專利名稱：斜帶石斑魚干擾素IFNγ2及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及干擾素領域，更具體地，涉及斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2及其制備方法和應用。
背景技術：
干擾素(IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白)，在細胞和機體受病毒感染或其他誘導劑作用后由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。根據同源性及受體特異性的不同，迄今為止，發現3類干擾素:I型、II型和III型。其中II型IFN (IFNy )也被稱為免疫干擾素，是主要的巨噬細胞刺激因子和調控免疫反應的關鍵信號分子，能激活效應細胞，提高自然殺傷細胞(NK)和巨噬細胞活性，促進免疫球蛋白的轉換，具有抗腫瘤、抗病毒、調節和增強機體免疫功能等作用。干擾素IFN Y 2和IFN Y 2基因是魚類IFN Y基因的兩個亞型，其氨基酸序列的特征是含有[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E- [LF]_X2_[IV]這個保守結構,這與已研究過的其他種類中的IFNy結構類似。
IFN Y具有廣泛的生物學活性。IFN Y主要通過與其受體結合，活化JAK-STAT信號通路，激活下游基因的轉錄，包括相關轉錄因子和免疫分子，如STATU IRF1、TLR3和MHC II等，調節T細胞的增殖和分化以及增強抗原提呈作用，達到保護宿主的目的。
IFNy是體內重要的免疫調節因子，其免疫調節作用是通過以下幾方面實現的。IFNy促進MHC I類及II類抗原的加工提呈，能夠從多方面上調細胞表面MHC I類分子的表達，IFNy通過上調MHC II類抗原提呈提升⑶4 + T細胞的肽特異性活性通過上調MHC I類抗原的提呈途徑增加細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對病原體的敏感性，使CTL更有效地將病原體清除；IFNy是主要的巨噬細胞活化因子，其對巨噬細胞的調節功能包括:介導T細胞對巨噬細胞的激活，直接誘導參與呼吸爆發酶的合成，增強巨噬細胞殺傷微生物的能力等；此外，IFNy也是Thl細胞的主要產物，而且能夠進一步使免疫反應向Thl表型轉化其能夠使靜止的⑶4+ T細胞分化為Thl細胞，同時抑制Th2細胞的增殖IFN將天然免疫反應與獲得性免疫反應橋連起來，其能夠協調天然免疫細胞識別病原體，并誘導特異性免疫反應的發生。IFNy的這種協調由固有免疫反應向獲得性免疫反應轉化的能力是其他干擾素所不具備的。
IFNy的廣譜抗病毒作用主要是通過與細胞表面受體的結合，誘導病毒感染細胞產生多種抗病毒蛋 白，使細胞內產生抗病毒狀態從而發揮抗病毒作用，其抗病毒作用是非特異性的。IFNy主要的效應分子有雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R(PKR )、Mx 2' -5'寡腺苷酸合成酶(2' -5' 0AS)、核糖核酸酶L (RNase L)系統等。PKR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在與dsRNA結合后被激活，活化的PKR可使蛋白合成起始因子eIF-2及核因子抑制因子IkB磷酸化,從而抑制病毒和細胞蛋白的合成,起到抗病毒的作用；Mx能夠通過干擾某些負鏈病毒核酸片段向細胞內轉運及某些病毒蛋白的功能而抑制病毒的增殖；T 寡腺苷酸合成酶能夠使ATP聚合為I' -5'寡腺苷酸，激活核糖核酸酶L降解ssRNA，從而干擾病毒復制。在誘導效應因子表達的同時，由于IFNy能夠提高細胞表面MHC分子的表達，增強免疫活性細胞對病原體的殺傷作用，從而協同促進了機體對病毒感染細胞的殺滅，而使機體處于抗病毒狀態雖然各種類型的干擾素均能介導細胞對病毒感染的反應，但IFNy的免疫調節活性在協調免疫反應和確定機體長期的抗病毒狀態中發揮更為重要的作用。與哺乳動物相似，魚類IFN Y重組蛋白能夠影響刺激免疫細胞的增殖，增加IFNy自身的基因表達，以及誘導下游免疫基因，如MHC II和Mx基因的表達。Mx是IFN系統中熟為人知的抗病毒蛋白，作為一種GTP酶，它主要通過干擾病毒的聚合酶來抑制RNA的復制，從而發揮抗病毒的作用。它主要受I型IFN誘導大量表達發揮其作用，II型IFN對其有一定的誘導作用。重組的IFNy可影響魚類的細胞免疫反應。初步研究的結果表明，一定濃度的重組虹鱒IFNy在RTS-11 cells中會促進下游免疫基因IPlO和MHC II β的表達。近年來魚類病害發生頻繁，其中某些疾病給水產養殖業造成災難性的危害，這就使得免疫防治技術在魚病防治中呈現出日趨廣闊的應用前景。IFNy由于其抗腫瘤、抗病毒、調節和增強機體免疫功能等作用在哺乳動物中的應用已非常廣泛，對人的臨床應用治療疾病方面也已很普遍。而其在魚類的研究與應用才開始起步，可以預測其具有廣闊的應用前景。
