用于制備果干的酶預處理的制作方法

專利名稱：用于制備果干的酶預處理的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于制備果干的工藝，包括在干燥步驟前將果實與多聚半乳糖醛酸酶接觸。
背景技術：
從葡萄轉變為葡萄干有三個主要操作預處理、干燥和干燥后操作(Food ReviewsInternational,23:257-280, 2007)。預處理的目的是提高葡萄皮對水分的滲透性。基于蠟質層的疏水性質，皮充當了 保護屏障。由漿果皮角質層的蠟質中的這種疏水分子屏障導致的低水分擴散性可能會導致費時的干燥工藝。已有文獻提出過葡萄干燥工藝中的化學預處理。一種常見的實踐是在預處理中應用油乳膠或稀釋的堿性溶液，其通過減少葡萄表皮的水分轉移的阻力和提高內部水分的擴散系數來加速干燥過程。常用的稀釋的堿性溶液包括碳酸鉀溶液和氫氧化鈉溶液等(Journal of Food Engineering 39(1999)211-216)。根據耕作條件，世界不同區域的葡萄干燥工藝不同。有3種主要方法用來干燥果實曬干、陰干和機械干燥。曬干法有幾個不利之處，包括由灰塵和昆蟲傳染導致的環境污染可能性、降雨引起的物理的微生物性變質和由強烈日光照射導致的褪色。對于果干生產，特別是需要高通量時，安全、快速和可控的機械干燥是有吸引力的。通過曬干或其它干燥技術生產出干葡萄后，必需將它們輸送到合適的處理單元。根據干燥方法，干燥后操作可能不同。一般來說，在干燥后操作的過程中，洗滌葡萄干以除去果干表面和小梗上的灰塵；洗滌之后，旋轉干燥葡萄干以除去水；然后清潔葡萄干，這包括分開每個葡萄干，除去莖和外來物質，和除去不合格的葡萄干；并且最后，使用食品級的油和化學物質來使葡萄干更好看且避免微生物。在干燥后操作之后，葡萄干已準備好進行包裝。JP2004057157描述了干燥后操作之后，對果干進行酶處理，所述酶處理造成對味道的修飾。到目前為止，大多數研究者專注于預處理和干燥，從而優化果干生產工藝以使操作更節能和有利于環境。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于果干制備的酶工藝，所述工藝包括在預處理過程中用多聚半乳糖醛酸酶處理果實。在本發明的具體的實施方案中，所述工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶和至少一種選自下組的酶的組合來處理果實果膠酯酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、￠-葡聚糖酶、淀粉酶和脂肪酶。在本發明的具體的實施方案中，所述工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶的組合來處理果實。在另一具體的實施方案中，本發明的酶處理之后是干燥步驟。特別地，本發明用于生產葡萄干。因為生產果干的機理和工藝是相似的，本發明可以適用于果實如葡萄、樓桃番爺、李子/梅子(plum)、杏、酸果蔓(cranberry)、藍莓和樓桃等來生產它們的果干。本發明可以在接近中性pH下進行，這意味著所述工藝通過減少流出液負載(effluent load)而對環境更有利。本發明處理過的果實甚至可以在后續干燥步驟中在相對短的時間內達到最優的脫水結果，這會節省能量。發明詳述 葡萄皮結構葡萄的皮由表皮和6到10層小厚壁細胞組成，在控制干燥過程中起著關鍵作用。葡萄漿果的皮的層數、其大小和體積是品種特異的問題。不同來源的葡萄在皮中的層數上可能有很大不同。外表皮被無生命層覆蓋，所述無生命層即角質層、皮孔、蠟質和厚角組織下皮細胞(collenchymatous hypodermal cell)。基于臘質層的疏水性質,皮充當抵抗真菌病原體的保護屏障。它進一步減少蒸發導致的失水并保護葡萄免于紫外線和物理傷害。皮還控制漿果和周圍環境的氣體交換。蠟質由無定形層和角質層內蠟質二者構成，所述無定形層由一系列重疊的疏水小板組成，所述角質層內蠟質存在于外表皮結構中。無定形層只允許水以蒸汽的形式轉移。但是，皮的角質層中蠟質的存在是干燥的障礙，需重點提及的是通過化學處理來除去蠟質以提高干燥速度時，需要特別注意，原因是其對干燥產品貯存期限和安全性的強烈影響。用于制備果干的預處理工藝文獻一定程度上已經提出了葡萄干燥工藝中的化學預處理的效果。應用油乳膠或堿性溶液的預處理是一種常見的實踐，通過減少葡萄表皮對水分轉移的阻力和提高內部水分的擴散系數來加速干燥過程。常用于預處理的堿性溶液包括碳酸鉀溶液和氫氧化鈉溶液等，一般pH值大于11。預處理會導致干燥速度加快，尤其在干燥過程的早期階段。化學物質的組成、濃度、PH和溫度及預處理時間是皮的各層微結構變化的有效因素。預處理工藝有關的物理和化學現象能繼而影響葡萄干燥參數。因此，為了生產出在干燥操作后能夠簡單和安全地進行加工的產品，控制預處理和干燥條件是必須的。本發明人驚訝地發現多聚半乳糖醛酸酶能夠在用于制備果干的預處理步驟中使用，若需要與至少一種酶組合使用，所述酶包括但不限于果膠酯酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、& -葡聚糖酶、淀粉酶和/或脂肪酶。