專利名稱：一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及水產養殖魚用滅活疫苗領域，具體涉及一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗，同時還涉及一種斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，還涉及一種斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的用途。
背景技術：
斑點叉尾鮰(Channel catfish)于1984年從美國引進至我國養殖以來，由于其營養豐富、肉質鮮美，深受國內消費者的歡迎，逐漸成為我國水產品出口的主要品種之一，目前已在全國20多個省市養殖。隨著我國斑點叉尾鮰養殖規模的擴大，集約化養殖程度的提高，疾病的危害也越來越大，特別是近年來不少地區魚種養殖場都發生了爆發性的出血病， 死亡率高達90%以上，造成了重大的經濟損失。通過病原學研究發現，此病是由呼腸孤病毒引起。對于其防治措施，目前尚無有效藥物，疫苗免疫被公認為是最有效的預防措施。滅活疫苗由于其安全性好，目前已被廣泛應用于水產養殖中。然而傳統的滅活疫苗主要是采用福爾馬林滅活，由于福爾馬林對抗原成分有一定破壞作用，因而用其制備的滅活免疫效果較差且不穩定。此外，其滅活時間長，福爾馬林使用量大，殘留毒性不易去除等缺點，限制了其大規模生產與應用。β丙內酯是一種雜環類化合物(C3H4O2),對病毒具有很強的滅活作用，其滅活機理為改變病毒基因組RNA的結構達到滅活目的。大劑量β丙內酯雖是一種致癌物，但極易水解，水解后形成人體脂肪代謝產物β-羥基丙酸，對魚體、人體無害。由于 β丙內酯只作用于病毒RNA，對病毒蛋白無破壞作用，保持了抗原蛋白的完整性，所以β丙內酯滅活疫苗的免疫效果好。
目前尚未見到斑點叉尾鮰出血病疫苗的相關報道，本發明首次提供一種高效、安全、可規模生產的斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗及其制備方法。發明內容
本發明的目的是在于提供了一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗，該疫苗含有完整的病毒抗原蛋白，不含滅活劑，效價為105TCID5(1/ml，免疫效果好。
本發明的另一個目的是在于提供了一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗的制備方法，該方法僅使用0.025% (V/V)的滅活劑β丙內酯于4°C滅活M小時即可達到完全滅活的目的。該方法簡單快捷，滅活徹底，并且不破壞抗原蛋白的完整性。
本發明還有一個目的是在于提供了一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗在制備治療或預防斑點叉尾鮰出血病藥物中的應用。應用該疫苗對斑點叉尾鮰魚種進行注射免疫時，其保護率達89 %，浸泡免疫的保護率達72.6%。
為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施
一種斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，其步驟是
A、CCK細胞培養取液氮中保存的CCK細胞，37°C溫育2 3分鐘融化，加入含10% (V/V)小牛血清的MEM培養液(5ml/T25培養瓶，pH7 7. 5)，轉移至培養瓶中25 30°C培養。靜置6 8小時，待細胞貼壁后換新鮮培養液。在細胞培養2 3天，鋪滿培養瓶底后， 采用0. 0.5% (W/V)的胰蛋白酶消化貼壁細胞，進行傳代培養。所述的MEM培養液為 Sigma-aldrich或Gibco或其它公司生產的Eagle，s MEM細胞培養液。
