專利名稱：含有α-氨基酸酯水解酶基因的大腸桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及α -氨基酸酯水解酶，更具體地說是涉及黃單胞菌Xanthomonas菌株的 α -氨基酸酯水解酶(a-amino acid ester hydrolase, AEH)基因的全序列及其所編碼的酶蛋白，目的基因aeh基因克隆在大腸桿菌中的穩定表達。
背景技術：
1972年，Takahashi等人在尋找能合成側鏈有氨基的β -內酰胺抗生素的過程中，發現某些細菌能夠通過α -氨基酸酯酰化7-aminocephem類母核合成非天然的頭孢類抗生素。而負責該反應的酶由于底物范圍限于帶α-氨基的酰基供體，而且相對酰胺，該酶和酯的親和性更高的原因被命名為α-氨基酸酯水解酶。α-氨基酸酯水解酶有諸多優點由于和酰胺的親和力低，底物水解少；不受苯甘氨酸的抑制；對D型苯甘氨酸甲酯有構象選擇性， 工業上可以直接使用消旋混合物，而不必先進行拆分；其最適反應pH比青霉素酰化酶低，也使反應體系中的底物和產物更穩定。長期以來，對α-氨基酸酯水解酶的研究受到生物學家和藥學家的重視，有關α -氨基酸酯水解酶產酶菌株的分離、酶基因的鑒定及其在生物轉化中的應用也有不少報道。Polderman-Tijmes等人通過定點突變確定了混池醋酸桿菌(Acetobacter turbidans') f11 α -氨基酸酯水解酶的活性中心氨基酸位點(J. BiologicalChemistry vol277, No32:28474, 2002)。Barends 等人描述了柑橘黃單胞菌citr I)中α -氨基酸酯水解酶的基因序列，及I. 9埃分辨率的酶晶體結構(J. BiologicalChemistry vol278, No25:23076，2003)。在使用菌株所產α -氨基酸酯水解酶合成頭孢氨節、頭孢丙烯、頭孢曲嗪和頭孢唑啉的過程中發現，在所制備無細胞裂解液中含有頭孢菌素酶，而該酶對β-內酰胺環具有極強的水解活力。雖然可以通過進一步純化細胞裂解液特異性地去除頭孢菌素酶，但由于生產成本和產品質量，純化不是理想的措施。
發明內容
本發明的目的是構建一個轉化體的重組載體中導入的α-氨基酸酯水解酶基因片斷可以使大腸桿菌表達宿主制備的無細胞裂解液沒有原宿主黃單孢菌株對β—內酰胺環的明顯的破壞作用，可應用于合成頭孢類抗生素藥物的含有α -氨基酸酯水解酶基因的大腸桿菌。縮寫列表
7—ADCA -J-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸
PGM :D-苯甘氨酸甲酯
7一ACCA -J-氨基-3氯-頭抱燒酸
7—ACA -J-氨基頭孢烷酸
7—APRA -J-氨基-3-丙烯基頭孢烷酸
7—TACA :7_氨基-3-(1,2,3-三唑-5-硫)甲基-頭孢烷酸
本發明是這樣實現的
本發明含有α—氨基酸酯水解酶基因的大腸桿菌，其特征在于是由大腸桿菌攜帶導入的含一氨基酸酯水解酶基因片斷aeh作為目的基因的重組質粒pET28a — aeh構成，大腸桿菌的脫氧核糖核酸的堿基序列見序列表中序列1，導入的目的基因的氨基酸序列見序列表中序列2。制備方法如下 (1)提取黃單孢菌基因組，
(2)將黃單孢菌基因組用PCR方法擴增目的基因aeh，所用載體為pGEM_T，aeh的酶切位點為EcoRI和XholJf EcoRI-aeh-XhoI片段與載體pGEM_T連接，轉化入宿主菌JM109，選擇白色菌落，得重組質粒pGEM-T-aeh,
(3 )將重組質粒pGEM-T-aeh和載體pET28a雙酶切，對線性化后的pET28a載體進行去磷酸化，用連接酶將aeh和載體pET28a連接，轉化入宿主菌JM109，得重組質粒pET28a_aeh，
(4)從宿主菌JM109中提取重組質粒pET28a-aeh轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細
胞，
(5)培養轉化細胞，使重組質粒pET28a— aeh隨大腸桿菌BL21 (DE3)細胞一起大量擴
>曰，
(6 )從擴增的細胞中篩選出含有重組質粒的pET28a-aeh細胞，即得大腸桿菌BL21(DE3) /pET28a_aeh。步驟(2)中以黃單孢菌基因組為模板，一對寡核苷酸EcoRI5'和XhoI3'為引物，擴增得ECoRI5HhoI片段，經凝膠電泳分離純化，得分別在5'端和:T端具有EcoRI5'和Xhor酶切位點的片斷與載體pGEM-T連接。應用于7-ADCA或7-APRA或7-TACA或7-ACA衍生物的合成。7-ADCA、7-APRA、7-TACA、7-ACA的衍生物分別是頭孢氨芐、頭孢丙烯、頭孢曲嗪和頭孢唑啉。本發明中的大腸桿菌表達宿主所制備的無細胞裂解液對β-內酰胺環的破壞作用明顯減少，可用于以7-ADCA為中間體合成頭孢氨芐、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢曲嗪、頭孢唑啉。