在本發明的具體的實施方案中，所述工藝包含用多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶的組合來處理果實。本發明的酶預處理后可以是干燥步驟。根據工業需要，干燥步驟后的最終重量減輕達到大約70%或甚至更高。進一步地，干燥步驟之后可以是干燥后操作，以清潔葡萄干和/或施用食品級的油和化學物質。本發明的酶預處理工藝可以在10° 0、15° 5或20° 0以上的溫度進行。典型的溫度在 10-80。O、10-70。O、10-60。O、15-50。0,30-50° O、15-40。0、20_40 度進、15-30° 0或20-30° 0的范圍內。更優選地，其在室溫下進行。本發明的酶預處理工藝可以優選在pH 4-8、4-7或5-7的范圍內進行，更優選地是在接近中性的pH，比如pH 5. 5-7,5. 5-6. 5或6_7進行。在接近中性的pH下進行的處理具有工業價值，其使預處理步驟之后處理廢水溶液的過程更簡單。本發明的反應時間應該不少于3分鐘，優選地不少于5分鐘，更優選地不少于10分鐘，并且甚至更優選地不少于15分鐘。本發明的酶處理的合適持續時間可以從幾分鐘到幾小時，比如從約3分鐘到約48小時，或從約5分鐘到約24小時，或從約5分鐘到約12小時，或從約5分鐘到5小時，優選地從約5分鐘到約I小時，更優選地從約5分鐘到約30分鐘，更優選地從約10分鐘到約30分鐘，甚至更優選地約15分鐘到I小時，以及最優選地約 20分鐘到約I小時。本發明的酶應該以有效量添加。術語“有效量”的意思是指和堿性化學預處理相t匕，足以產生增強的干燥效果的量。應該理解的是，“有效量”會依賴于各種參數，包括酶的水溶液的濃度，溶液的PH，應用溶液的持續時間，溶液的溫度和葡萄的種類，例如皮的厚度、葡萄體積的大小和其它的果實特征。本發明中使用的劑量可以根據本領域中已知的方法來決定。在具體的實施方案中，本發明中使用的酶的量不少于待處理果實的0.5%。(以酶蛋白對果實重量計算，即每千克果實0. 5克酶蛋白)，更優選地，大于果實重量的1%。或2%0。在進一步的具體的實施方案中，酶量在果實重量的0. 5% _5%、0. 2% _5%、0. 5% _1%、1%0 _1%、2%。-1%、4%。-2%或4%。-1%范圍內。這些量指的是下面指示的各種酶的量。酶多聚半乳糖酵酸酶(PG)多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2. I. 15)催化果膠酸鹽和其它聚半乳糖醛酸中的1，4-a-D-半乳糖艾杜糖醒鍵(1，4-a-D-galactosiduronic linkage)的隨機水解。其它名稱的實例為果膠解聚酶；果膠酶；多聚半乳糖醛酸內切酶；內切多聚半乳糖醛酸酶；和半乳糖醛酸內切酶。系統名為多聚(1，4-a-D-半乳糖醛酸酐)聚糖水解酶。酶的來源對于在本發明方法中的使用并不關鍵。相應地，酶可從任何來源如植物、微生物或動物中獲得。酶優選從微生物來源如細菌或真菌中獲得，比如絲狀真菌或酵母，并且可以通過本領域中通常使用的技術獲得。在優選的實施方案中，酶從真菌來源獲得。例如，酶可以從酵母菌株如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉屬(Yarrowia)獲得；或者從絲狀真菌菌株如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、隱球菌屬(Cyptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、叢梗孢屬(Monilia)、毛霉菌屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、小核菌屬(Sclerotium)、側孢菌屬(Sporotrichum)、踝節菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭抱殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)菌株獲得。在具體的實施方案中，根據本發明使用的多聚半乳糖醛酶來源于曲霉，特別是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)。優選地,根據US 6，159，718獲得的是多聚半乳糖醒酸酶I、II或III。更優選地，所述多聚半乳糖醛酸酶具有與本發明中SEQ ID NO: I的成熟多肽至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少100%的同一性程度(下文中的“同源多肽”)。在一個優選的方面，同源多肽具有取代、缺失和/或缺失一個或多個(或幾個)氨基酸的SEQ ID NO: I的成熟多肽。更優選地，多聚半乳糖醛酸酶具有取代、缺失和/或插入至少10、9、8、7、6、5、4、3、2或I個氨基酸的SEQ ID NO: I的成熟多肽。
