細胞培養體系的制作方法

專利名稱：細胞培養體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于將液體或凝膠容置在載體或器皿中的容器，且尤其涉及用于被容置在微孔板中以形成適用于培養粘附細胞或三維組織的細胞培養體系的細胞培養插件(insert)以及其用途。
背景技術：
目前，人造生物組織構造，例如人造皮膚或人造軟骨替代物，僅以非常小的批量制造，在大多數情況下甚至僅作為個體產品制造。人造生物組織的制造所需的細胞通常通過活組織檢查而獲得。將細胞分離并置于細胞培養體系以進行繁殖。目前，常規的細胞培養體系包含所謂的多孔或微孔板(miCTotiter plate)，在其表面中形成多個容器或凹陷(‘孔’)，用于在一個載體中平行培養數個細胞培養物。孔用于容置被稱為細胞培養插件的 燒杯形容器。在另外可選的設置中，可以提供容置在載體的單一孔或器皿中的單一容器，例如，用于制備單一的較大細胞或組織鞘。細胞培養插件通常具有底部，其用于支持細胞或組織并且由用于支持和營養其中所含的細胞的特殊的膜形成。在目前使用的細胞培養體系中，問題在于細胞的培養需要覆蓋細胞的液體培養基(liquid medium)o該液體培養基要被直接計量進入容器并計量在細胞上。這會導致損傷，尤其是對機械敏感的細胞或組織造成損傷。當由液面下培養(submerged cultivation)轉變成所謂的氣升式培養(airlift cultivation)時,甚至有必要主要通過抽吸而從制劑提取覆蓋細胞制劑的液體培養基。這也可能導致損傷細胞或組織和/或損害由此獲得的最終產物的質量。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供用于容易且安全地從細胞培養物或生物組織移除液體或向細胞培養物或生物組織添加液體(包括細胞培養基的添加和交換)的工具(means)，所述細胞培養物或生物組織例如是容置在適用于粘附細胞和/或三維組織的手動和自動培養或部分自動培養的容器或插件中的活組織檢查物。更一般地，技術問題是從容置有第一液體或凝膠(尤其是細胞培養物或組織)的容器交換液體(尤其是細胞培養基)，而在從容器移除液體或用液體填充容器內部的同時不影響第一液體或凝膠。通過新的插件或容器完全解決了上述技術問題，所述插件或容器優選地適于被插入或容置在器皿或載體中，更具體地，被插入或容置在用于細胞培養的微孔板或多孔板的孔中。本發明的容器，尤其是插件，適于在其內部保持第一液體或凝膠，尤其是細胞培養物或生物組織。該容器或插件包含用于包圍內部的至少一個側壁元件(side wall element)和底壁元件(bottom wall element)。該容器或插件優選在其上端開口以便進入。容器或插件形成例如圓筒狀、立方體或磚塊形燒杯狀器皿。本發明的容器或插件的主要特征在于，側壁元件或底壁元件或這兩個壁元件包含至少一個或多個毛細管開口，在容器或插件的內部和其外部之間為至少一種液體或流體培養基提供選擇性流體連接。本發明的毛細管開口專門適于選擇性地形成作為所述第一液體或凝膠經由穿過容器的壁元件的開口離開的屏障，更具體地，這取決于毛細管開口處存在的一種或多種物理化學條件。在其它變化中，這還存在于毛細管開口中或毛細管開口的附近。可以對第一液體建立流體連接一段時間和/或在某種條件下或僅在滿足某種條件之后(而不是之前)建立流體連接。所述物理化學條件的進一步特征可以在于，其選自以下的一種或多種所述第一液體和所述毛細管開口之間的特定化學、生物和物理條件和相互作用。在更具體的變化中，該物理化學條件是第一液體在毛細管開口處(其中或附近)的潤濕角。潤濕角尤其主要或僅僅取決于選自以下的一種或多種因素所述第一液體和所述毛細管開口之間的特定化學、生物和物理相互作用。在更具體的變化中，該物理化學條件是毛細管開口水平處存在的靜水壓力或跨壁壓。