B、CCRV-730病毒培養與收獲待CCK傳代細胞在瓶底鋪滿時，去掉培養液，然后按 1/5的培養基體積加入感染的病毒懸液，病毒的感染復數MOI (Multiplicity of infection) 為1 5PFU/cell，在病毒吸附細胞40 60分鐘后，補加含2% (V/V)小牛血清的 MEM(pH7 7. 5)維持液進行病毒增殖。在病毒感染48 72小時，細胞病變效應達80% 時，收獲病毒，_80°C至室溫Q0-25°C，以下相同)凍融3次，3000rpm，4°C，離心10分鐘，取上清再5000rpm，4°C，離心30分鐘以去除游離的細胞碎片，上清即為純化的CCRV-730病毒液。CCRV-730病毒液置于-80°C保存備用。所述的MEM培養液同步驟A—樣。
C、病毒滴度測定將待測病毒液進行一系列10倍稀釋(ΙΟ—1 10_1(1)，按上述病毒增殖方法在96孔板上感染CCK細胞。在病毒感染48 72小時，觀察細胞病變情況。按 Reed-Muench法計算病毒滴度TCID5(1。此病毒滴度即為滅活疫苗的效價。
D、CCRV-730病毒的滅活取保存于_80°C的CCRV-730純化病毒液于4°C融化， 按0.025% (V/V)的濃度加入保存于-20°C的滅活劑β丙內酯(又稱3-羥基丙內酯， β -Propiolactone, BPL)，迅速混勻后放置于4°C對病毒進行滅活。滅活24h后，將滅活的病毒液置于37°C水浴鍋中孵育2小時以水解β丙內酯。
Ε、將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水(0. 65% )稀釋至效價為105TCID5(1/ml，得到可直接使用的斑點叉尾鮰細胞培養滅活疫苗。
本發明所用的病毒株為斑點叉尾鮰呼腸孤病毒CCRV-730株，已由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期是2011年10月21日，保藏編號是CCTCC NO :V201133。所述的滅活疫苗含有斑點叉尾鮰腎臟細胞系(channel catfish kidney，CCK)，CCTCC NO :C201198。
F、滅活疫苗的安全性檢驗
滅活效果取上述制備好的疫苗，按上述病毒增殖的方法接種CCK細胞，同時設置陰性對照，觀察5 6天，若出現細胞病變效應，則表明病毒滅活不完全；若未見細胞病變效應，再盲傳2次，若盲傳出現細胞病變，則表明病毒滅活仍不完全，若盲傳2次均未出現細胞病變，則表明病毒滅活完全，疫苗安全。
無菌檢驗取上述制備好的疫苗，接種肉湯蛋白胨細菌培養瓊脂平板，涂平板后于 37°C培養15天，若有菌落生長，則表明疫苗有細菌污染，需用0. 22 μ m濾膜過濾除菌后使用；若無菌落生長，則表明疫苗是無菌的。
魚體實驗取上述制備好的疫苗，注射健康斑點叉尾鮰30尾，注射劑量為0. 2ml/ 尾，同時注射魚用生理鹽水作為陰性對照。飼養15天，若疫苗組出現死亡，而陰性對照組未出現死亡，表明疫苗不安全；若疫苗組和陰性對照組均未見死亡，則表明疫苗安全。
G、滅活疫苗的最佳免疫劑量健康的斑點叉尾鮰魚種(體長8 10cm)于室內飼養10天后，分組每尾注射0. 2ml不同稀釋度的滅活疫苗，同時用MEM細胞培養液注射另一批魚做陰性對照飼養10 12天后，隨意從每組中取出一部分魚采血做血清中和試驗，測定免疫魚與對照魚的血清中和抗體水平；將每組中的另一部分魚以強毒攻擊，測定其免疫保護率。經試驗測定，每尾注射0. 2ml效價為105TCID5(l/ml的β丙內酯滅活疫苗，其免疫效果最好，其中和抗體效價為1 1024;保護率高達89%。在較大規模的免疫保護效果測定試驗中，用斑點叉尾鮰出血病細胞培養滅活疫苗(效價為105TCID5Q/ml)按每尾0. 05ml 的劑量浸泡免疫5萬尾斑點叉尾鮰魚種(規格4 6cm，另設對照組1萬尾，池塘水浸泡)， 正常飼養6個月后，免疫組成活率達到83 %，對照組成活率為38 %，相對免疫保護力達到 72.6%。表明用β丙內酯滅活的細胞疫苗注射和浸泡途徑對斑點叉尾鮰進行免疫，均有很強的保護保護力，可以有效預防斑點叉尾鮰出血病。
所述的一種斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗有如下特性
