抗vegf抗體及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明設及VEGF抗體，尤其是運些抗體的生產及用途。
【背景技術】
[0002] 血管內皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一種可 促進血管形成（vasculogenesis)(即一種在胚胎發育中制造血管的過程）及血管新生 (angiogenesis)(即一種從既有的血管上形成新血管的過程）的信號蛋白。因其具有血管 新生的特性，VEGF可W于血液循環不足時（例如受傷后）恢復組織的氧氣供應。 陽00引 當組織中的VEGF過度表達時，可導致疾病癥狀。例如，VEGF過度表達會導致視網 膜上的血管疾病（如糖尿病性視網膜病（di油eticretinopathy))。此外，實體瘤（solid tumor)在沒有足夠的血管供應W獲得生長所需的營養情況下，無法生長超過一定限制的大 小。因此為了克服該限制，實體瘤會表達VEGFW使得其生長及轉移。
[0004]VEGF家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子（placenta growthfactor,PGF)。其中，VEGF-A為最重要的因子，其可調控正常和病理性的血管新 生（即血管生成）。VEGF-C和VEGF-D則調控淋己管的生成。VEGF-A包括數個蛋白質異構 體一-VEGFi2i、VEGFie日、VEGFisg和VEGF2D6(下標數字代表蛋白質的長度），其可通過不同的 生理特性和胞外蛋白分解W調控生理功能。例如，VEGFi2i是唯一無法連接肝素的VEGF，因 此無法附著于細胞表面。VEGFiee則具有外分泌的性質，故可附著于胞外基質。在運些之中， VEGFiw是一種具有許多基本氨基酸（高pi值）的蛋白質，并且幾乎完全吸附于細胞表面。 VEGFiee是一種具有生理活性的主要異構物。通過胞外蛋白酶對VEGF的降解影響其生物有 效性。例如，纖溶酶（plasmin)可分解VEGFie或VEGFiwW釋放出保有生物活性的前110個 殘基片段。然而，纖溶酶也可消化VEGF片段W降低其有絲分裂的活性。 陽0化]正常組織的血管生成是通過VEGF調控。在此過程中，數種分化的上皮細胞發揮不 同的作用。例如，尖端細胞（tipcells)可能形成為柄細胞（sta化cells),然后該柄細胞 會在該尖端細胞上增殖W形成血管內腔。在正常情況下，VEGF和抗VEGF會平衡地存在。因 此，血管可正常地生成及分化。但在腫瘤生長的過程中，會失去運種平衡，并且形成網狀的 血管分布圍繞著腫瘤W提供血液和所需營養給腫瘤細胞，因此該腫瘤細胞可持續的生長及 轉移。
[0006] 自1970年后，VEGF的生理功能逐漸被鑒別出來。基于抑制血管新生可抑制并治療 癌癥的理論來發展藥品。一些藥品已經出現于市場上。現今，AvaStin⑥化evacizum油） 為主要抗血管新生的抗體藥品。在2011年，Avastin⑩在美國的整體銷售額高達61.93億 美元（Med.Ad.化WS, 2011年10月）。Ayastin⑥可有效治療肺癌、乳癌、結腸癌、腎癌、腦癌 和其它惡性腫瘤。除了可使圍繞腫瘤的血管收縮外，Avastin⑥也幫助其它化療藥物滲透 入腫瘤內W發揮其功效。
[0007] 因為抗VEGF試劑可W是一種有用的藥品，所W可用于治療或控制VEGF相關疾病 的抗體仍然是有其需求的。
【發明內容】
[0008] 本發明的實施方式設及可抑制血管內皮生長因子（VEG巧功能的抗體。該抗體可 能是多株抗體或單株抗體。
[0009] 在一個方面，本發明設及能夠中和VEGF活性的抗VEGF抗體。根據本發明的一個 實施方式的抗體可W是多株或單株抗體。根據本發明的實施方式，抗體可預防與VEGF不希 望的活性有關的疾病，如癌癥生長及轉移。
[0010] 根據本發明的實施方式，抗體或其結合片段（例如，其scFv、F油或F(油)2片段） 包括重鏈可變區化eavychainvari油leregion,Vh)，所述重鏈可變區包括CDRH1、CDR肥 和CDR冊序列，其中所述CDRH1的序列選自沈QIDN0:17、20、23、26、29、32、35或38,其中 所述CDR肥的序列選自沈QID^:18、21、24、27、30、33、36或39，^及其中所述〔0冊3的序 列選自沈QIDN0:19、22、25、28、31、：M、37 或 40。
[0011] 根據本發明的一些實施方式，抗體或其結合片段（例如，其scFv、F油或F(油)2片 段）包括輕鏈可變區（li曲tchainvari油leregion，VL)，該輕鏈可變區包括CD化1、CD化2 和CD化3序列，其中所述CD化1序列選自沈QIDN0:41、44、47、50、53、56、59或62,其中所 述CD化2序列選自沈QID^:42、45、48、51、54、57、60或63，^及其中所述〔0化3序列選自 沈QID側：43、46、49、52、55、58、61或64。
