專利名稱：基于顏色的環介導等溫擴增技術檢測hpv6,11,16,18,52,58的制作方法
技術領域：
本發明是用基于HNB顏色的環介導逆轉錄等溫擴增技術檢測中國人常見的6種乳頭瘤病毒(HPV)E6，E7或LI基因。用于各級疾病預防控制機構，HPV檢測網絡實驗室，哨點醫院對中國人常見的6種HPV的檢測和監測。
背景技術：
宮頸癌在世界婦女癌癥中居第二位，全球每年新增病例49. 3萬，每年死于宮頸癌的婦女約27萬。其中99%宮頸癌的發生與乳頭瘤病毒感染有關。HPV劃分為低危型和高危型。LR-HPV感染會引起人類良性腫瘤和生殖器疣，HR-HPV感染則是引起宮頸癌的主要原因。中國人常見低危型為6型和11型，常見高危型為16型，18型，52型和58型。 為有效提高我國宮頸普查的質量以及控制我國宮頸癌的發病率，必須擴大監測網絡的覆蓋范圍，將網絡實驗室擴大到整個地市一級。目標是使全國300多個地市都具備能夠進行宮頸篩查的能力，切實做到早發現、早報告、早治療。本課題擬建立的基于顏色的可視化LAMP檢測中國人常見HPV的方法，具有快速、靈敏和簡單操作的特點，無需PCR儀器，無需電泳設備，將為提高我國疾病監測網絡實驗室和哨點醫院對中國人常見HPV的監測能力，實現對HPV感染者的快速篩查提供了有力的技術保障。基于顏色的LAMP技術在DNA病毒的檢測方面應該有著傳統基因診斷方法無法比擬的優勢，與一些常規的基因檢測手段相比，該技術在可操作性和檢測時間及設備要求方面具有更大的優勢。這主要體現在以下幾個方面。首先，它的檢測時間可以縮短到一小時以內，靈敏度可達到檢測十個拷貝以上的病毒核酸分子。除了應用一些常用聚合酶外，對硬件設備基本無特殊要求，在普通的生物實驗室就可完成這項檢測工作。在試驗實施中只需一步就可完成實驗操作，減少了污染機會并方便了實驗過程中的質控工作。第二，該技術省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，加之擴增反應在63°C等溫條件下進行，沒有核酸的變復性過程，不但節省了大量的時間又減少了擴增核酸的污染機會。第三，擴增反應只有在六條引物完全與識別的靶序列中八個結合區匹配的情況下才能順利進行，所有這些特性都在很大程度上減少了擴增反應的背景，從而使檢測特異性得到改善。第四，LAMP的擴增反應中可以形成可視的焦磷酸鎂白色沉淀，HNB染料在擴增前加入，因此肉眼也可觀察到陽性反應管中的白色混濁物和反應管內顏色的變化，可以直接判定檢測結果。
發明內容
I.本發明是對目前對中國人常見6種HPV檢測技術手段的改進和補充，它具有安全、特異、靈敏、便捷的優勢。這主要體現在以下幾個方面。首先，擴增反應只有在六條引物完全與識別的靶序列中八個結合區匹配的情況下才能順利進行，所有這些特性都在很大程度上減少了擴增反應的背景，從而使檢測特異性得到改善。第二，該技術省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，只需一步就可完成實驗操作，沒有核酸的變復性過程，減少了擴增核酸的污染機會，提高了檢測的敏感性和安全性。第三，所有的擴增過程都可在63°C同溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求，由于HNB染料在擴增前加入，可以肉眼直接判定檢測結果，無需電泳。第四，較PCR縮短了檢測所需的時間。
2.分別選擇 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV52, HPV58 型的 E6，E6，E7，L1，E6，L1 基 因的相對保守區設計相應的LAMP引物，其中包括兩條外引物(F3、B3)和兩條內引物(FIP、 BIP)，兩條環結合引物(LF、LB)。所有引物的具體序列見表I。表I :LAMP檢測中國人群中6種常見HPV亞型的核苷酸引物序列表
權利要求
1.一種用于人生殖器腫瘤和生殖器撫的病原體人乳頭瘤病毒(HPV)E6, E7或LI基因檢測的基于HNB顏色的環介導等溫擴增技術(LAMP)，其中包括用于中國人群中6種常見HPV病毒檢測的36條寡核苷酸引物和HNB (羥基萘酚藍)染料。
2.權力要求I所述的中國人群中常見的6種HPV病毒E6，E7或LI基因檢測的環介導等溫擴增技術(LAMP)的引物包括表I所列的基因序列及其每種序列的互補序列或變體。
3.權力要求I所述的中國人群中常見的6種HPV病毒E6，E7或LI基因檢測的環介導等溫擴增技術(LAMP)包括6種HPV病毒及其變異株。
4.權力要求3所述的本發明的應用范圍包括各級疾病預防控制機構，乳頭瘤病毒檢測網絡實驗室，哨點醫院用于中國人群中常見的6種HPV病毒的檢測和監測。
5.權力要求I所述的中國人群中常見的6種HPV病毒E6，E7或；L1基因檢測的基于HNB顏色的環介導等溫擴增技術(LAMP)的反應程序和檢測程序。
全文摘要
本發明屬于生物技術應用領域，涉及各級疾病預防控制機構，乳頭瘤病毒檢測網絡實驗室，哨點醫院等用于對以生殖器損傷(生殖器疣和宮頸上皮病變)為主要癥狀的疑似HPV感染病人的宮頸刮片標本的中國人常見的六種乳頭瘤病毒的檢測和監測。具體是應用基因顏色的環介導等溫擴增技術(LAMP)，通過生物信息學專業軟件分析6種HPV亞型的E6，E7或L1基因的保守序列，設計出每種亞型的六條引物完全與各靶序列中八個結合區匹配，省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，反應前加入HNB(羥基萘酚藍)染料，只需一步就可完成在63℃等溫環境中擴增1小時，最后用肉眼觀察顏色變化和管底的白色沉淀判定檢測結果，與傳統的PCR方法比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優勢。
文檔編號C12Q1/68GK102952894SQ20111024207
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優先權日2011年8月23日
發明者馬學軍, 聶凱, 羅樂, 楊夢婕, 李瑾, 董小平 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所