1.本疫苗對細胞、魚體不具感染力。
2.本疫苗含有CCRV-730病毒的全部蛋白。
3.本疫苗效價為105TCID5Q/ml。
4.本疫苗無菌、無滅活劑殘留。
5.本疫苗為紅色澄清液體，pH7 7. 5。
6.本疫苗只對斑點叉尾鮰出血病有效。
—-種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗在制備治療或預防斑點叉尾鮰出血病藥物中的應用，其步驟是
Α.浸泡免疫當年斑點叉尾鮰魚種養至4 6cm時，可進行浸泡免疫。將免疫魚置于2 3%的鹽水中高滲脫水2 3分鐘后，然后浸浴在含量104TCID5(l/ml的斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗液中10分鐘，或用尼龍袋充氧浸泡1 2小時。然后將魚種撈出放池塘飼養。
B.注射免疫當年斑點叉尾鮰魚種養至8 IOcm時，可進行注射免疫。采用腹腔或者背鰭基部注射的方法給予。每尾注射0. 2ml效價為105TCID5(l/ml的斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗后，放池塘飼養。條件允許的情況下，可在首次免疫后間隔一個月進行加強免疫一次，免疫劑量不變，可獲得更高的保護率。
本發明與傳統滅活疫苗相比，具有以下主要優點
1.制備方法簡單快捷、操作方便，適于規模化批量生產和應用。
2.疫苗抗原蛋白完整，免疫原性好，免疫保護力高。
3.疫苗滅活徹底，且滅活劑分解完全，不含有毒有害成分，安全性高。
4.可進行浸泡和注射免疫。浸泡免疫的保護率達72.6%，注射免疫保護率達 89%。
5.具有商品化推廣價值，與免疫佐劑同時使用，可進一步提供魚體免疫保護率。
具體實施方式
實施例1
斑點叉尾鮰呼腸孤病毒CCRV-730的制備方法，其步驟是
A. CCK細胞培養取液氮中保存的CCK細胞(本實驗室建立，CCTCC C201198)，37°C 溫育2 3分鐘融化，加入含10% (V/V)小牛血清的MEM培養液(5ml/%5培養瓶，pH7或 7. 2或7. 4或7.幻，轉移至培養瓶中培養。靜置6或7或8小時，待細胞貼壁后換新鮮培養液。在細胞培養2或3天，鋪滿培養瓶底后，采用0.1% 0.5% (W/V)的胰蛋白酶消化貼壁細胞，進行傳代培養。所述的MEM培養液為Sigma-aldrich或Gibco或其它公司生產的fegle’ s MEM細胞培養液。
B. CCRV-730病毒培養與收獲待CCK傳代細胞在瓶底鋪滿時，去掉培養液，然后按 1/5的培養基體積加入感染的CCRV-730病毒懸液(本實驗室分離，CCTCCV201133)，病毒的感染復數 MOI (Multiplicity of infection)為 1 5PFU/cell，在病毒吸附細胞 40 或 45 或50或55或60分鐘后，補加含2% (V/V)小牛血清的MEM(pH7或7. 2或7. 4或7. 5)維持液進行病毒增殖。所述的培養基同上。
C. CCRV-730病毒的收獲與純化在病毒感染48或56或64或72小時，細胞病變效應達80%時，收獲病毒，-80°C至室溫凍融3次，3000rpm，4°C，離心10分鐘，取上清再 5000rpm，4°C，離心30分鐘以去除游離的細胞碎片。上清即為純化的CCRV-730病毒液。 CCRV-730病毒液置于_80°C保存備用。
D.病毒滴度測定將待測病毒懸液進行一系列10倍稀釋(ΙΟ—1 10_1(1)，按上述病毒增殖方法在96孔板上感染CCK細胞。在病毒感染48或56或64或72小時，觀察細胞病變情況。按Reed-Muench法計算病毒滴度TCID5Q。此病毒滴度即為滅活疫苗的效價。本發明所用的病毒株為斑點叉尾鮰呼腸孤病毒CCRV-730株，已由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期是2011年10月21日，保藏編號是CCTCC NO :V201133。本發明所用的斑點叉尾鮰腎臟細胞系(channel catfish kidney，CCK)為本實驗室建立，已由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期是2011年10月21日，保藏編號是CCTCC NO :C201198。