在一個實施方式中，所述至少一個毛細管開口形成對第一液體的選擇性屏障，同時，毛細管開口適于形成用于第二液體穿過壁元件的液體傳導通路，所述第二液體不同于所述第一液體或凝膠之處主要在于其物理和/或化學性質，尤其是粘度、潤濕性和/或潤濕角。在一個具體的實施方式中，所述第二液體的粘度低于所述第一液體或凝膠。本發明使用毛細管體系的物理性質，不希望受理論限制，該毛細管體系在本文中用于允許液體的選擇性通過，這取決于其流體性質，尤其是其粘度和其潤濕性。與毛細管開口的尺寸(尤其是開口的最小橫截面直徑)相關，且與壁元件和毛細管的材料的表面性質(尤其是潤濕性)相關，并且與對液體的表面活性相關，毛細管開口允許或抑制液體穿過。令人驚訝地發現，容器或插件中的這種毛細管開口充當選擇性滲透體系，其有利地允許一組特別的液體物質或組合物容易地接近容器的內部。這種新穎的選擇性滲透體系允許液體經過壁上提供的毛細管開口通過毛細管作用而選擇性地或受控地傳送。傳送主要取決于所用的液體或凝膠的粘度。液體的粘度指數是選擇性通過的主要決定性因素。這樣，本發明的容器對具有例如比較高(comparinglyhigh)粘度的液體或凝膠是不透液的，但對于具有較低粘度的液體可以是自由滲透的。在另一個具體的變化中，對通過的選擇由液體的潤濕性確定，尤其是由與壁表面的物理或化學相互作用確定。在一個具體的實施方式中，可以通過提高或降低容器內部或外部的液體水平來控制液體穿過壁的通過。更具體地，毛細管開口有資格作為外部可控閥門或排放裝置。在該具體的實施方式中，選擇性和液體經由毛細管開口的通過進一步取決于跨壁壓，即毛細管開口所延伸經過的壁元件的內部和外部上的靜水壓力。在一個變化中，本發明允許液體取決于(最低)毛細管開口處存在的靜水壓力(SP相對于毛細管開口水平的填充水平)而進入或離開容器內部。更具體地，提供了新穎的通過簡單地提高填充水平至高于某一水平而填充或排空容器的方法。根據本發明該具體方面，可以將液體充入容器中，但防止其從容器內部排出。這通過使液體在容器內部的填充水平保持很低并從而使靜水壓力保持很低以防止毛細管開口的潤濕來實現。這樣，不會觸發毛細管作用，并使容器保持對該液體為不透液的。若容器的毛細管開口是干燥的，即未被液體完全潤濕，則這是尤其有效的。在流體水平在容器內部或外部提高至較高填充水平的情況下，增加的靜水壓力可以克服毛細管開口處的物理化學屏障，并最終導致毛細管的完全潤濕，從而觸發毛細管作用以建立該液體穿過容器的壁元件的流體連接。本發明預見到通過使液體相對于毛細管開口的填充水平保持在某一低水平以防止流體連接或通過將填充水平增加至引起或產生穿過容器的壁元件的流體連接而控制液體穿過毛細管開口。因此，本發明提供了用液體(尤其是細胞培養基)來填充或排空容器或插件的方法，其包括以下步驟提供本發明的容器或插件并將所述液體填充入所述容器中，從而確保不使填充水平增加至高于某一預定的第一水平，以便防止液體完全潤濕所述容器的一個或多個毛細管開口，更具體地，防止毛細管作用建立穿過容器的壁元件的流體連接。如本文所詳細描述的，所述第一水平主要由存在的物理化學條件確定。為了建立液體穿過壁元件的優選的永久流體連接，將液體水平增加至高于所述第一水平的第二水平，從而發生毛細管開口的完全潤濕并建立穿過壁元件的流體連接。該方法允許容易地排出分布在容器中的細胞懸浮液的液相。通過首先使懸浮液的填充水平保持在低于所述某一第一水平，該容器對該懸浮液是不透液的。可以允許懸浮液
中的細胞沉降并最終與容器的底部(尤其是培養膜)連接。然后，可以將剩余的覆蓋的液相從容器中排出，這是通過向容器中添加更多的液體或者更優選地通過增加容器外部上的填充水平而增加填充水平至高于所述某一水平，以便建立優選的永久流體連接，從而允許懸浮液的液相從容器中排出。該方法有利地避免了任何向細胞的直接機械加載。本發明有利地允許填充或清空容器或插件的新穎且簡單的方式。因此，本發明還涉及簡單且安全地交換插件或容器中的液體的新穎的方法。更具體地，本發明允許將高度粘稠的液體或凝膠組合物(尤其是生物基質細胞培養物、生物組織等)保持在容器或插件內部，同時非常容易地將第二液體(尤其是用于細胞培養物的液體培養基，其優選地應當覆蓋保持在容器內部的第一液體或凝膠)經過毛細管開口重復地交換、應用或除去，且不干擾或損害第一液體或凝膠(尤其是生物基質、細胞培養物或生物組織)。為了改善液體在插件內部和孔之間的交換，可存在多個毛細管。在一個具體的實施方式中，至少一個毛細管開口，且更優選所有毛細管開口包含在容器的側壁元件中。在一個具體的變化中，不存在其它的穿過容器或插件的壁的流體連接。毛細管開口，尤其是其最小橫截面，適應于液體或凝膠的物理化學性質，更具體地，適應于其粘度和/或潤濕性。