專利名稱：諸葛菜染色體乙酸地衣紅顯帶方法
技術領域：
本發明屬于細胞遺傳學領域，具體涉及諸葛菜染色體顯帶方法。
背景技術：
染色體分帶技術是鑒別染色體和研究染色體結構變異的常規而經典的技術。它是將染色體經過一定程序的處理，并用特定的染料染色后，使染色體在其長軸上顯示出一個個明暗交替或深淺不同的橫紋，這樣的橫紋就叫做染色體的帶。分帶技術能夠揭示染色體的 “解剖學”特征，可以顯示出真核生物每一條染色體的特異帶型，提供豐富的可用于識別的染色體的特殊標記，這為識別和分析每條染色體提供了必要的條件，因而可以比常規核型分析方法更準確地鑒別染色體。染色體帶紋的多樣性、雜合性等反映了染色體本身結構的復雜性，以及種下變異、物種分化和形成的遺傳機制。通過對顯帶機理的深入研究，可以對染色體的成分、結構、功能和行為等進行更深入的了解，從而找出生物染色體帶型變化的規律，這對于從細胞和分子水平真正揭示生物進化的遺傳機理具有重要意義，并在此基礎上進而達到人工控制和改造生物遺傳、變異的目的。染色體顯帶技術是用染料對染色體進行分化染色的方法，將染色體經酸、堿、溫度等處理后再以染料染色，或單用某些熒光染料染色就可以觀察到深淺不同或亮暗不同的帶紋的縱向結構。在植物染色體顯帶上最常用的是Giemsa分帶技術，其中常用的有C 一帶、 G 一帶和N —帶等。C 一帶在植物中分布較廣，在染色體末端、中端、著絲點兩側、核仁縊痕處都可能出現，而且準確性較高，是植物分帶的主要方法，已廣泛應用與植物細胞學、細胞遺傳學、植物分類學、物種起源、染色體工程、植物育種等方面的研究。目前常用的方法如下
1.材料準備待洋蔥鱗莖發根長2cm左右，蠶豆種子浸種發芽，待幼根長至3cm左右，切取根尖進行預處理。蠶豆主根根尖切去后繼續長出的次生根，可再切取次生根根尖進行預處理。大麥種子發芽至幼根長Icm左右，切取白色的幼根進行預處理。2.預處理根尖在0。05%秋水仙堿溶液中預處理2 3h。處理溫度一般為 25°C。預處理后須用清水沖洗多次，洗去藥液。3.固定以上各材料經預處理后，放入卡諾氏固定液中固定0.5 24h，轉換到 70%酒精，置于冰箱中保存備用。4.解離根尖在0. IN鹽酸溶液中置于60°C恒溫下處理10 15min。大麥根尖在37°C下用果膠酶處理30min，然后在0. IN鹽酸溶液中置于60°C下處理5min。上述材料用酸處理后，須用蒸餾水沖洗多次，除去殘留酸液，否則將會影響染色體的顯帶效果。5.壓片與常規的植物染色體壓片方法相同。在45%醋酸中壓片，制成白片。 在相差顯微鏡下檢查染色體分散程度，挑選出分裂相多，染色體分散均勻的片子。選出的玻片經液氮、C02干冰或半導體致冷器凍結，用刀片揭開蓋玻片。置室溫下干燥。6.空氣干燥脫水后的染色體標本一般需經過4 7天的空氣干燥，再進行分帶處理。不同的材料所需干燥的時間不一樣。洋蔥要求空氣干燥的時間較嚴，未經空氣干燥的染色體不顯帶，干燥一周后經顯帶處理顯示末端帶，干燥半個月后能同時顯示末端帶和著絲點帶。而蠶豆、黑麥、大麥則要求干燥時間不十分嚴格。7.顯帶處理空氣干燥后的染色體標本即可進行顯帶處理。處理方法不同，可顯示不同的帶型。(I)C 帶 HSG 法(Hydrochloric acid Saline Giemsa method)將空氣干燥后的染色體標本浸入0. 2N鹽酸(25°C左右)分別處理30和60min。用蒸餾水沖洗多次后，在60°C的2XSSC溶液中保溫30min，再用蒸餾水沖洗數次，室溫風干，即可染色。BSG法(Barium Saline Giesa method):將空氣干燥后的染色體標本浸入盛有新配制的5%氫氧化鋇飽和液的染色缸中，在室溫條件下處理5 lOmin，然后用蒸餾水小心地多次沖洗浮垢后，在60°C的2 X SSC溶液中保溫60min，再用蒸餾水沖洗數次，室溫風干，即可染色。2)N帶將黑麥、大麥種子發根Icm左右切取，在0°C冰水中預處理24h。卡諾氏固定液中固定半小時以上，醋酸洋紅染色液中染色2h，然后在45%醋酸中壓片，冰凍法揭開。爾后在45%醋酸60°C條件下脫色lOmin，再在95%酒精室溫下脫水lOmin，氣干過夜。最后在IM NaH2P04溶液中95°C恒溫下保溫2min，蒸餾水沖洗，氣干后即可染色。8.吉姆薩染色吉姆薩母液用1/15M磷酸緩沖液按一定的比例稀釋。例如，10 份磷酸緩沖液加1份吉姆薩母液稀釋即為10 :1，一般都采用扣染法染色。