本發明中使用的“同一性”參數描述兩個氨基酸序列之間的相關性。就本發明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000, Trends in Genetics16:276-277 ；http://emboss, org)(優選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中執行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)來測定的。使用的可選參數是缺口產生罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性并且是如下計算的(相同的殘基XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)就本發明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,見上；http://emboss, org)(優選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970,見上)測定。使用的可選參數是缺口產生罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性并且是如下計算的(相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)此處上下文中描述的序列中的基本同源的多肽的特征為在成熟多肽中具有一個或多個(或幾個)氨基酸取代、缺失和/或插入。優選地，氨基酸改變對性質是較不重要的，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的折疊和/或活性；小缺失，典型的為I到大約9個氨基酸，優選地從I到大約15個氨基酸，且最優選地從I到大約30個氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至約5到10個殘基的小接頭肽，優選地從10到15個殘基，且最優選地從20到25個殘基，或通過改變凈電荷或另外的功能來幫助純化的小延伸，比如多聚組氨酸標簽，抗原性表位，蛋白質A，CBM或其它結合域。保守取代的實例是在以下組之內堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H. Neuratt^PR. L. Hill, 1979,于TheProteins, Academic Press, New York 中描述。最常發生的交換是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。能夠根據本領域已知的方法，例如定點誘變或丙氨酸分區誘變(Cunningham和Wells，1989，Science 244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的酶活性以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J. Biol.Chem. 271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物學相互作用也能夠通過結構的物理分析而測定，如通過以下這些技術如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接 觸位點氨基酸的突變來測定。參見，例如，de Vos等，1992，Science 255:306-312 ;Smith等，1992，J.Mol. Biol. 224:899-904 ；fflodaver 等，1992，FEBS Lett. 309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從分析與親本多肽相關的多肽的同一丨丨生來推斷。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關的篩選方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 和 Sauer, 1988, Science 241:53-57 ；Bowie 和 Sauer,1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 ；W0 95/17413;或 WO 95/22625 公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失、和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem. 30:10832-10837 ;美國專利5，223，409 號；W0 92/06204)和區域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46:145 ；Ner等，1988，DNA 7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999, Nature Biotechnology 17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領域內標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于未知結構的多肽。