在一個具體的實施方式中，毛細管開口的直徑可以為100至1，200 u m,更具體為200至1，000 u m,甚至更具體為600至800 u m。在其更具體的一個變化中，毛細管開口的直徑為約600 iim。在一個具體的實施方式中，所述毛細管開口是壁元件中的鉆孔。在另一個具體的實施方式中，開口是在壁上提供的單獨元件。毛細管可以由特定的材料(例如玻璃)制成和/或由與液體相互作用的材料制成。可以將毛細管排列在插件中或將其包埋使與插件成為一體。為了改變或改善通過的選擇性，壁還可以包含表面活性涂層或結構，其存在于毛細管開口中、毛細管開口處或毛細管開口附近。對具體液體的選擇性可以通過毛細管開口中、毛細管開口處或毛細管開口附近的化學活性基團或功能來達到。這種結構可以化學地或物理地或物理-化學地與液體或組合物的一種或多種化合物相互作用。可以通過例如與表面改性的選擇性相互作用而增加對具體液體的選擇性。在第一個變化中，對于具體液體增加潤濕角。在另一個變化中，對于具體液體降低潤濕角。在一個具體的變化中，表面活性涂層是或結構是疏水性涂層。在另一個變化中，表面活性涂層或結構是親水性的。這種涂層或結構本身是已知的，且可以包含等離子體誘導的改性或等離子體沉積的涂層以及納米顆粒表面和用于細胞-表面相互作用的生物活性表面結構，或由其組成，但不限于此。在一個具體的實施方式中，容器或插件還包含膜，其主要位于底壁元件處或位于底壁元件之中。本發明的膜本身被視為“不透液的”，從而不允許任何液體或凝膠自由地穿過容器的壁元件。膜僅允許營養物和/或氣體通過擴散而交換。其尤其用于支持置于容器或插件中的細胞培養物或生物組織的目的。這種適于細胞培養的膜是本領域已知的，且通常包含IOiim以下的孔徑。在更具體的變化中，本發明的膜的孔徑為8 iim或以下，更具體為5 u m或以下,且可以小至I u m或0. 4 u m。在本發明的上下文中，在第一個實施方式中，“第 一液體或凝膠”是具有或不具有細胞的細胞培養物組合物。在其一個具體變化中，第一液體或凝膠是細胞懸浮液(其包含適當的細胞培養基中的生物細胞)和主要為高粘度的生物基質組合物。更具體地，生物基質組合物是水凝膠、膠原蛋白凝膠等。在另一個變化中，第一液體或凝膠是優選為固化的或凝膠化的不含細胞的生物基質，其適于容置待接種于其上的細胞或容置生物組織或活組織檢查物。這種不含細胞的生物基質也可以是水凝膠、膠原蛋白凝膠等。在另一個實施方式中，第一液體或凝膠是優選為作為懸浮液待接種入容器內部的單層細胞培養物，其中可以允許細胞沉降在容器底部上以形成單細胞鞘。在另一個實施方式中，第一液體或凝膠是三維多層組織培養物，其包含至少兩層不同性質的生物細胞，其可以被包埋在上述不含細胞的生物基質中或接種在上述不含細胞的生物基質上。在另一個實施方式中，容器容置可被包埋在上述液體或凝膠培養基或生物基質中的生物組織或活組織檢查物。應當理解，第一液體或凝膠以及第二液體不限于用于培養生物細胞或組織的具體成分。本發明還涵蓋采用其它類型的液體或凝膠(例如化學測試試劑、樣品或探針)的其它應用。一般地，本發明提供了一種容器，其用于容置或保持第一液體或凝膠，同時允許具有其它物理化學性質(尤其是低粘度)的第二液體自由流入或流出容器。在一個具體的實施方式中，容器提供細胞懸浮液的保留。在另一個具體的實施方式中，容器提供單層或三維多層組織或組織培養物的保留。在另一個具體的實施方式中，容器提供作為細胞培養物或組織的支持物的凝膠基質的保留。第二液體可以是為了營養而覆蓋保持在容器內部的細胞培養物的液體細胞培養基，其擬在細胞培養過程中容易地交換或除去。在一個具體的可選的實施方式中，本發明提供了一種容器，其可用于保留作為第一液體或凝膠組合物的化學測試試劑或探針。第二液體(容器的壁元件對第二液體來說是可滲透的)可以是可以與化學測試試劑反應的化學探針或樣品。當化學測試試劑被固定在容器中時，探針或樣品可以經過毛細管開口自由地流入或流出容器。本發明還探索了一種新穎的用于在細胞培養體系中培養細胞的方法，所述細胞培養體系包含至少一個壁，尤其是多孔測試板。該方法或過程包含至少以下步驟，或者在一個更具體的實施方式中由以下步驟組成。在初始步驟(a)中，提供本發明的容器或插件以容置細胞、細胞培養物組合物或生物組織或活組織檢查物。在另一步驟(b)中，向容器中轉移第一液體或凝膠細胞培養物或細胞培養物組合物，其主要包含生物基質、細胞懸浮液和一種或多種三維組織構造物或活組織檢查物，或主要由其組成。