發明內容
本發明的目的在于根據現有魚類免疫防治方法中沒有干擾素蛋白IFNy的缺陷，提供一種新的魚類干擾素IFN Y 2基因及其編碼蛋白。首先提供斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2的基因序列，所述的基因的核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。進一步的提供斜帶石斑魚干擾素IFNY2重組蛋白，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1 所示。根據需求，再提供一種斜帶石斑魚干擾素IFNY I重組表達載體，所述的重組表達載體的核苷酸序列中，含有如SEQ ID Ν0:2所示的核苷酸序列。根據需求再提供一種根斜帶石斑魚干擾素IFNY2的基因序列的獲取方法，以斜帶石斑魚頭腎總mRNA為模板，以RNA Oligo dT為引物，反轉錄得到cDNA ;再以此cDNA為模板，設計上游引物及下游引物進行PCR擴增，即得。所述的RNA Oligo dT的序列如SEQ ID N0:3所示。所述的上游引物的序列如SEQ ID N0:4所示。所述的下游引物的序列如SEQ ID NO: 5所示。根據所述的重組蛋白，再提供一種斜帶石斑魚干擾素IFNY2重組蛋白的生產方法，包括以下步驟:
51.構建含干擾素IFNY 2的基因序列的重組表達載體；
52.將步驟SI得到的重組表達載體，轉化入工程菌中；
53.培養工程菌，使得工程菌中的重組表達載體表達干擾素IFNY 2重組蛋白；
54.干擾素IFNY 2重組蛋白的純化和變復性處理；
步驟SI所述的構建含干擾素IFN Y 2的基因序列的重組表達載體，包括以下步驟:511.以含斜帶石斑魚干擾素IFNY 2編碼基因的質粒為模板，設計分別帶有酶切位點的上下游引物，PCR擴增，所述的帶有酶切位點的上游引物的序列如SEQ ID N0:6所示，所述的酶切位點的下游引物的序如SEQ ID N0:7所示； 512.將步驟Sll所得PCR擴增產物克隆到原核表達載體pET22b上，即得含干擾素IFN Y 2的基因序列的重組表達載體。
步驟S3所述培養工程菌的條件為:將單菌落接種至5ml含100 μ g/mL氨節青霉素抗性的LB培養基，37°C，250rpm振蕩過夜培養，取過夜培養物以1: 100比例接種于含氨芐青霉素抗性的新鮮LB培養基中，370C，250rpm培養至0D600達到約0.6，加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG，37°C、250rpm誘導培養7小時后離心收集菌體。
步驟S4所述的干擾素IFN Y 2重組蛋白的純化和變復性處理，包括以下步驟， 541.將收集的菌體用buffferB洗滌，再用bufffer B重懸，冰上震蕩裂解菌體2h，經高速離心獲得裂解上清液； 542.將收集的裂解液經固定化金屬配體親和層析純化，尿素洗脫液進行洗脫處理，收集蛋白洗脫峰； 543.將收集的蛋白洗脫液預冷后放入處理好的透析袋中，兩側袋口扎緊轉移至透析液，4°C透析過夜，每隔8h更換新的透析液，透析結束后將蛋白真空凍干。
步驟S2和S3所述的工程菌為大腸桿菌，優選為Rosetta (DE3)菌株。
根據提供的重組蛋白，再提供一種含所述的斜帶石斑魚干擾素IFNY2重組蛋白天然魚類免疫增強劑或免疫佐劑。
與現有技術相比，本發明具有以下效益: 本發明利用斜帶石斑魚基因組數據庫結合分子生物學方法設計了特異引物，PCR擴增克隆得到IFNY2基因的ORF序列，并構建原核表達載體，轉化到大腸桿菌中培養，可大量表達斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2基因所編碼的蛋白。本發明中斜帶石斑魚重組IFN Y 2蛋白能夠上調頭腎細胞中的MHC II和TLR3基因的表達，豐富了魚類干擾素的系統信號通路理論，能為相關魚類免疫增強劑的研發提供一定的理論依據，IFN Y 2蛋白還可作為增強魚類免疫的餌料添加劑適用于水產養殖。
