專利名稱：對多能性干細胞和心肌細胞以外的分化細胞誘導細胞死亡的方法
技術領域：
本發明涉及一種對多能性干細胞和多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞誘導細胞死亡的方法，其為與由胚胎干細胞、誘導多能性干細胞等多能性干細胞誘導分化出心肌細胞時的心肌細胞的純化有關的手段。
背景技術：
成體中的心肌細胞已經喪失增殖活性，為了治療重癥心肌梗塞、心肌癥等疾患而不得不依賴心臟移植。然而，現狀卻是心臟供體不足的問題無法克服，找到心臟移植以外的治療方法已成為當務之急。對此，預計在體外制作并純化心肌細胞用其充當疾患治療時心肌細胞的補充是用于救助不得不依賴心臟移植的心臟疾患患者的最有希望的方法。作為用于獲得心肌細胞的方法，已知的是使干細胞(例如胚胎干細胞、各種成體干細胞(adult stem cell))分化后使用的方法、由胎兒取得的方法等。例如在使用小鼠的多能性干細胞的情況下從培養液去除抑制分化的因子(飼養細胞、白血病抑制因子(LIF) 等)、在人的多能性干細胞的情況下從培養液去除抑制分化的因子(飼養細胞、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉化生長因子(TGF)等)，由此形成細胞塊(胚狀體)，從而可以積極地引發向心肌細胞的分化，這作為使干細胞分化的方法是已知的。體外的由干細胞分化為心肌細胞的方式部分承襲了活體內的生理發育階段，尤其是就發育初期的事件而言，在由受精卵細胞發生的生理發育和體外的分化方式之間共通點很多。就體外分化為心肌細胞的系譜而言，與生理發育同樣地，首先是干細胞分化為未分化的中胚層細胞，其一部分分化為編程性心肌細胞(前心臟中胚層)后，分化為心肌細胞。多能性干細胞是具有分化為構成臟器的所有細胞的能力的細胞，因此使其僅分化為心肌細胞在技術上較為困難。另一方面，由于將所有多能性干細胞一齊誘導至分化階段也非常困難，因此胚狀體中殘存有未分化的干細胞是非常常見的。如上所述，在體外誘導干細胞分化為心肌細胞時，所有干細胞的情況下，均產生作為副產物的心肌細胞以外的細胞以及殘存未分化的細胞等對臨床應用遺留下有害性質。尤其是殘存的未分化的細胞由于具有增殖活性且能分化為多種細胞，因此若治療時移植至活體的細胞中殘存未分化的細胞，則該未分化的細胞形成畸胎瘤的危險性極高。由這樣的理由出發，難以將含有對多能性干細胞進行誘導分化而制作的心肌細胞的細胞群直接移植至活體而用于治療。因此，為了安全地使用多能性干細胞來源的心肌細胞進行治療、獲得理想的治療效果，需要找到徹底去除未分化的多能性干細胞且高度純化心肌細胞的方法(即， 去除心肌細胞以外的細胞的方法)。目前，已知的純化心肌細胞的方法是，預先在干細胞的基因(基因組)中導入某些標記基因(例如GFP)的方法(非專利文獻1)。然而，這樣的方法需要改變基因組，方法自身存在倫理上的問題且在細胞癌化率變化等安全性方面伴隨著無法預測的巨大風險(非專利文獻2~)。此外，還報道了采用改變基因的方法作為積極地去除未分化的多能性干細胞的方法(非專利文獻幻。另一方面，報道了使用已知具有細胞死亡誘導作用的神經酰胺類比較特異地對胚胎干細胞誘導細胞死亡的方法(非專利文獻4)。然而，該方法中，用神經酰胺類處理后進行培養的細胞組中殘留了多達相當于多能性干細胞(OCT陽性細胞)未被處理(對照)時的1/3的量的多能性干細胞，并非是充分的去除方法。此外，對于人胚胎干細胞的去除而言，僅僅記載了發現發生細胞凋亡的細胞，而未記載能進行充分的去除。此外， 還報道了使用具有細胞毒性的抗體的方法(非專利文獻幻，該方法中記載了在抗體處理后仍殘存20%左右的胚胎干細胞。進而，就抗體的治療性處理而言，利用該方法時存在避免抗原性等制約。由此，在誘導細胞死亡的公知方法中，能夠用于心肌疾患的治療的心肌細胞的純化方法還具有改善的余地，期待一種效率更好的新的細胞死亡誘導方法。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻1 =Muller M, et al.，FASEB J. 2000 ；14 :2540-2548非專利文獻2 =Schroder AR, et al.，Cell. 2002 ；110 :521-529非專利文獻3 =Schuldiner M, et al.，Stem Cells 2003 ；21，257-265非專利文獻4 =Bieberich E et al.，J Cell Biol. 2004 ；167 :723-734非專利文獻5 :CH00 AB, et al.，Stem Cells 2008 ；26 :1454-1463.