本發明提供了防止液體或凝膠細胞培養物組合物經過容器的壁元件離開。在另一步驟(C)中，第一液體或凝膠或組織，分別被第二液體(尤其是液體基質或基質組合物)覆蓋，容器的毛細管開口適用于所述第二液體，從而允許第二液體經過毛細管開口跨越壁元件而自由地流入或流出容器。在一個具體的實施方式中，通過沿容器的側壁元件的至少一個毛細管開口的相對位置確定或調節覆蓋容器或插件內部的液體或凝膠的液體基質組合物的水平。毛細管開口用作液體基質的水平排出(level drain)或溢出；水平高于最低排列的毛細管開口的過量的基質液體可以被允許離開容器，例如進入孔或器皿。在一個優選的實施方式中，沿側壁元件分布有多個毛細管開口，以提供覆蓋被 保持的第一液體或凝膠的第二液體完全排出。為了實現這一點，在每個特定的水平提供毛細管開口。更具體地，開口相對于與容器的底部元件的水平或高度(即距離)而彼此隔開，條件是間距等于或小于每個毛細管開口的橫截面直徑。這可以通過沿側壁元件以傾斜 的或線狀 或多線狀的方式設置的一排或多排提供毛細管開口來實現，從而每一個水平或高度由至少一個毛細管開口來表示。在一個具體的實施方式中，液體培養基組合物進入容器并從外部(例如，從孔經過壁元件中的至少一個毛細管開口)連續流在液體或凝膠培養物組合物上。在一個具體的操作方式中，可以將容器或插件浸沒或容置在充滿液體培養基的孔或類似的器皿中，使得液體經過毛細管開口進入容器并尤其覆蓋靜置在容器或插件內部的液體或凝膠培養物或培養物組合物。為了迫使液體培養基經過毛細管開口進入或離開容器，可以增加培養基的水平以引起跨過壁元件的靜水壓力梯度(跨壁壓)。可以通過計量進入容器和孔之間的空間的培養基的初始水平來控制液體培養基流入或流出容器。一旦容器內的水平相對于至少一個毛細管開口的位置與孔中的水平持平，則培養基的流入或流出停止。有利地，這種操作方式不要求使用任何移液工具來充填和/或替換細胞培養體系中的液體培養基組合物。有利地，這種方式避免了將培養基或對應的液體直接計量入容器或插件內部，從而防止了例如對其中保持的細胞培養物的干擾或損害。液體培養基組合物還可以經過毛細管開口排出容器或插件。這可以通過降低孔或器皿中液體的水平或通過提升容器或插件來實現。通過這樣，液體培養基通過至少一個毛細管開口離開容器。有利地，這種方式允許容易地且安全地從容器或插件排空或排出液體培養基或對應的液體，而不干擾細胞培養物。在一個具體的實施方式中，通過增加液體或培養基的水平至高于正常水平以增加靜水壓力，可以有助于經過壁元件中的至少一個毛細管開口將所述液體從容器或插件內部排空或排出和/或用所述液體填充其內部。不希望受理論限制，跨壁壓尤其是靜水壓力的增加，支持毛細管效應的“開始”，即支持將液體吸入毛細管。此外，毛細管開口相對于液體水平的水平或高度可以初始地決定液體穿過毛細管開口的能力。在一個具體的實施方式中，液體穿過毛細管開口的選擇性由相對于壁元件(尤其是側壁元件)內的毛細管開口的位置的液體水平來確定。在其一個變化中，在壁元件中提供了至少一個額外的開口，其不是毛細管開口，其被特別設為使所有液體穿過，而不使用根據液體的物理化學性質的毛細管效應。該清洗開口(purge opening)可提供以下效果在初始階段,液體培養基可以首先經過該清洗開口進入容器或插件內部以填充內部至高于選擇性毛細管開口的水平或位置的水平。這在毛細管開口的水平處提供靜水壓力。通過這樣，可以觸發毛細管效應。在該初始步驟的第二階段，經由清洗開口進入內部的液體可以流過毛細管開口的已建立的選擇性流體連接，從而使液體的水平現在與毛細管開口持平，即經過清洗開口進入的過量液體可以經過該毛細管開口離開。在該具體實施方式
中，在初始步驟之后，可以經過已建立的流體連接很容易地進行液體或培養基交換。根據本發明，通過適當地選擇用于以定向的、液體傳導的方式連接插件的內部與孔的工具的尺寸或流動橫截面以及選擇作為要在孔與插件的內部之間傳導的液體的表面張力和粘度的函數的用于插件的適當的材料，可獲得液體的定向交換。以這樣的方式，可以設計例如具有不從插件內部滲出的液體的三維組織構造，同時為了在插件內部和孔之間交換液體而提供的培養基能夠無障礙地穿過該連接。因此，被供給至孔中并提供插件內部和孔之間的液體交換的液體也滲入插件的內部。因此，例如對插件中容置的細胞進行液面下培養所需的液體不再必須被直接計量入插件(即直接計量至插件中所容置的制劑)。而是可以經由計量開口將液體添加至孔。