[0012] 根據本發明的一些實施方式，抗體或其結合片段（例如，其scFv、F油或F(油)2 片段）包括重鏈可變區（Vh)，所述重鏈可變區包括CDRHUCDR肥和CDR冊序列，其中所述 CDRH1序列選自沈QID側：17、20、23、26、29、32、35或38，其中所述〔0冊2序列選自沈9 10 ^:18、21、24、27、30、33、36或39，^及其中所述〔0冊3序列選自沈910^:19、22、25、28、 31、34、37或40 及輕鏈可變區（\)，所述輕鏈可變區包括CD化1、CD化2和CD化3序列， 其中所述CD化1序列選自沈QID^:41、44、47、50、53、56、59或62，其中所述〔0化2的序 列選自沈QID側:42、45、48、51、54、57、60或63，^及其中所述〔0化3的序列選自沈910 N0:43、46、49、52、55、58、61 或 64。
[0013] 根據本發明的任一上述實施方式，抗體或其結合片段（例如，其scFv、F油或 F(油)2片段）可能與一或多個在VEGF上具有沈QIDN0:66、沈QIDN0:67和/或沈QID N0:68序列的抗原決定位（epitope)結合。
[0014] 在另一個方面，本發明設及通過投藥予有需要的個體能夠中和VEGF活性的抗 VEGF抗體，來治療或預防VEGF相關疾病（如糖尿病性視網膜病或癌癥（癌癥生長或轉移）） 的方法。
[0015] 根據如前所述的任何實施方式，抗體可能為單株抗體。根據如前所述的任何實施 方式，抗體可能為人源化抗體化umanizedantibody)或完全人類抗體（completehuman antibody)。
[0016] 本發明的其他方面和優點將通過下列描述和權利要求書變得顯然。
【附圖說明】
[0017] 圖1示出了根據本發明實施方式利用隧菌體庫產生抗VEGF抗體的示意圖。
[0018] 圖2示出了根據本發明實施方式利用隧菌體庫W產生抗VEGF抗體的示例方法。
[0019] 圖3A示出了本發明的抗體重鏈可變區序列。圖3B示出了本發明抗體的輕鏈可變 區序列。
[0020] 圖4A示出了根據本發明實施方式的抗VEGF抗體的重鏈可變區序列CDRHUCDR肥 和CDR冊與Avastin?抗體的比較。 陽02U 圖4B示出了根據本發明實施方式的抗VEGF抗體的輕鏈可變區序列C抓L1、CD化2 和CD化3與Avastin⑥抗體的比較。
[0022] 圖5示出了各種用于定性本發明全長抗體的分析試驗的示意圖。 陽02引圖6A示出了VEGF的Ξ維結構，W及圖她示出了根據本發明實施方式通過丙胺酸 掃描（alaninescanning)得出的結合抗原決定位的區域。
[0024]圖6C示出了變化性VEGF的免疫酵素測定巧LISA)中VEGF的結合，根據本發明實 施方式，其是通過丙胺酸掃描W測定結合抗原決定位的區域。
[00巧]圖7示出了用于分析本發明各種抗VEGF抗體對VEGF所誘發的人類廝帶靜脈內皮 細胞（HUVEC)轉移的影響的設置。
[0026] 圖8示出了本發明的各種抗VEGF抗體的各種分析和試驗的結果。
[0027] 圖9示出了通過本發明的抗VEGF抗體抑制VEGF所誘發的腫瘤生長的體內分析試 驗的流程圖。
[0028] 圖10A示出了通過各種抗VEGF抗體在體內抑制腫瘤生長的結果。圖10B示出了 每一個抗體的平均結果。
【具體實施方式】
[0029] 如本文所用，術語"抗體"泛指免疫球蛋白分子或其免疫活性部位，即抗原結合部 位或其片段。因此，抗體包括至少一個（優選為兩個）重（H)鏈可變區（Vh);和至少一個 (優選為兩個）輕（L)鏈可變區（Vl)。Vh和Vl可進一步再分為高度可變區（regionsof hypervariability)，良P"互補決定區"（complementaritydeterminingregions，CDR)，中 間穿插有較保守的區域，即"框架區"（化ameworkregions,FR)。每一個Vh或Vl是由Ξ個 CDR和四個FR所組成，其從氨基末端至簇基末端的排列順序依序為FRl、CDRl、FR2、CDR2、 FR3、CDR3 和FR4(參見Κ油atetal. (1991)SequencesofProteinsofImmunological Interest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH 化blicationNo. 91-3242;andChothiaetal. (1987)J.Mol.Biol. 196:901-917,其并入本 文中作為參考）。
[0030] 如本文所用，CDRH1、CDR肥和CDR冊（或肥DR1、