發明內容
發明要解決的問題本發明課題在于，開發一種不改變基因且對胚胎干細胞、誘導多能性干細胞等多能性干細胞、和多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞誘導細胞死亡但不對心肌細胞誘導細胞死亡的方法。此外，本發明課題還在于利用這樣的方法開發一種由多能性干細胞制作沒有畸胎瘤的危險性的安全且高純度的心肌細胞的方法。用于解決問題的方案本發明人等進行了深入研究，結果發現，通過對多能性干細胞、非心肌細胞的培養條件添加未確認到物質毒性(physica 1 toxicity)和細胞死亡誘導作用的物質，從而構建了以短時間且非常有效地對心肌細胞以外的分化細胞誘導細胞死亡的方法，由此明確了不改變基因也能夠解決上述課題。該方法由于不對心肌細胞誘導細胞死亡，因此也是有效的心肌細胞純化方法。具體而言，本發明明確了 通過用具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液培養含有多能性干細胞、多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞、和多能性干細胞來源的心肌細胞的細胞群，從而提供引導多能性干細胞和多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞進入細胞死亡的方法，由此能夠解決上述課題。即，本申請發明具體涉及以下事項。(1) 一種對多能性干細胞和多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞誘導細胞死亡的方法，其為用具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液培養含有多能性干細胞、多能性干細胞來源的心肌細胞以外的細胞、和多能性干細胞來源的心肌細胞的細胞群，從而引導多能性干細胞和多能性干細胞來源的心肌細胞以外的細胞進入細胞死亡的方法。(2)根據上述(1)所述的方法，用高滲液的培養進行2小時以上。
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(3)根據上述⑴或(2)所述的方法，具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液是通過對培養液添加糖質(碳水化合物)而制得的。(4)根據上述(3)所述的方法，具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液含有 0. 1 IM的糖質。(5)根據上述C3)或(4)所述的方法，糖質是糖醇類、糖類、或甜菜堿類。(6)根據上述( 所述的方法，糖醇類、糖類、或甜菜堿類選自甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖和三甲基甘氨酸組成的組。(7)根據上述⑷所述的方法，具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液含有 0. 1 0. 6M的丙三醇。(8)根據上述(7)所述的方法，培養進行10小時以上。(9)根據上述(1) (8)中任意一項所述的方法，用高滲液培養細胞群后，返回至具有200 300m0sm/kg的通常滲透壓的培養液中進一步進行培養。發明的效果根據本發明的方法，通過對含有多能性干細胞、多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞、和多能性干細胞來源的心肌細胞的細胞群進行處理，能夠有效地去除細胞群中的未分化的多能性干細胞和非心肌細胞，且僅心肌細胞能夠存活，因此能夠有效地濃縮純化心肌細胞。
圖1表示胚胎干細胞(ES細胞)來源的心肌細胞和殘存的未分化胚胎干細胞的免疫染色。圖2表示在混入了胚胎干細胞來源的心肌細胞和殘存的胚胎干細胞的培養體系中的甘露糖醇處理。圖3表示對甘露糖醇處理后的細胞中的Nkx2. 5和0ct_3/4的免疫染色。圖4表示0. 45M的甘露糖醇對小鼠胚胎干細胞的細胞死亡誘導作用。圖5表示甘露糖醇對絨猴胚胎干細胞的作用。使用線粒體膜電位敏感性色素TMRM 對該細胞的生死進行了判定。圖6表示甘露糖醇對絨猴胚胎干細胞的效果。圖7表示甘露糖醇對人胚胎干細胞的作用(FACS解析)。圖8表示甘露糖醇對人胚胎干細胞的效果(即刻)。圖9表示甘露糖醇對人胚胎干細胞的效果(5小時后)。圖10表示人胚胎干細胞胚狀體的甘露糖醇處理。圖11表示人胚胎干細胞細胞胚狀體由于甘露糖醇處理所致的Oct-3/4陽性細胞的死滅。圖12表示甘露糖醇對人誘導多能性干細胞(iPS細胞)的作用(FACS解析)。圖13表示甘露糖醇以外的各種糖質對人胚胎干細胞的細胞死亡誘導作用。圖14表示丙三醇對人胚胎干細胞來源的心肌、非心肌細胞的作用。圖15表示用含有0. 2M甘露糖醇的培養液處理了 48小時或72小時的細胞的狀態。下半部分表示各個集落的放大像，圖中示意出代表性的細胞形態。