相反地，由于插件內部和孔之間的定向的、液體傳導的連接，從孔中除去液體培養基還導致細胞培養插件內液體水平的降低。因此，從液面下培養轉變成氣升式培養不再要求直接從插件內部(并從而直接從插件中所容置的細胞制劑)抽吸提取液體。因此，當本發明的細胞培養體系被用于通過液面下培養或通過從液面下培養至氣升式培養轉變的培養方法培養細胞時，可以大大降低損傷細胞制劑的風險。在另一方面，本發明還提供了支持物，其適于被容置在載體中，尤其是在多孔測試板中。支持物可以包含至少一個容器。優選地，支持物攜帶多個容器并且被設置為允許容器被插入到最終形成在載體中的相應的孔中。具體地，支持物可以以這樣的方式設置將由支持物攜帶的插件以允許插件被插入至載體中形成的相應的孔中的相互距離而設置。攜帶多個插件的支持物的使用使得插件更容易操作；這是有利的，尤其是當本發明的細胞培養體系被用于以相對較大的批量培養細胞制劑時。此外，支持物可以提供有以適當位置設置的穿孔，從而允許隨后將起初互相連接的插件再次彼此分離。在一個具體的實施方式中，支持物包含基板或基礎框架，其中形成多個容置開口，用于容置容器。優選地，容置開口在基板中的設置對應于載體上孔的設置，從而可以通過簡單地插入其上連接有插件的支持物而將載體安全地設置在單獨的孔或器皿中。設置在容器之間的支持物的基板的區域可進一步用作形成在載體中用于以流體傳導的方式連接多個孔的通道的覆蓋物。這允許使污染的風險最小化。插件和支持物可以是分離的組件的形式。然而，優選的是，支持物和插件被設計成一體。在一個具體的實施方式中，在支持物上提供有抓握工具，用于手動或自動操作支持物和由支持物攜帶的容器。例如，抓握工具可以由腹板(webs)形成，所述網在細胞培養體系的組裝狀態中基本垂直地從支持物的基板的遠離載體的表面延伸。如果期望或要求，支持物還可以具有多個抓握工具。連接至支持物的抓握工具使得支持物更容易操作，因此若細胞培養體系被用于以相對大的批量自動或部分自動地培養細胞制劑，則其是尤其有利的。因此，在一個具體方面中，本發明提供了基于多孔板的細胞培養體系，其包含多孔板或具有多個孔或器皿的類似結構以及容置在該孔中用于培養細胞或組織的多個本發明的容器或插件。本發明的細胞培養插件可以以燒杯形的方式實施并且在底部區域提供有不透液的膜，該膜允許從孔中容置的培養基向設置在膜上的細胞培養物的方向傳送營養物等。本發明的細胞培養體系的多孔板還可以包含計量開口，其與孔以流體傳導的方式連接，這樣允許將液體或培養基供給至孔消除/或將液體或培養基從孔中除去。例如，計量開口可以形成在多孔板中，并以流體傳導的方式經由適當改變的通道與孔連接。可以將液體或培養基添加至孔中或從其中移除，而不需要將孔中的插件或容器從其位置移動。由于本發明的細胞培養體系中的計量開口可以形成在載體自身中，所以其位置被明確地定義，并且因此完全獨立于孔中插件或容器的設置。細胞培養體系可以很容易地在自動或部分自動細胞培養方法中使用，其中自動地供給培養基或將其從中移除。具體地，可以可靠地避免由容器計量開口的非明確定義的布置而造成的對自動或半自動計量裝置的損壞以及由噴霧所造成的交叉污染。在一個具體的實施方式中，可以在細胞培養體系的載體或板中僅形成一個或少數 幾個以流體傳導的方式與多個孔連接的計量開口。細胞培養體系的載體還可以提供有多個計量開口，所述多個計量開口各自單獨以流體傳導的方式連接至孔。例如，第一計量開口可用作培養基供給開口，同時可以提供第二計量開口用于從孔中除去培養基。可以在載體或板中形成多個孔。細胞培養體系可以以有利的方式用于以相對大的批量生產人造組織構造。理論上，載體中形成的每個孔可以以流體傳導的方式連接至用于向孔中供給培養基和/或用于從孔中移除培養基的單獨的計量開口。然而，優選的是，載體中形成的多個孔以流體傳導的方式各自互相連接。例如，可以經由通道建立孔之間的流體傳導連接，所述通道可以形成在載體中，并在孔之間延伸。在本發明的細胞培養體系的這種設置中，僅有用于向孔中供給培養基和/或用于從孔中移除培養基的單獨的計量開口需要與以流體傳導的方式彼此連接的孔相關聯。