專利名稱：一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達產物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中的魚類基因工程表達，尤其是涉及一種斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3的表達載體和表達產物及其構建制備方法。
背景技術：
抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是魚類先天免疫系統的重要組成成分， 魚類可分泌產生多種抗菌肽來抵抗水生環境中大量的病原微生物的侵襲，這些病原微生物包括多種細菌、真菌和病毒等等。利用分子生物學技術，在體外獲得大量的、有活性的抗菌肽產品，進一步應用這些抗菌肽產品可能增強水產動物的免疫力，提高養殖產量，并對解決海水養殖中面臨的由于長期濫用抗生素而引起的細菌耐藥性、水產品藥物殘留和水環境污染等問題具有重要的科學、現實和經濟意義。斜帶石斑魚(Epinephelus coioides，orange-spotted grouper)俗禾爾青斑，是暖水性中下層魚類，主要分布于印度洋、紅海、地中海、北太平洋西部和東南亞地區。其肉質鮮美、營養豐富、抗逆性強、生長快、體色艷麗，市場價格高且穩定，目前斜帶石斑魚已成為世界上育苗量和人工養殖產量最高的石斑魚類，也是我國福建、廣東、海南、臺灣四省重要的海水養殖魚類之一。但是近年來，由于致病性微生物引起的魚病爆發，使得斜帶石斑魚養殖業承受著巨大的經濟損失(1.林建輝.斜帶石斑魚的生物學特性及養殖技術[J].齊魯漁業，2008，25⑵:22-23 ；2.黃瑞芳.斜帶石斑魚溶藻弧菌病的研究[J]·水產科學，2005， 24(6) 1-3 ；3.梅冰，周永燦，徐先棟，王世峰，謝珍玉.斜帶石斑魚爛尾病病原菌的分離與鑒定[J].熱帶海洋學報，2010，四(6) :118-124) 0本申請人在前期研究中從青石斑魚(Epin印helus awoara)中克隆獲得了 1個成熟肽具有4個半胱氨酸殘基的h印cidin基因，繼而從福建漳浦的養殖斜帶石斑魚中克隆得到了另1個新的成熟肽含有4個半胱氨酸殘基的h印cidin基因，與已報道的另外2個在斜帶石斑魚中發現的h印cidin基因EC-h印cidinl和EC_h印cidin2具有同源性，推測是其變體，故命名為EC-h印cidin3。已發現人工合成的EC-h印cidinl和EC_h印cidin2的成熟肽具有抗菌、抗病毒白勺作用(4. Jing-Geng Zhou, Jing-Guang Wei, Dan Xu, Hua-Chun Cui, Yang Yan, Zheng-Liang Ou-Yang, Xiao-Hong Huang, You-Hua Huang, Qi-ffei Qin. Molecular cloning and characterization of two novel hepcidins from orange-spotted grouper, Epinephelus coioides[J]· Fish&Shellfish Immunology,2011,30 :559-568)。同其他已發現的魚類h印cidin結構一樣，EC-h印cidin3包括內質網靶向的位于N端的信號肽，前導肽和位于C端的成熟肽，其中前導肽和成熟肽共同構成前體肽 (propeptide of EC_hepcidin3, EC-proHep3)。
發明內容
本發明的目的旨在提供一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達產物及其制備方法。本發明構建的一種含有EC-h印cidin3基因的表達載體可在大腸桿菌中誘導表達，并通過高效純化表達產物而在體外獲得大量的表達產品。所述含有EC-h印cidin3基因的表達載體，是在原核表達載體pETISa+中插入EC-h印cidin3前體肽基因序列所構成的重組表達載體pEI^8a/EC-h印cidin3。本發明所述在體外獲得的表達產物，是重組表達載體pET28a/EC_h印cidin3在大腸桿菌中經誘導表達以及純化后獲得的重組蛋白EC-proH印3。所述EC-h印cidin3前體肽的基因序列如序列表第1序列所示。所述EC-h印cidin3前體肽的氨基酸序列如序列表第2序列所示。所述重組蛋白EC-proH印3的制備方法包括以下步驟1)構建重組表達載體；2)將步驟1)所得重組表達載體導入宿主細胞，獲得可表達EC-proH印3的基因工程菌菌株；3)發酵培養已得到的基因工程菌菌株并進行誘導表達，獲得表達產物；4)分離純化步驟幻所得的表達產物，獲得重組蛋白EC-proH印3。在步驟1)中，所述表達載體可為ρΕΤ48ει+等。在步驟幻中，所述宿主細胞可為大腸桿菌E. coli Rosette等。在步驟幻中，所述表達產物為先通過離心收集表達菌體，將表達菌體重懸并超聲破碎后再離心收集得到的上清液。在步驟4)中，所述分離純化可采用親和層析法純化。本發明借助分子生物學技術，利用原核表達載體pETjSa+和原核表達菌株E. coli Rosette,成功在體外表達了可溶的、易純化分離的、具有抗菌活性的重組蛋白EC-proH印3。重組蛋白EC-proH印3具有廣譜的抗菌活性，對革蘭氏陽性菌如溶壁微球菌 (Micrococcus lysodeikticus Fleming)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) 和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)，對革蘭氏陰性菌如施氏假單胞菌 (Pseudomonas stutzeri)和熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)都具有明顯的抑制作用。重組蛋白EC-proH印3的基因工程表達產品將在斜帶石斑魚養殖業中研發抗病原微生物新藥、飼料添加劑和免疫增強劑等方面具有重要的應用價值。本發明構建的一種含有EC-h印cidin3基因的表達載體可在大腸桿菌中誘導表達，并通過高效純化表達產物而在體外獲得大量的表達產物。所述含有EC-h印cidin3基因的表達載體，是在原核表達載體PETjSa+中插入EC-h印cidin3前體肽基因序列所構成的重組表達載體pEI^8a/EC-h印cidin3。本發明所述在體外獲得的表達產物，是重組表達載體pET28a/EC_h印cidin3在大腸桿菌中經誘導表達以及純化后獲得的重組蛋白EC-proH印3。