在一個具體的實施方案中，本發明中使用的多聚半乳糖醛酸酶的量不少于待處理果實的0.5%。(以酶蛋白對果實的重量計算)，更優選地，大于果實的1%。或大于2%。。在更進一步的具體的實施方案中，酶量在果實重量的0. 5% _5%、0. 2% _5%、0. 5% _1%、1%。-1%、2%0 _1%、4%。-2%、或 4%。-1% 范圍內。果膠酯酶(PE)果膠酯酶(EC 3. I. I. 11)催化的反應為果膠+n水=n甲醇+果膠酸鹽。其它名稱的實例為果膠脫甲氧基化酶；果膠甲酯酶；和果膠甲基酯酶。系統名為果膠甲酯酶(pectin pectylhydrolase)。來源于棘孢曲霉和大型亞灰樹花菌(Meripilus giganteus)的果膠酯酶分別在W094/25575 和 W097/31102 中描述。在一個具體的實施方案中，根據本發明使用的果膠酯酶具有與本發明中的SEQ IDNO: 2的成熟多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少100%同一性程度的氨基酸序列(下文中的"同源多肽")。在一個優選的方面，同源多肽具有取代、缺失和/或插入一個或多個(或幾個)氨基酸的SEQ ID NO:2的成熟多肽。更優選地，果膠酯酶具有取代、缺失和/或插入10、9、8、
7、6、5、4、3、2或I個氨基酸的SEQ ID NO:2的成熟多肽。在一個具體的實施方案中，本發明中使用的果膠酯酶的量不少于待處理果實的0. 5%0 (以酶蛋白對果實重量計算)、更優選地，相對于果實大于1%。或大于2%0。在進一步的具體的實施方案中，酶量相對于果實重量在0. 5%0 _5%、0. 2%0 _5%、0. 5%0 _1%、1%。-1%、2%0 _1%、4%。-2%、或 4%。-1% 的范圍內。果膠酸裂合酶
果膠酸裂合酶(EC 4.2.2.2)催化(1，4) - a-D-聚半乳糖醛酸的消除分解(eliminative cleavaeg)得到在其非還原端具有4_脫氧-a -D-半乳糖-4-enuronosyl基(4-deoxy-alpha-D-galact-4_enuronosyl group)的寡糖。其它名稱的實例為果膠酸反式消去酶(pectate transeliminase);多聚半乳糖醒酸反式消去酶(polygalacturonictranseliminase);和果膠內甲基反式消去酶(endopectin methyltranseliminase)。系統名是(1，4)-a-D-聚半乳糖醛酸裂解酶。在一個具體的實施方案中，根據本發明使用的果膠酸裂合酶來源于芽孢桿菌屬。果膠裂合酶果膠裂合酶(EC 4. 2. 2. 10)催化(1，4) - a -D-聚半乳糖醛酸甲酯的消除裂解得到在其非還原端具有4-脫氧-6-氧-甲基-a -D-半乳糖-4-enuronosyl基的寡糖。果膠裂合酶可能以如下名字為人所知果膠反式消去酶(pectin transeliminase);果膠內裂合酶(endo-pectin lyase);多聚甲基半乳糖醒酸反式消去酶(polymethylgalacturonictranseliminase);果膠甲基反式消去酶(pectin methyltranseliminase);果膠溶解酶(pectolyase)。根據本發明優選微生物的果膠裂合酶。微生物果膠裂合酶可以來源于細菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)。微生物果膠裂合酶優選從真菌中獲得。真菌可以是屬于擔子菌亞門(subdivision Basidiomycotina)或子囊菌亞門(subdivision Ascomycotina)的菌株。合適的實例包括可來源于曲霉屬菌種菌株的果膠裂合酶。WO 94/21786中描述了一種來源于棘孢曲霉的果膠裂合酶。來源于黑曲霉和米曲霉的菌株的果膠裂合酶是優選的。適用于本發明的商業果膠裂合酶組合物是 CITR0ZYM PREMIUM、PECTINEX SMASH XXL、N0V0FERM P 和 N0V0FERM 可從Novozymes A/S 獲得。脂肪酶合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的。包括化學或遺傳上修飾的突變體。脂肪酶例如可以是三酰基甘油脂肪酶(EC3. I. I. 3)，磷脂酶A2 (EC 3. I. I. 4)，溶血磷脂酶(EC3. I. I. 5)，甘油一酯脂肪酶(EC 3. I. I. 23)，半乳糖脂肪酶(EC3. I. I. 26)，磷脂酶Al (EC