不言而喻，也可以有兩個計量開口與以流體傳導的方式彼此連接的孔相關聯，例如在自動或部分自動培養方法中，其中一個用于向孔中供給培養基且另一個用于從孔中除去培養基。此外，可以在載體中形成多組孔。然后一組的單個孔優選以流體傳導的方式彼此連接(例如經由載體中形成的通道)，而在組之間沒有流體傳導連接。細胞培養體系的這種設置是有利的，尤其是當細胞培養體系要被用于以相對大的批量使用各種培養基培養細胞制劑時或者當期望在載體內部進行邊緣分離(margin separation)時。例如,可以經由一個或多個第一計量開口向以流體傳導的方式彼此連接的第一組孔供給第一培養基，而可以經由一個或多個第二計量開口向以流體傳導的方式彼此連接但與第一組孔分離的第二組孔供給第二培養基。容器或插件和/或支持物優選由塑料材料(例如PP、PET或PS)制成。優選地，這些組件被設計為注射成型的組件，這允許簡單且經濟地生產細胞培養體系。在一個尤其優選的實施方式中，本發明的細胞培養體系的載體、插件和/或支持物由可冷凍貯存的材料制成。這允許將組織構造或細胞迅速深度冷凍。細胞培養體系還可以包含顯示高熱轉移的冷凍貯存器皿。冷凍貯存器皿的形狀優選地適應于支持物(其具有被支持物攜帶的一個或多個插件)的形狀，使得包含一個或多個插件的支持物能夠容易地插入到冷凍貯存器皿中。這允許溫和且有效的冷凍貯存。
本發明的細胞培養體系尤其適合用于制造作為體外測試體系或移植物的人造皮膚或用于制造人造軟骨移植物。此外，細胞培養體系還可以用于培養細胞以構建人造皮膚或軟骨移植物。該體系可以用于以實驗室規模培養細胞，也可以用于自動或部分自動的細胞培養。附圖
簡述現在將參考示意圖更詳細地描述本發明圖I示出本發明的載體或插件的示意性剖面圖；圖2示出組裝在支持物中或由支持物組裝的用于細胞培養體系的多個容器或插件；圖3示出一微孔板，其形式為具有孔且孔置于其中的細胞培養體系的載體；以及
圖4示出待容置在器皿或載體中的單一容器的另一可選的實施方式。
具體實施例方式圖I是本發明的插件或容器(30)的示意性橫截面視圖，該插件或容器在容器的至少一個壁元件(38，40)中包含毛細管開口(42)。容器(30)被設計為容置在多孔板的孔(14)中或類似器皿中。容器(30)主要被設計成圓筒狀或圓錐形旋轉對稱形狀并包含側壁元件(40)和底壁元件(38)。底壁元件(38)可以進一步包含優選為不透液的膜(39)，用于允許營養物和氣體經過容器(30)的底部擴散。在一個操作方式中，容器(30)保持第一液體或凝膠(61)，其優選為細胞培養物組合物，例如細胞培養基質、細胞懸浮液或三維多層組織構造。第一液體或凝膠￠1)優選被第二液體￠2)覆蓋，所述第二液體￠2)例如類似于細胞培養基質，用于支持包埋在第一液體或凝膠組合物￠1)中或接種于其上的細胞的生長和營養。圖2至4顯示尤其適于培養粘附細胞和/或三維組織的細胞培養體系的各元件的斜視圖，該體系一般用附圖標記(10)表示。細胞培養體系(10)包含載體(12)。根據圖3的實施方式，在載體(12)中形成六組孔(14)。每組孔(14)可以各自以流體傳導的方式通過在孔(14)之間延伸的通道(20)彼此連接。在圖3的實施方式中，在各組(14)之間沒有流體傳導連接。因此，向組I的孔(14)供給的培養基可以不同于向其它組的孔(14)供給的培養基。每個插件(30)包含由膜形成的底(38)，用于容置細胞培養物。燒杯形的插件(30)的側壁(40)提供有多個開口(42)。當插件(30)如圖3所示被插入至形成在載體(12)中的孔(14)中時，形成在插件(30)的側壁(40)中的開口(42)允許液體在孔(14)和插件(30)的內部(44)之間交換。第一計量開口(22)可以與每個孔(14)或每組孔(14)相關聯，用于向孔(14)中供給培養基。第一計量開口(22)形成在載體(12)中，并與在第一計量開口(22)和孔(14)之間建立流體傳導連接的通道連接。細胞培養體系(10)還包含多個插件(30)。用于向孔(14)中插入而提供的插件(30)可以各自與支持物(32)形成為一體。圖2和3中所示的支持物(32)包含基板(34)，其中形成用于容置插件(30)的一個或多個容置開口(36)。支持物(32)和至少一個插件
(30)可以形成為一體并可以作為注射成型的組件來制造。