具體實施例方式本發明人等發現了如下事實對含有胚胎干細胞、心肌細胞、非心肌細胞的混合細胞系使用溶解了高濃度的甘露糖醇的高滲液時，通過暴露于高滲液，胚胎干細胞和非心肌細胞容易發生細胞死亡。對該見解，更詳細地研究了甘露糖醇濃度、在甘露糖醇中的暴露時間與胚胎干細胞及非心肌細胞的細胞死亡間的關系，結果獲知在低濃度的甘露糖醇中長時間暴露可有效地對胚胎干細胞和非心肌細胞誘導細胞死亡，在幾乎飽和的濃度即IM下短時間即可誘導胚胎干細胞的細胞死亡。同時獲知，在所有濃度下均存在既是引起胚胎干細胞和非心肌細胞發生細胞死亡的濃度、時間又不會對由胚胎干細胞分化出的心肌細胞誘導細胞死亡的條件。由此，基于那樣的條件進行培養的本發明的方法為有效地去除胚胎干細胞和非心肌細胞的方法，同時也是有效的心肌細胞濃縮純化的方法。因此，本發明的一個方式中，提供一種用具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液培養含有未分化的多能性干細胞、多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞、和多能性干細胞來源的心肌細胞的細胞群，從而引導多能性干細胞和多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞進入細胞死亡的方法。據稱，對于小鼠胚胎干細胞而言，在使用胚狀體形成法誘導分化時，在分化誘導開始后3 6天的胚狀體中包含中胚層乃至編程性心肌細胞。此外，出現心肌細胞是在分化開始后第7天(人的胚胎干細胞的情況下是第10天)。胚狀體中除上述以外還包含未分化細胞、內皮上皮樣細胞、神經細胞等。對構成胚狀體的細胞進行更詳細研究的話，構成胚狀體的細胞群中，7 8成為心肌細胞以外的分化細胞，其中有時還包含未分化的胚胎干細胞。這些雜細胞旺盛地增殖，隨著時間的經過其存在比例將增加。本發明人等發現，通過使具有這樣的細胞構成的胚狀體在培養液中暴露于適當范圍的高滲透壓下，從而引起胚狀體中殘存的胚胎干細胞、心肌細胞以外的分化細胞發生細胞死亡。此外，本發明人等發現，即使在該條件下培養時，心肌細胞也不出現細胞死亡，通過置換為生理性滲透壓培養液可恢復自主搏動。在本發明的方法中，作為細胞的供給源，只要是含有心肌細胞的細胞群，則可以是任意的供給源來源的細胞群，例如可以使用包含使用公知的心肌細胞誘導條件由多能性干細胞(包括胚胎干細胞(ES細胞)、活體干細胞、誘導多能性干細胞(iPS細胞)等)分化獲得的心肌細胞的細胞群、胎兒組織來源的細胞群，來實施本發明的方法。含有如上所述地由多能性干細胞分化獲得的心肌細胞的細胞群中，除了多能性干細胞來源的心肌細胞以外， 還可以含有多能性干細胞、多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞。本發明的方法特征在于，用具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液培養該細胞群。本發明的方法中使用的滲透壓對心肌細胞以外的細胞(多能性干細胞和心肌細胞以外的分化細胞)誘導細胞死亡，但不對心肌細胞誘導細胞死亡。這樣的滲透壓為370m0sm/ kg 以上、優選 370m0sm/kg 1600m0sm/kg、更優選 370m0sm/kg 1000m0sm/kg、進而優選 480m0sm/kg 1000m0sm/kg、最優選700m0sm/kg 1000m0sm/kg。與通常體外培養條件下的滲透壓為200 300m0sm/kg左右(也稱為通常的滲透壓或生理性滲透壓)相比，這些值是非常高的，在該條件下培養時心肌細胞以外的細胞會死滅。使用通過對培養液添加糖質而制作的具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液時，本發明的方法特征在于，在該高滲液中的培養進行2小時以上、優選2 72小時、更優選2 48小時、進而優選2 24小時、最優選4 12小時。