實施例2
斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，其步驟是
A. CCRV-730病毒的滅活取保存于_80°C的CCRV-730純化病毒液于4°C融化，按 0. 025% (V/V)的濃度加入保存于-20°C的滅活劑β丙內酯，迅速混勻后放置于4°C對病毒進行滅活。滅活24h后，將滅活的病毒液置于37°C水浴鍋中孵育2小時以水解β丙內酯。
B.將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水(0. 65% )稀釋至效價為105TCID5(1/ml，得到可供直接使用的斑點叉尾鮰細胞培養β丙內酯滅活疫苗。
C.滅活疫苗的安全性檢驗
1)滅活效果取上述制備好的疫苗，按上述病毒增殖的方法接種CCK細胞，同時設置陰性對照，觀察5 6天，若出現細胞病變效應，則表明病毒滅活不完全；若未見細胞病變效應，再盲傳2次，若盲傳出現細胞病變，則表明病毒滅活仍不完全，若盲傳2次均未出現細胞病變，則表明病毒滅活完全，疫苗安全。
2)無菌檢驗取上述制備好的疫苗，接種肉湯蛋白胨細菌培養瓊脂平板，涂平板后于37°C培養15天，若有菌落生長，則表明疫苗有細菌污染，需用0. 22 μ m濾膜過濾除菌后使用；若無菌落生長，則表明疫苗是無菌的。
3)魚體實驗取上述制備好的疫苗，注射健康斑點叉尾鮰30尾，注射劑量為 0. aiil/尾，同時注射魚用生理鹽水作為陰性對照。飼養15天，若疫苗組出現死亡，而陰性對照組未出現死亡，表明疫苗不安全；若疫苗組和陰性對照組均未見死亡，則表明疫苗安全。
實施例3
斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的保護效果評估，其具體步驟是
A.實驗室小規模實驗健康的斑點叉尾鮰魚種(體長8 IOcm)于室內飼養10天后，分組每尾注射0. 2ml不同稀釋度的滅活疫苗，同時用MEM細胞培養液注射另一批魚做陰性對照飼養10 12天后，隨意從每組中取出一部分魚采血做血清中和試驗，測定免6疫魚與對照魚的血清中和抗體水平；將每組中的另一部分魚以強毒攻擊，測定其免疫保護率。經試驗測定，每尾注射0.2ml效價為105TCID5(1/ml的β丙內酯滅活疫苗，其免疫效果最好，其中和抗體效價為1 1024;保護率高達89%。
B.大塘較大規模實驗用斑點叉尾鮰出血病細胞培養滅活疫苗(效價為 105TCID5(1/ml)按每尾0. 05ml的劑量浸泡免疫5萬尾斑點叉尾鮰魚種(規格4 6cm，另設對照組1萬尾，池塘水浸泡)，正常飼養6個月后，統計實驗組與對照組實驗魚的成活率。實驗結果顯示，免疫組成活率達到83%，對照組成活率為38%，相對免疫保護力達到72. 6%。
以上兩實驗結果表明，用β丙內酯滅活的斑點叉尾鮰出血病細胞疫苗以注射和浸泡途徑對斑點叉尾鮰進行免疫，均有很強的保護保護力，可以有效預防斑點叉尾鮰出血病。
實施例4
一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗在制備治療或預防斑點叉尾鮰出血病藥物中的應用，其步驟是
Α.浸泡免疫當年斑點叉尾鮰魚種養至4 6cm時，可進行浸泡免疫。將免疫魚置于2 3%的鹽水中高滲脫水2 3分鐘后，然后浸浴在含量104TCID5(l/ml的斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗液中10分鐘，或用尼龍袋充氧浸泡1 2小時。然后將魚種撈出放池塘飼養。
B.注射免疫當年斑點叉尾鮰魚種養至8 IOcm時，可進行注射免疫。采用腹腔或者背鰭基部注射的方法給予。每尾注射0. 2ml效價為105TCID5(l/ml的斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗后，放池塘飼養。條件允許的情況下，可在首次免疫后間隔一個月進行加強免疫一次，免疫劑量不變，可獲得更高的保護率。