具有工業應用前景。原產生菌ZafliAofflmasrubriIineans 和本發明大腸桿菌 BL21(DE3)/pET28a_aeh應用于7-ADCA到頭孢氨芐的轉化過程中對β -內酰胺環的破壞程度的比較。本發明大腸桿菌由北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏時間2011年4月11日，保藏編號CGMCC No. 4757。保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所。分類命名大腸埃希氏菌 Escherichia coli。將原產生菌和大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET28a_aeh 分別應用于7-ADCA到頭孢氨芐、7-APRA到頭孢丙烯、7-TACA到頭孢曲嗪的轉化，比較它們對β-內酰胺環的破壞程度。表I 原產生菌 Xan thomonas rubriIineans 和本發明大腸桿菌 BL21 (DE3 ) /pET28a-aeh應用于7-ADCA到頭孢氨芐的轉化過程中對β -內酰胺環的破壞程度表的數據可以看出大腸桿菌宿主對內酰胺環的破壞程度大大降低，可應用于大規模的生產之中。
權利要求
1.含有α-氨基酸酯水解酶基因的大腸桿菌，其特征在于是由大腸桿菌攜帶的含α -氨基酸酯水解酶基因aeh的重組質粒pET28a_aeh構成，大腸桿菌的脫氧核糖核酸的堿基序列見序列表中序列1，導入的目的基因的氨基酸序列見序列表中序列2，該大腸桿菌拉丁文名.^Escherichia co7i,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏編號CGMCC No. 4757。
2.根據權利要求I所述的大腸桿菌，其特征在于制備方法如下 (1)提取黃單孢菌基因組， (2)將黃單孢菌基因組用PCR方法擴增目的基因aeh，所用載體為pGEM_T，aeh的酶切位點為EcoRI和Xhol，將EcoRI-aeh-XhoI片段與載體pGEM_T連接，轉化入宿主菌JM109，選擇白色菌落，得重組質粒pGEM-T-aeh, (3 )將重組質粒pGEM-T-aeh和載體pET28a雙酶切，對線性化后的pET28a載體進行去磷酸化，用連接酶將aeh和載體pET28a連接，轉化入宿主菌JM109，得重組質粒pET28a_aeh， (4)從宿主菌JM109中提取重組質粒pET28a-aeh轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞， (5)培養轉化細胞，使重組質粒pET28a— aeh隨大腸桿菌BL21 (DE3)細胞一起大量擴>曰， (6 )從擴增的細胞中篩選出含有重組質粒的pET28a-aeh細胞，即得大腸桿菌BL21(DE3) /pET28a_aeh。
3.根據權利要求2所述的大腸桿菌，其特征在于步驟(2)中以黃單孢菌基因組為模板，一對寡核苷酸EcoRI5'和XhoI3'為引物，擴增得EcoRI5HhoI片段，經凝膠電泳分離純化，得分別在5'端和:T端具有EcoRI5'和XhoI3'酶切位點的片斷與載體pGEM_T連接。
4.根據權利要求I所述的大腸桿菌的應用，其特征在于應用于7-ADCA或7-APRA或7-TACA或7-ACA衍生物的合成。
5.根據權利要求4所述的大腸桿菌的應用，其特征在于7-ADCA、7-APRA、7-TACA、7-ACA的衍生物分別是頭孢氨芐、頭孢丙烯、頭孢曲嗪和頭孢唑啉。
全文摘要
本發明為含有α-氨基酸酯水解酶基因的大腸桿菌，解決原有宿主菌黃單胞菌Xanthomonasrubrilineans的β-內酰胺酶對β-內酰胺環的水解作用。測定了來源于Xanthomonasrubrilineans菌株的a-氨基酸酯水解酶基因全序列及其所編碼的酶蛋白，確定目的基因aeh，并提供含有該基因的重組質粒pET28a及構建的E.coliBL21(DE3)宿主菌，該宿主菌拉丁文名Escherichiacoli，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏編號CGMCCNo.4757。目的基因氨基酸序列見序列表中序列2，目的基因核酸堿基序列見序列表中序列1。該宿主菌克服了原有宿主菌的β-內酰胺酶對諸多頭孢類抗生素母核，如7-ADCA等及其衍生物有破壞性的缺點。該宿主菌可一般地應用于合成頭孢氨芐、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢曲嗪、頭孢唑啉。
文檔編號C12N15/70GK102653726SQ20111035569
公開日2012年9月5日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者葉麗娟, 李端華, 潘佳林, 王輅, 褚以文, 趙晨 申請人:中國醫藥集團總公司四川抗菌素工業研究所