在一干凈的玻璃板上，對稱放置兩根牙簽或火柴棒，距離與載玻片上的材料范圍相等。將帶有材料的玻片翻轉向下，放在牙簽上，然后沿載玻片一邊向載玻片與玻璃板之間的空隙內緩緩滴入染色液， 在室溫下染色。染色時間因材料而異，因吉姆薩染料批號不同、質量上有差異，因此其染色液濃度和染色時間需作適當調整。9.鏡檢和封片染色后的玻片標本，用蒸餾水洗去多余染料，染色過深可用磷酸緩沖液脫色。室溫下風干后即可鏡檢，挑選染色體帶型清晰的片子，用樹膠墊片。上述的方法取材步驟用于小染色體的諸葛菜不能滿足顯帶效果，顯帶成功率低， 預處理使用秋水仙素，有毒，污染環境。解離后壓片，然后進行顯帶處理，才能染色呈現帶紋，操作步驟很多，不確定性增加，顯帶成功率低。
發明內容
本發明的目的是提供一種程序簡單，步驟少，所用試劑少，操作簡便，顯帶成功率高，適用于小染色體植物諸葛菜染色體的乙酸地衣紅顯帶方法。本發明是這樣實現的
本發明諸葛菜染色體乙酸地衣紅顯帶方法，包括以下步驟
(1)取材將種子用溫水浸泡6 12h，然后換入600mg/L的赤霉素溶液中放入4°C冰箱中20—25小時，然后將種子在培養皿中22—23°C發芽，避光.種子萌動后，再將種子放入4°C冰箱中20— 25小時，取出放回22— 23°C溫室發芽，待根長至1 一2cm時，截取根尖分生組織；
(2)預處理將根尖分生組織經冰水0—1°C處理23— 24小時；
(3)固定用卡諾氏液I對根尖分生組織在4°C固定23—25小時，卡諾氏液I配方無水酒精冰醋酸=3:1，體積比;
(4)解離將根尖分生組織放入預熱到60°C的lmol/LHCl解離，解離時間為8分鐘，(5)染色，將根尖分生組織放入乙酸地衣紅染色液中，地衣紅在乙酸溶液中的質量百分濃度為0. 1%，20— 26°C保持12—24小時；
(6)將根尖分生組織用蒸餾水洗后用體積百分濃度為45%的乙酸壓片。本發明方法中的取材和預處理步驟；結合了各種浸種方法的優點，使之適合于諸葛菜的種子萌發，并但不污染環境，染色體顯帶處理在染色過程中一并進行，不用分開處理，乙酸可以起到顯帶處理作用，而地衣紅染料也同時染色，程序得到簡化，減少了在操作中的很多步驟；因此避免了許多的影響因素，如每一步的操作誤差，每一個步驟的溫度、時間等不確定性的影響，因而顯帶成功率提高。比如傳統方法中的空氣干燥，干燥時間長短對顯帶影響很大，有些植物對干燥時間要求很嚴格，不好掌握。又如在壓片后冰凍揭蓋片時， 容易把染色體一同隨蓋片揭掉，造成染色體丟失。在顯帶處理中，所用的酸或堿等試劑的處理時間也很難撐握，長了，短了都不能顯帶。因而傳統方法因步驟太多，所用試劑也多，要求嚴格，影響因素眾多，成功率太低。本發明程序簡單，步驟和所用試劑少，受操作和試劑的影響較小，因而顯帶成功率高。傳統方法用吉姆薩染色的時間也因材料而異，染料批號不同、質量上有差異，因此其染色液濃度和染色時間不好撐握。用乙酸地衣紅染色時間容易撐握，操作簡單，易染色。本發明所用鹽酸與背景技術鹽酸無差異，只是解離時間的差別，因為植物種類不同，解離時間不同，本發明離解時間8分種只對諸葛菜合適，為最佳離解時間。本發明公開的植物小染色體顯帶方法適用于諸葛菜等小染色體植物。在本發明中種子的取材和預處理方法在傳統方法上進行了優化，用溫水浸泡、GA3 (赤霉素)催芽，然后在4度冰箱中春化，當種子萌動露白時又春化一次，長度種子根長至1 2 c m時，截取根尖，過短或過長則根尖分生細胞較少。截取的根尖用冰水處理23— 24小時，處理時間過長，則染色體濃縮程度高，不容易顯帶，過短則處于有絲分裂中期的染色體較少且多數還未形成合適顯帶的染色體形狀。實驗表明，按本發明的取材和預處理方法則種子的發芽時間較整齊，且出芽質量好，根分裂旺盛，處于有絲分裂中期的細胞較多，染色體形狀較好，適于顯帶操作。在本發明的植物小染色體顯帶方法中，諸葛菜根尖細胞通過60°C的lmol/L HCl 中八分鐘的解離，使細胞壓片容易分開，染色體分散程度好，易識別無重疊。如解離時間過短，則細胞不容易壓開，染色體重疊無法識別；如解離時間過長，則細胞破裂，染色體易丟失。根尖細胞解離后用乙酸地衣紅中常溫染色過夜，方法簡單，效果好，沒用傳統方法那么多復雜的程序，避免了諸多因素對染色體顯帶的影響。染色后用45%的乙酸常規壓片，用普通光學顯微鏡鏡檢即可觀察到紫紅色的帶紋。本發明的顯帶方法，操作容易，簡便、高效、實用，是一種新穎的植物小染色體顯帶方法，并同樣適合于其他大染色體植物的顯帶分析，具有重要的科研價值。 本發明與現有方法相比，其優點及效果可進一步概括為
