA marker, 1為 臺灣本地1號，2為9311，3為春江06。
具體實施例方式實例1 粳稻品種的香味基因檢測取三葉期粳稻材料，利用CTAB法提取DNA，按照本發明的PCR反應體系與程序，利 用0. 8%瓊脂糖凝膠進行香味基因鑒定，利用本發明的判讀結果能很準確地鑒定出香味基 因，結果見圖1。實例2 秈稻品種的香味基因檢測取三葉期秈稻材料，利用CTAB法提取DNA，按照本發明的PCR反應體系與程序，利 用0. 8%瓊脂糖凝膠進行香味基因鑒定，利用本發明的判讀結果能很準確地鑒定出香味基 因，結果見圖2。
權利要求
一種鑒定水稻香味基因分子標記方法與其應用，其特征在于是由特異性引物1)序列表中的SEQ ID№1；序列表中的SEQ ID №2；序列表中的SEQ ID №3；序列表中的SEQ ID №4；2)將序列表中SEQ ID №1 4的寡核苷酸序列經過1至10個堿基的取代、缺失或添加且具有擴增香味基因的引物；經聚合酶鏈式反應(PCR)擴增得到。
2.根據權利1所述的一種鑒定水稻香味基因分子標記方法與其應用，其特征在于聚合 酶鏈式反應的程序為95°C 5分鐘95°C 30秒，64°C 30秒，72°C 30秒，循環35個，72°C最后 延長10分鐘。
3.根據權利1、2所述的一種鑒定水稻香味基因分子標記方法與其應用，其特征在于利 用0. 8%的瓊脂糖凝電泳準確區分香稻材料(品種)與常規水稻材料(品種)。
4.根據權利1、2、3所述的一種鑒定水稻香味基因分子標記方法與其應用，其特征在 于，苗期可進行香味基因的鑒定，三者聯合用于常規稻、育種中間材料的基因型鑒定及分子 標記定向培育香稻品種基因型鑒定的各環節中。
全文摘要
本發明涉及一種鑒定水稻香味基因分子標記方法與其應用，屬分子遺傳學領域。選取三葉期水稻材料，利用CTAB法提取DNA，合成本發明所設計的序列表中SEQ ID№1-4的特異性寡核苷酸序列，按照本發明的操作程序和判讀標準，可以在普通瓊脂糖凝膠上準確鑒定攜帶香味基因的材料，從而確定所試材料的基因型，即純合體、雜合體和野生型。本發明利用四引物擴增進行水稻香味基因型鑒定，可應用于常規稻、育種中間材料的基因型鑒定，在分子標記定向培育香稻品種各環節中起到重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK101899502SQ20101013105
公開日2010年12月1日 申請日期2010年3月24日 優先權日2010年3月24日
發明者宋玉霞, 樊云芳, 殷延勃, 王敬東, 石磊, 陳曉軍, 馬洪文 申請人:寧夏農林科學院