攜帶至少一個插件(30)的支持物(32)還可以提供有一個或多個抓握工具(46)。抓握工具(46)由腹板形成，所述腹板在細胞培養體系(10)的組裝狀態中可以基本垂直地從支持物的基板(34)的遠離載體(12)的表面延伸(參見圖3)。抓握工具(46)使得支持物(32)或插件(30)更容易操作；這是有利的，尤其是當細胞培養體系(10)被用在自動或半自動培養方法中時。在圖3所示的細胞培養體系(10)的組裝狀態中，在載體(12)中設置計量開口
(22)允許將培養基供給至孔(14)中，而不需要將插件(30)從其在孔(14)中的位置移走或甚至從孔(14)中移出。此外，計量開口(22)的位置是明確定義的，且不取決于插件(30)在孔中的位置，因此，細胞培養體系(10)很適于用在自動或部分自動的培養方法中。孔(14)和插件33的內部(44)之間的選擇性液體傳導或流體連接是通過每個插件(30)的側壁(40)中形成的毛細管開口(42)建立的，向孔(14)中供給培養基還允許將
培養基供給至插件(30)的內部(44)中。類似地，可以通過從孔(14)中除去培養基來降低插件(30)的內部(44)中的液體水平。因此，細胞培養體系(10)尤其適于通過液面下培養來培養細胞或者適于用在需要從液面下培養至氣升式培養轉變的培養方法中，因為孔
(14)和插件(30)的內部(44)之間的液體交換避免了直接將培養基供給至插件(30)的內部(44)中的需要，以及直接從插件(30)的內部(44)移除培養基的需要。以這樣的方式，可以尤其保護敏感性細胞制劑不受損害。在細胞培養體系(10)的組裝狀態中，支持物(32)的基板(34)可以覆蓋在孔(14)之間延伸的通道(20)，從而可靠地防止孔(14)中容置的培養基的污染。然而，當由支持物
(32)攜帶的插件(30)被插入至載體(12)中形成的孔(14)中時，支持物的基板(34)中形成的凹槽(48，50)與載體板(18)中形成的計量開口(22，26)相互作用，使得支持物的基板
(34)不阻礙無障礙地接近計量開口(22，26)。肋(56)可以與插件(30)的側壁(40)連接，其在細胞培養體系(10)的組裝狀態中從支持物的基板(34)朝向載體(12)的表面延伸。肋(46)可以與載體(12)或支持物(32)中相應的凹進或凹槽嚙合，以確保插件(30)在載體(12)或支持物(32)內部適當的和可重復的定位。肋(56)還可以使插件(30)與支持物(32)的連接穩定，從而有利地提高其上固定有插件(30)的支持物(32)的機械強度。細胞培養體系(10)還可以包含顯示高熱轉移的冷凍貯存器皿(圖中未示出)。冷凍貯存器皿的形狀適應于具有插件(30)的支持物(32)的形狀(插件(30)的實施方式是與支持物(32)成一體)，使得包含插件(30)的支持物(32)能夠容易地插入到冷凍貯存器皿中。這允許溫和且有效的冷凍貯存。
權利要求
1.容器或插件(30)，其適于被容置在載體(12)的孔(14)中，用于在所述容器的內部(44)選擇性地保持第一液體或凝膠(61)，其中所述容器包含用于包圍內部(44)的側壁元件(40)和底壁元件(38)，其特征在于，所述側壁元件和所述底壁元件中的一個或兩者包含ー個或多個毛細管開ロ(42)，所述毛細管開ロ專門適于依賴毛細管開ロ處存在的物理化學條件而選擇性地形成作為所述第一液體或凝膠(61)穿過壁元件(40，38)離開或進入的屏障。
2.如權利要求I所述的容器(30)，其中所述物理化學條件是以下中的ー種或多種所述第一液體和所述毛細管開ロ之間的特定化學、生物和物理條件和相互作用。
3.如權利要求I或2所述的容器(30)，其中所述物理化學條件是所述第一液體在所述毛細管開ロ處的潤濕角。
4.如權利要求3所述的容器(30)，其中所述潤濕角取決于以下中的ー種或多種所述第一液體和所述毛細管開ロ之間的特定化學、生物和物理相互作用。
5.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述物理化學條件是靜水壓カ或跨壁壓。
6.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述毛細管開ロ(42)形成用于第ニ液體￠2)穿過所述壁元件(40，38)的液體傳導開ロ，所述第二液體的至少ー種物理化學性質與所述第一液體或凝膠￠1)不同。
7.如權利要求6所述的容器(30)，其中所述第二液體(62)的所述至少ー種物理化學性質是比第一液體或凝膠￠1)更低的粘度。