圖1為斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2氨基酸序列與部分脊椎動物IFN Y氨基酸序列的比對結果圖。
圖2為斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2成熟肽編碼序列的PCR擴增產物電泳結果。
圖3為基因IFN Y 2的重組表達質粒構建示意圖。
圖4.斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2重組蛋白表達和純化的SDS-PAGE (A)及Western雜交⑶分析圖。
圖5.斜帶石斑魚IFN Y 2對頭腎免疫細胞中MHC I1、IRFl和STATl基因表達的影響。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。除非特別說明，本發明采用的試劑、設備和方法為本技術領域常規市購的試劑、設備和常規使用的方法。實施例1.斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2的克隆 1.斜帶石斑魚頭腎總RNA的提取
取健康斜帶石斑魚全魚，以冰浴麻醉約2 min后，殺魚取樣，分離頭腎組織，采用Trizol試劑法抽提獲得斜帶石斑魚頭腎總RNA，其0D260/280 = 1.91。2.cDNA第一鏈的合成
取I μ g斜帶石斑魚頭腎總RNA樣品進行DNA酶處理以去除基因組DNA的污染，與RNAOligo dT (序列如SEQ ID NO:3所示)混合，進行反轉錄，所得產物置于-20°C保存備用。3.斜帶石斑魚IFN Y 2基因cDNA全序列的克隆
根據斜帶石斑魚基因組數據庫中的信息，在IFNy開放讀碼框拼接序列兩端設計特異引物，上游引物序列如SEQ ID N0:4，下游引物序列如SEQ ID NO: 5，以步驟2合成的第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增片段大小為567 bp。電泳分離DNA片段，切膠回收目的產物。將純化后的目的產物連接至PTZ57R/T載體，轉化DH5 α大腸桿菌，挑選陽性克隆測序。經BLAST同源性分析表明，目的產物確為IFN Y 2基因的cDNA序列片段。 實施例2.斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2重組蛋白的表達 1.重組表達質粒的構建
以含有IFN Y 2編碼基因的pTZ57R/T質粒為模板，設計一對含有EcoRI酶切位點的上游引物SEQ ID N0:6和含有XhoI酶切位點的下游引物SEQ ID NO: 7，經PCR擴增得到產物大小在550 bp左右的單一條帶，電泳結果如圖2所示，其中，M為DNA Marker，I為帶有酶切位點的IFN Y 2核苷酸目的片段。將斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2的成熟肽編碼序列克隆至原核表達載體pET-22b上，構建重組表達載體pET22b-1FN Y 2，(其構建過程如圖3所示)。表達載體中的外源基因序列經測序鑒定無誤。2.斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2基因的原核表達
將步驟I中構建的表達質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導目的蛋白表達。基因工程菌經誘導后超聲裂解得到上清液，經SDS-PAGE電泳分析表明，菌株在受IPTG誘導后有明顯特異表達產物帶，與軟件估算的含有His標簽的IFN Y 2重組蛋白分子量大小相近，結果如圖5所示，其中，A為IFNY2對MHC II基因表達的影響，B為IFN Y 2對IRFl基因表達的影響，C為IFN Y 2對STATl基因表達的影響；*表示與對照組有顯著差異(P〈0.05)。對誘導溫度和誘導劑量等條件的優化得出基因工程菌的最佳培養條件為:接單菌落至5ml的含氨芐青霉素LB液體培養基中，370C，250 rpm,振蕩培養過夜；按1: 100體積比接種到150ml 37°C預熱的含氨芐青霉素TB液體培養基中，37°C，250 rpm，培養至0D600達到約0.6 ;加入IPTG至終濃度0.4mM,在37°C條件下，對IFN Y 2蛋白表達工程菌誘導7h，可獲得最大重組蛋白表達量。3.斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2重組蛋白的提取和純化