權利要求
1.一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗，其特征在于斑點叉尾鮰呼腸孤病毒CCRV-730 株，CCTCC NO :V201133。
2.權利要求1所述的一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗，其特征在于所述的滅活疫苗含有斑點叉尾鮰腎臟細胞系(channel catfish kidney，CCK)，CCTCCNO :C201198。
3.權利要求1所述的一種斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，其步驟是A.CCK細胞培養取液氮中保存的CCK細胞，37°C溫育2 3分鐘融化，加入含10% V/ V小牛血清的MEM培養液5ml/%5培養瓶，pH7 7. 5，轉移至培養瓶中25 30°C培養，靜置6 8小時，待細胞貼壁后換新鮮培養液，在細胞培養2 3天，鋪滿培養瓶底后，采用 0. 0. 5% W/V的胰蛋白酶消化貼壁細胞，進行傳代培養；B.CCRV-730病毒培養與收獲待CCK傳代細胞在瓶底鋪滿時，去掉培養液，然后按1/5 的培養基體積加入感染的病毒懸液，病毒的感染復數MOI為1 5PFU/cell，在病毒吸附細胞40 60分鐘后，補加含2% V/V小牛血清的MEM :pH7 7. 5維持液進行病毒增殖，在病毒感染48 72小時，收獲病毒，-80°C至室溫凍融3次，3000rpm，4°C，離心10分鐘，取上清再5000rpm，4°C，離心30分鐘以去除游離的細胞碎片，上清為純化的CCRV-730病毒液， CCRV-730病毒液置于-80°C保存備用；C.病毒滴度測定將待測病毒液進行10倍稀釋KT1 10Λ在96孔板上感染CCK細胞，在病毒感染48 72小時，按Reed-Muench法計算病毒滴度TCID5tl，病毒滴度即為滅活疫苗的效價；D.CCRV-730病毒的滅活取保存于_80°C的CCRV-730純化病毒液于4°C融化，按 0.025% V/V的濃度加入保存于-20°C的滅活劑β丙內酯，混勻后放置于4°C對病毒進行滅活，滅活24h后，將滅活的病毒液置于37°C水浴鍋中孵育2小時以水解β丙內酯；Ε、將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水稀釋至效價為105TCID5(l/ml，得到直接使用的斑點叉尾鮰細胞培養滅活疫苗。
4.權利要求1所述的一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗在治療或預防斑點叉尾鮰出血病藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗及制備方法和應用，其步驟A、CCK細胞培養；B、CCRV-730病毒培養與收獲保存；C、病毒液滴度TCID50測定，此病毒滴度即為滅活疫苗的效價。D、CCRV-730病毒用β丙內酯滅活，然后37℃孵育水解β丙內酯；E、將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水稀釋至一定效價，得到可直接使用的斑點叉尾鮰細胞培養滅活疫苗。本滅活疫苗是在預防斑點叉尾鮰出血病中進行應用。本發明不僅滅活效果好，而且最大限度地避免了滅活劑對抗原蛋白的破壞，具有較好的免疫效果。此外，消除了滅活劑自身的毒性，提高了疫苗的安全性。本疫苗具有免疫效果好、使用安全、生產成本低、生產效率高等優點。
文檔編號C12N7/00GK102526721SQ201110355780
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者周勇, 徐進, 曾令兵, 肖藝, 范玉頂 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所