8.如權利要求6或7所述的容器(30)，其中所述第二液體(62)的所述至少ー種物理化學性質是比第一液體或凝膠￠1)更高的潤濕性。
9.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述毛細管開ロ(42)的直徑為200 μ m 至 1，000 μ m。
10.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述壁元件(40，38)在所述毛細管開ロ(42)中、所述毛細管開ロ(42)處或所述毛細管開ロ(42)附近包含表面活性涂層或結構。
11.如權利要求5所述的容器(30)，其中所述表面活性涂層或結構是疏水性的。
12.如權利要求5所述的容器(30)，其中所述表面活性涂層或結構是親水性的。
13.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述底壁元件(38)還包含不透液的膜(39)，用于容置所述第一液體或凝膠(61)。
14.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述第一液體或凝膠￠1)是化學測試試劑。
15.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述第一液體或凝膠￠1)是用于細胞培養的生物基質。
16.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述第一液體或凝膠￠1)是細胞懸浮液。
17.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述第一液體或凝膠￠1)是多層組織培養物。
18.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述第一液體或凝膠￠1)是單層細胞鞘。
19.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述第二液體￠2)是化學探針或樣品。
20.如前述權利要求中任一項所述的容器(30)，其中所述第二液體￠2)是細胞培養基。
21.支持物(32)，其適于被容置在載體(12)中，包含基礎框架(34)和一個或多個如權利要求I至20中任一項所述的容器(30)。
22.細胞培養體系(10)，其包含具有多個孔(14)的載體(12)，和容置在孔(14)中的權 利要求I至20中任一項所述的容器(30)或權利要求21所述的支持物(32)。
23.如權利要求22所述的細胞培養體系(10)，其中所述載體(12)還包含ー個或多個與所述孔(14)流體連接的計量開ロ(22，26)，用于向所述孔(14)供給所述第二液體(62)。
24.用于培養細胞的方法，其包括以下步驟 -提供權利要求I至20中任一項所述的容器(30)，用于容置細胞， -將液體或凝膠細胞培養物組合物轉移至所述容器中，從而防止所述液體或凝膠組合物經過所述至少一個毛細管開ロ離開， -用能夠經由所述至少ー個毛細管開ロ自由流入或流出所述容器的液體培養基覆蓋所述液體或凝膠細胞培養物。
25.如權利要求24所述的方法，其中覆蓋所述液體或凝膠細胞培養物組合物的所述液體培養基在所述容器中的水平由所述容器的所述側壁元件中的所述毛細管開ロ的相對位置來確定。
26.如權利要求24或25所述的方法，其中所述液體培養基經過所述至少ー個毛細管開ロ進入和/或離開所述容器。
27.如權利要求24至26中任一項所述的方法，其中通過初始地增加所述液體的水平至高于正常水平以增加靜水壓力并消除毛細管作用以及建立流體連接，將所述液體培養基經過所述至少ー個毛細管開ロ從所述容器的內部排出和/或吸入所述容器的內部。
全文摘要
本發明公開了包含改進了的細胞培養插件的基于微孔板的細胞培養體系，其適用于且用于粘附細胞和/或三維組織的培養。
文檔編號C12M1/12GK102858947SQ201080066130
公開日2013年1月2日 申請日期2010年4月15日 優先權日2010年4月15日
發明者克里斯蒂安·賴斯, 安德烈亞斯·特勞貝, 托拜厄斯·布羅德 申請人:弗朗霍夫應用科學研究促進協會