將IFN Y 2蛋白表達工程菌總菌體用Native Binding Buffer洗漆，再用NativeBinding Buffer重懸，超聲處理后，裂解上清液進行固定化金屬配體親和層析純化，收集蛋白洗脫峰，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達和純化結果。斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2重組蛋白能被鎳金屬親和層析柱所吸附，用含不同濃度咪唑洗脫緩沖液洗鎳層析柱時，能把目的蛋白洗下，經脫鹽后獲得斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2重組蛋白，結果如圖4所示，其中，M為蛋白質分子量標準，I為未誘導總菌蛋白；2為誘導后總菌蛋白；3為上清流出液；4為bufferC(pH6.3)；5 為 bufferD (ρΗ5.9)；6 為 bufferE (ρΗ5.4)；7 為 bufferF (ρΗ5.0)；8 為 bufferG(ρΗ4.5)。
實施例3.實施例2所得的斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2重組蛋白對免疫相關基因表達影響的活性分析 對迅速冷凍麻醉的實驗魚取樣，剪取頭腎組織，浸泡于適量RPMI1640培養基中，并置于冰上；將頭腎組織置于超凈工作臺內稍微剪碎，剔走結締組織后，用烘好的磨砂玻片磨砂面進行研磨，磨至末狀；將磨好的細胞與培養基一起過Cell strainer (BD Falcon, 70 μ m,Nylon)并轉移至50ml離心管中:離心，棄上清液，加入RPMI 1640培養基2ml重懸細胞，洗滌，離心后用完全培養基(RPMI 1640 含 2 mM L-glutamine, 10% FBS 和 1% penicillin /streptomycin)2 ml重懸細胞,將細胞數調整至I X IO7 /mL,分別向6孔培養板各孔中加入2 mL上述細胞懸浮液；分別向各分組孔中加入終濃度為I ng/mL, 10 ng/mL和100 ng/mLIFNy 2蛋白的完全培養基2 mL，并設置陰性對照組(細胞懸浮液和完全培養基各2 mL)。將細胞培養板置于27°C，5% CO2培養箱中培養，孵育4 h后收集各孔細胞，Real Time-PCR檢測IFNy 2蛋白對MHC II和TLR3基因表達的影響。其中MHC II基因表達所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 10，下游引物序列如SEQ ID NO: 11 ;TLR3基因表達所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 12，下游引物序列如SEQ ID N0:13o 18S rRNA作為內參基因來校正各模板起始cDNA量，18S rRNA基因片段的上游引物序列如SEQ ID NO: 8，下游引物序列如SEQ IDN0:9。每組3個重復，數據用平均值土標準誤表示，*表示與對照組有顯著差異(P〈0.05)，結果如圖5所示。
結果表明，在斜帶石斑魚頭腎細胞中，I ng/ml的IFNy 2蛋白孵育4小時后能顯著上調MHC I1、IRFl和STATl的mRNA水平，而其中，高濃度的蛋白對IRFl的轉錄有極顯著的上調作用，而 對MHC II和STATl來說則沒有顯著影響。
權利要求
1.斜帶石斑魚干擾素IFNY2的基因序列，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
2.斜帶石斑魚干擾素IFNy2重組蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。
3.斜帶石斑魚干擾素IFNY 2重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體的核苷酸序列中，含有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