1、本發明提供的植物小染色體乙酸地衣紅顯帶方法，其取材和預處理方法使種子的發芽時間較整齊，且出芽質量好，根分裂旺盛，處于有絲分裂中期的細胞較多，染色體形狀較好，適于諸葛菜等植物的顯帶操作。傳統方法對于諸葛菜的效果不理想。2、采用本發明提供的植物小染色體乙酸地衣紅顯帶方法，其解離時間對于諸葛菜恰到好處的掌握，使其細胞壓片容易分開，染色體分散程度好，易識別無重疊。
3、本發明提供的植物小染色體乙酸地衣紅顯帶方法，用乙酸地衣紅常溫染色過夜，經乙酸常規壓片，用普通光學顯微鏡鏡檢即可觀察到紫紅色的帶紋。該染色方法簡單， 成功率高，顯帶效果好，沒用傳統方法那么多復雜的程序，避免了諸多因素對染色體顯帶的影響。4、本發明提供的植物小染色體乙酸地衣紅顯帶方法，適用性廣，既可適用于小染色體植物，如諸葛菜、油菜，也適用于大染色體植物，只需改變解離時間和取材方法即可，染色和其它方法不變。所用藥品都為常規試劑，價格便宜，易得。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的具體描述。有必要指出的是，以下的實施例只用于對本發明做進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，所屬領域技術熟悉人員根據上述發明內容，對本發明做出一些非本質的改進和調整，應仍屬于本發明的保護范圍。發明人將本發明諸葛菜染色體顯帶的用于諸葛菜染色體顯帶的實驗，目前都已經取得了良好效果。具體實施方法
1 )取材。取種子在溫水中浸泡8h，然后換入600mg/L的赤霉素溶液中放于4°C冰箱中 24h。然后將種子在培養皿中22°C發芽，放于墊有蒸餾水潤濕的濾紙上，避光。當種子萌動時再將種子放入4°C冰箱24h，然后再取出，放回22°C溫室。待根長至1 2cm時，截取根尖分生組織。2)預處理。植物根尖分生組織經0— 1°C冰水處理23h后，用卡諾氏液I (無水酒精冰醋酸=3 1)對材料4°C固定24h左右。3)解離。將材料放入預熱60°C的lmol/ L HCl中解離，解離時間為八分鐘。4)染色。將材料放入質量百分濃度為0.1%的乙酸地衣紅染色液中常溫染色24h。5)染色體壓片。用蒸餾水水洗后用45%的乙酸常規壓片，鏡檢。2、顯帶效果
諸葛菜染色體分散良好，帶紋清晰，染色體特征易識別，有利于進一步遺傳分析。
權利要求
1.諸葛菜染色體乙酸地衣紅顯帶方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取材將種子用溫水浸泡6 12h，然后換入600mg/L的赤霉素溶液中放入4°C冰箱中20—25小時，然后將種子在培養皿中22—23°C發芽，避光.種子萌動后，再將種子放入4°C冰箱中20— 25小時，取出放回22— 23°C溫室發芽，待根長至1 一2cm時，切取根尖分生組織，(2)預處理將根尖分生組織經0—1°C冰水處理23—24小時；(3)固定用卡諾氏液I對根尖分生組織在4°C固定23—25小時，卡諾氏液I配方無水酒精冰醋酸=3:1，體積比;(4)解離將根尖分生組織放入預熱到60°C的lmol/LHCl解離，解離時間為8分鐘，(5)染色，將根尖分生組織放入乙酸地衣紅染色液中，地衣紅在乙酸溶液中的質量百分濃度為0. 1%，20— 26°C保持12—24小時；(6)將根尖分生組織用蒸餾水洗后用體積百分濃度為45%的乙酸壓片。
全文摘要
本發明為諸葛菜染色體乙酸地衣紅顯帶方法，解決傳統染色體分離顯帶方法不適于小染色體植物諸葛菜，程序復雜，操作條件不易掌握，顯帶成功率低的問題。本發明采用乙酸地衣紅進行染色，結合染色體制備方法，可使細胞染色體容易分離，染色體經輕壓后形態良好，帶型顯示清晰，利于目標染色體的識別。采用本發明提供的植物染色體顯帶方法非常簡便，操作容易，尤其適合染色體小的植物帶型分析，所顯帶型清晰，成功率高，便于植物的遺傳分析。
文檔編號C12Q1/68GK102329878SQ20111031152
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月14日 優先權日2011年10月14日
發明者馮雷, 周麗蓉, 陳文清 申請人:四川大學