3.I. I. 32)，脂蛋白脂肪酶(EC 3. I. I. 34)。有用的脂肪酶的實例包括疏棉狀腐質霉(Humicola Ianuginose)脂肪酶,例如，如在EP 258068和EP 305216中描述的，曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶，例如，如在EP 238023中描述的。其它類型的脂肪分解酶如角質酶可能也有用，例如，如在WO88/09367描述的來源于門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)的角質酶,或來源于豌豆腐皮鐮孢(Fusarium solani pisi)的角質酶(例如在WO 90/09446中描述)。特別適用的脂肪酶是如Ml Lipase 、Luma fast 和 Lipomax (Genencor)、Lipolase 和 Lipolase Ultra (可從 Novozymes A/S 獲得)，以及 Lipase P〃Amano〃(AmanoPharmaceutical Co. Ltd.)的脂肪酶。淀粉酶合適可 用的淀粉酶包括例如細菌或真菌來源的a-淀粉酶(EC 3. 2. I. I)、^ -淀粉酶(EC 3. 2. I. 2)和/或葡糖淀粉酶(EC 3. 2. I. 3)。包括化學或遺傳修飾的突變體。例如，淀粉酶包括獲得自地衣芽胞桿菌(B. Iicheniformis)的特殊菌株的a-淀粉酶，其在GBl，296，839中有更詳細的描述。相關的商業上可以獲得的淀粉酶包括Natalases\ Stainzyme 1、Duramyl Termamyl'8 ^ TermamyI uItra> Fungamyl* 和+BAN*:(都可從 Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark 獲得)以及Rapidase*和Maxamyf*P (可從 DSM, Holland 獲得)以及Purastar 、Purastar OxAm 和 Powerase (可從 DaniscoA/S獲得)。木葡聚糖酶根據本發明，木葡聚糖酶定義為任何對底物木葡聚糖有活性，能夠催化木葡聚糖溶解為木葡聚糖糖寡糖的酶。根據本發明木葡聚糖酶優選由微生物如真菌或細菌產生。有用的木葡聚糖酶的實例是家族12木葡聚糖水解內切葡聚糖酶。另一個有用的實例是由木霉屬(Trichoderma)產生的木葡聚糖酶，特別是EGIII。木葡聚糖酶也可以是具有木葡聚糖酶活性以及對不溶性纖維素的低活性和對可溶性纖維素的高活性的內切葡聚糖酶，例如，家族7內切葡聚糖酶，可獲得自例如特異腐質霉。
實施例材料和試劑葡萄來源于中國的綠葡萄，來源于中國的紫葡萄(從中國北京的超市購買)化學物質Na2HPO4 12H20、C6H8O7 H2O檸檬酸鹽緩沖液(pH4.0, 50mM) :9. 964g Na2HPO4 12H20 和 4. 656gC6H807 .H2O 溶解于IL去離子水。檸檬酸鹽緩沖液(pH5.5，50mM) :9. 964g Na2HPO4 12H20 和 4. 656gC6H807 .H2O 溶解于IL去離子水(pH值用0. lmol/L NaOH溶液調整為5. 5)。檸檬酸鹽緩沖液(pH6.5，50mM) :9. 964g Na2HPO4 12H20 和 4. 656gC6H807 .H2O 溶解于IL去離子水(pH值用0. lmol/L NaOH溶液調整為6. 5)。多聚半乳糖醛酸酶(PG):棘孢曲霉多聚半乳糖醛酸酶，如本發明中SEQID NO: I的氨基酸40-378的成熟肽所示(根據US 6，159，718獲得)果膠酯酶(PE):棘孢曲霉果膠酯酶，如本發明中SEQ ID NO:2的氨基酸18-331的成熟妝所不(UNIPR0T:Q12535,在“Pectin methyl esterase from Aspergillusaculeatus -expression cloning in yeast and characterization of the recombinantenzyme" ；Biochem. J. 319:705-712(1996)中描述)重暈損失測定葡萄通過分析天平稱重并記錄。在酶處理之后，將葡萄干燥并再次稱重。重量損失定義為(處理前重量-處理后重量)/處理前重量。
_0] 實施例I :用多聚半乳糖醛酸酶預處理葡萄在下列5個燒杯中加入IOOg葡萄(來源于中國的綠葡萄)。組I :向200ml NaOH濃度為15g/l、溶液pH值為13. 0的NaOH溶液中加入IOOg葡萄。組2 :向200ml檸檬酸鹽緩沖液(pH4. 0，50mM)中加入IOOg葡萄。