4.一種根據權利要求1所述的斜帶石斑魚干擾素IFNY2的基因序列的獲取方法，其特征在，以斜帶石斑魚頭腎總mRNA為模板，以RNA Oligo dT為引物，反轉錄得到cDNA ;再以此cDNA為模板，設計上游引物及下游引物進行PCR擴增，即得， 所述的RNA Oligo dT的序列如SEQ ID NO:3所示， 所述的上游引物的序列如SEQ ID N0:4所示， 所述的下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示。
5.一種根據權利要求2所述的斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2重組蛋白的生產方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.構建含干擾素IFNY 2的基因序列的重組表達載體； 52.將步驟SI得到的重組表達載體，轉化入工程菌中； 53.培養工程菌，使得工程菌中的重組表達載體表達干擾素IFNY 2重組蛋白； 54.干擾素IFNY 2重組蛋白的純化和變復性處理。
6.根據權利要求5所述的的斜帶石斑魚干擾素IFNY2重組蛋白的生產方法，其特征在于，步驟SI所述的構建含干擾素IFNy 2的基因序列的重組表達載體，包括以下步驟: 511.以含斜帶石斑魚干擾素IFNY 2編碼基因的質粒為模板，設計分別帶有酶切位點的上下游引物，PCR擴增，所述的帶有酶切位點的上游引物的序列如SEQ ID N0:6所示，所述的酶切位點的下游引物的序如SEQ ID N0:7所示； 512.將步驟Sll所得PCR擴增產物克隆到原核表達載體pET22b上，即得含干擾素IFN Y 2的基因序列的重組表達載體。
7.根據權利要求5所述的的斜帶石斑魚干擾素IFNY 2重組蛋白的生產方法，其特征在于，步驟S3所述培養工程菌的條件為:將單菌落接種至5ml含100 μ g/mL氨芐青霉素抗性的LB培 養基，37°C，250rpm振蕩過夜培養，取過夜培養物以1: 100比例接種于含氨芐青霉素抗性的新鮮LB培養基中，370C，250rpm培養至0D600達到0.6，加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG，37°C、250rpm誘導培養7小時后，IOOOOrpm離心15min，收集菌體。
8.根據權利要求5所述的的斜帶石斑魚干擾素IFNY 2重組蛋白的生產方法，其特征在于，步驟S4所述的干擾素IFNY2蛋白的純化和變復性處理，包括以下步驟； 541.將收集的菌體用buffferB洗滌，再用bufffer B重懸，冰上震蕩裂解菌體2h，經高速離心獲得裂解上清液； 542.將收集的裂解液經固定化金屬配體親和層析純化，尿素洗脫液進行洗脫處理，收集蛋白洗脫峰； 543.將收集的蛋白洗脫液預冷后放入處理好的透析袋中，兩側袋口扎緊轉移至透析液，4°C透析過夜，每隔8h更換新的透析液，透析結束后將蛋白真空凍干。
9.根據權利要求5所述的的斜帶石斑魚干擾素IFNY2重組蛋白的生產方法，其特征在于，步驟S2和S3所述的工程菌為大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株。
10.一種天然魚類免疫增強劑或免疫佐劑，其特征在于，包括根據權利要求2所述的斜帶石斑魚干擾素IFN Y 2重組蛋 白。
全文摘要
本發明涉及斜帶石斑魚干擾素IFNγ2基因及其編碼的蛋白，以及該蛋白在制備一種新的免疫增強劑的應用。本發明通過引物擴增基因片段和RACE全長擴增的方法，以特異性引物SEQIDNO:4和SEQIDNO:5從斜帶石斑魚頭腎總RNA中克隆得到IFNγ2基因的開放讀碼框，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，本發明的斜帶石斑魚干擾素IFNγ2蛋白經初步驗證能夠誘導相關免疫基因表達，可開發為天然魚類免疫增強劑或免疫佐劑。
文檔編號C12N15/10GK103215274SQ20131016628
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月8日 優先權日2013年5月8日
發明者盧丹琪, 孫艷, 易詩白, 彭彎, 張勇, 林浩然 申請人:中山大學