圖1為PCR擴增斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3前體肽基因序列結果電泳圖。在圖 1中，1為PCR擴增后產物；M為DL2000DNA Marker。圖2為PETjSa+載體酶切處理后的電泳圖。在圖2中，bp代表堿基對數目；M為 DL2000DNA Marker ；1為未進行酶切的pET48a+載體，2為使用NcoI和BioI進行雙酶切后的pET48a+載體。圖3為檢測蛋白表達情況的SDS-PAGE電泳圖。在圖3中，KDa代表蛋白質的分子量(千道爾頓)；Ml為蛋白質Marker ； 1為pET28a/EC_h印cidin3重組表達載體誘導前菌體總蛋白樣品；2為pET28a/EC-h印cidin3重組表達載體誘導后菌體總蛋白樣品。圖4為表達產物的可溶性分析的SDS-PAGE電泳圖，在圖4中，KDa代表蛋白質的分子量(千道爾頓)；M2為蛋白質Marker ； 1為超聲破碎表達菌體并離心后收集的上清液樣品；2為為超聲破碎表達菌體并離心后收集的沉淀樣品。圖5為親和層析法純化重組蛋白EC-proH印3的純化圖。在圖5中，橫坐標為流經純化柱的溶液體積Volume (ml)；縱坐標為流出純化柱后的溶液在280nm波長下的紫外吸收值Absorbance (mAU) ；a為流出組分，b為洗脫組分。圖6為重組蛋白EC-proH印3純化后的SDS-PAGE電泳圖。在圖6中，1為純化過程中流出組分樣品；2為純化過程中洗脫組分樣品；M2為蛋白質Marker ；KDa代表蛋白質的分子量(千道爾頓)。
具體實施例方式以下通過實施例結合附圖詳細說明本發明的技術方案。實施例1斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3重組表達載體的構建1)斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3前體肽基因的獲得根據pET18a+載體上的多克隆位點以及斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3基因序列， 設計合成特異性上、下游引物，PCR擴增斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3前體肽基因序列。在上游引物ECH-exp-Sl的端加上NcoI酶切位點，在下游引物ECH-exp-Al的端添加》ιοΙ酶切位點，終止密碼子和6 X Hi s組氨酸標簽下游引物采用BioI酶切位點ECH-exp-Sl GCG CCATGG GCTTACCCGTCACTGGAGTAG ，斜體并標注下劃線部分表示引入的NcoI酶切位點。
權利要求
1.EC-hepcidin3前體肽的基因序列如序列表第1序列所示。
2.EC-hepcidin3前體肽的氨基酸序列如序列表第2序列所示。
3.重組蛋白EC-proH印3的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)構建重組表達載體；2)將步驟1)所得重組表達載體導入宿主細胞，獲得可表達EC-proH印3的基因工程菌菌株；3)發酵培養已得到的基因工程菌菌株并進行誘導表達，獲得表達產物；4)分離純化步驟幻所得的表達產物，獲得重組蛋白EC-proH印3。
4.如權利要求3所述的重組蛋白EC-pr0Hep3的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述表達載體為ρΕΤ48ει+。
5.如權利要求3所述的重組蛋白EC-proH印3的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述宿主細胞為大腸桿菌E. coli Rosette0
6.如權利要求3所述的重組蛋白EC-proH印3的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述表達產物為先通過離心收集表達菌體，將表達菌體重懸并超聲破碎后再離心收集得到的上清液。
7.如權利要求3所述的重組蛋白EC-proH印3的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述分離純化采用親和層析法純化。
全文摘要
一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達產物及其制備方法，涉及生物技術領域中的魚類基因工程表達。提供一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達產物及其制備方法。構建的含有EC-hepcidin3基因的表達載體可在大腸桿菌中誘導表達，并通過高效純化表達產物而在體外獲得大量的表達產品。含有EC-hepcidin3基因的表達載體是在原核表達載體pET-28a+中插入EC-hepcidin3前體肽基因序列所構成的重組表達載體pET28a/EC-hepcidin3。在體外獲得的表達產物，是重組表達載體pET28a/EC-hepcidin3在大腸桿菌中經誘導表達以及純化后獲得的重組蛋白EC-proHep3。
文檔編號C12N1/21GK102433341SQ20111038642
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月28日 優先權日2011年11月28日
發明者曲海東, 王克堅, 陳貝 申請人:廈門大學