本發明的方法中，能夠僅對包括人ES細胞、iPS細胞在內的未分化的多能性干細胞、或心肌細胞以外的分化細胞誘導細胞死亡的條件由高滲液的滲透壓程度和細胞在高滲液下的暴露時間的關系決定。即，與用于誘導心肌細胞而使用的細胞物種無關，高滲液的滲透壓越高則細胞在高滲液下的暴露時間可以越短，另一方面，若將高滲液的滲透壓設定為較低則需要相應地延長細胞在高滲液下的暴露時間。本發明的方法中，在高滲液中暴露細胞群時可以引導心肌細胞以外的細胞(未分化的多能性干細胞或非心肌細胞)進入細胞死亡(即，誘導細胞死亡或提供細胞死亡的信號)。這樣被引導進入細胞死亡的細胞在高滲液中發生細胞死亡或在由高滲液返回至通常的培養液后發生細胞死亡。本發明的方法中的細胞死亡由于是使細胞暴露于生理性應激而誘導的，因此不會對幸存細胞帶來基因性的損傷，可以僅對目標細胞以外的細胞誘導細胞死亡，從這點來說與通過直接給基因帶來損傷的物理性條件(放射線應激、氧化應激等)、化學性條件(化合物應激)來誘導細胞死亡相比是非常優選的。其原因在于，就能耐受生理性應激而幸存的細胞而言，通過返回至去除了用于誘導其細胞死亡的生理性應激的培養條件，能夠再次恢復原本的細胞機能，發揮正常的機能。該特征非常易于利用在將離體制備的組織或構成組織的細胞移植至體內而進行再生的醫療現場中。本發明中言及具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液時，是指不影響細胞的代謝、僅使滲透壓為370m0sm/kg以上的高滲液，例如作為例子可以列舉出通過對培養液添加糖質(碳水化合物)而制備的高滲液。作為本申請發明中可以使用的糖質的例子，可列舉出不影響細胞的代謝且可以提高培養液的滲透壓的糖質，即作為可以添加到本發明的培養液中的糖質的例子，可以列舉出例如糖類(單糖類、寡糖類、多糖類)、粘多糖類、氨基糖苷類、糖醇類或甜菜堿類，但并非限定于此。更具體而言，可以列舉出表1所述的物質。表 權利要求
1.一種對多能性干細胞和多能性干細胞來源的心肌細胞以外的細胞誘導細胞死亡的方法，其用具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液培養含有多能性干細胞、多能性干細胞來源的心肌細胞以外的細胞、和多能性干細胞來源的心肌細胞的細胞群，從而引導多能性干細胞和多能性干細胞來源的心肌細胞以外的細胞進入細胞死亡。
2.根據權利要求1所述的方法，用高滲液的培養進行2小時以上。
3.根據權利要求1或2所述的方法，具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液是通過對培養液添加糖質(碳水化合物)而制得的。
4.根據權利要求3所述的方法，具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液含有0.1 IM的糖質。
5.根據權利要求3或4所述的方法，糖質是糖醇類、糖類、或甜菜堿類。
6.根據權利要求5所述的方法，糖醇類、糖類、或甜菜堿類選自甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖和三甲基甘氨酸組成的組。
7.根據權利要求4所述的方法，具有370m0sm/kg以上的滲透壓的高滲液含有0.1 0. 6M的丙三醇。
8.根據權利要求7所述的方法，培養進行10小時以上。
9.根據權利要求1 8中任意一項所述的方法，用高滲液培養細胞群后，返回至具有 200 300m0sm/kg的通常滲透壓的培養液中進一步進行培養。
全文摘要
本發明課題在于，開發一種不改變基因且對胚胎干細胞、誘導多能性干細胞等多能性干細胞、和多能性干細胞來源的心肌細胞以外的分化細胞誘導細胞死亡但不對心肌細胞誘導細胞死亡的方法。本發明通過對多能性干細胞、非心肌細胞的培養條件添加未確認到物質毒性和細胞死亡誘導作用的物質，從而構建了非常有效地對心肌細胞以外的細胞誘導細胞死亡的方法，由此明確了不改變基因也能夠解決上述課題。
文檔編號C12N5/07GK102449139SQ201080023990
公開日2012年5月9日 申請日期2010年3月29日 優先權日2009年3月30日
發明者服部文幸, 福田惠一 申請人:學校法人慶應義塾, 第一三共株式會社