組3 :準備200ml 0. 2% (w/w)的低PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH4. 0，5OmM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。組4 :準備200ml 0. 4% (w/w)的高PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH4. 0，5OmM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。將2、3和4組中的葡萄在50° C下浸泡30分鐘。按照工業葡萄干生產工藝，將組I的葡萄在室溫下浸泡30秒。然后從燒杯中取出所有葡萄，在烘箱中以45° C干燥，并以幾個小時的間隔稱重來測定重量減輕。重量減輕結果在表I中給出。表I :干燥過程中的重量減輕
重量2小時 4小時 6*1、時 8小時 10小時22小時26小時
M#'- -
"T-3- mM 4w 4 -X-w 4 - . w 4 -￡~ -3E* w 4u 4 -X-
樣品處理物減輕減輕減輕減輕減輕減輕減輕組 I(NaOH) 2.0% 4.5% 6.9% 9.3% 11.1% 22.6% 27.8%#且29.4% 16.8% 22.3% 27.1% 31.5% 50.7% 55.6%
組 3(PG0.2%) 18.0% 27.4% 34.8% 40.8% 45.7% 65.6% 69.5%組 4(PG0.4%) 13.3% 23.8% 31.3% 38.4% 44.1% 65.2% 69.2%對于用多聚半乳糖醛酸酶處理的樣品，在干燥4小時后重量減輕達到27. 4%和23. 8%，而對于用NaOH處理的葡萄達到同樣水平的重量減輕花了至少22小時。在26小時的時候，用多聚半乳糖醛酸酶處理的樣品達到了接近70%的重量減輕，其符合葡萄干生產的重量減輕的工業標準，而用NaOH處理的樣品的重量減輕只有27. 8%。這些結果表明添加多聚半乳糖醛酸酶可以作為一種取代傳統的用NaOH來預處理葡萄，同時加速干燥過程的方法。實施例2 :用多聚半乳糖酵酸酶在不同的DH和溫度預處理葡萄在下列四個燒杯中加入IOOg葡萄(來源于中國的紫葡萄)。組I :向200ml濃度為15g/l的NaOH溶液中加入IOOg葡萄。組2 :準備200ml 0. 2%(w/w)的PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH4. 0，50mM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。組3 :準備200ml 0. 2%(w/w)的PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH5. 5，50mM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。組4 :準備200ml 0. 2%(w/w)的PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH6. 5，50mM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。將組2中的葡萄在30° C下浸泡30分鐘，將組3和4中的葡萄在50° C下浸泡30分鐘。按照葡萄干生產的工業過程，將組I的葡萄在室溫下浸泡30秒。然后從燒杯中取出所有葡萄，在烘箱中以45° C干燥，并且以幾個小時的間隔稱重來測定重量減輕。重量減輕結果在表2中給出。表2 :干燥過程中的重量減輕
權利要求
1.一種用于果干制備的工藝，該工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶處理果實。
2.權利要求I的工藝，其中所述工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶和至少一種選自下組的酶處理果實果膠酯酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和脂肪酶。
3.權利要求I或2的工藝，其中所述工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶處理果實。
4.前述權利要求中任一項的工藝，其中所述酶處理之后是干燥步驟。
5.前述權利要求中任一項的工藝，其中所述多聚半乳糖醛酸酶源自曲霉屬(Aspergillus)的菌株，優選源自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株。
6.前述權利要求中任一項的工藝，其中所述處理在高于10°C、或15° C或20° C的溫度進行。
7.權利要求6的工藝，其中所述處理在10-80°C、10-70° C、10_60° C、15_50° C、15-40° C,20-40° C、15-30° C 或 20-30° C 范圍內的溫度進行。
8.前述權利要求中任一項的工藝，其中所述處理在4-8范圍內的pH進行。
9.權利要求8的工藝，其中所述處理在6-7范圍內的pH進行。
10.前述權利要求中任一項的工藝，其中所述處理以不少于3分鐘的反應時間進行。
11.權利要求10的工藝，其中所述處理以3分鐘至48小時、或5分鐘至24小時、或5分鐘至5小時、或5分鐘至I小時、或10至30分鐘范圍內的反應時間進行。
12.前述權利要求中任一項的工藝，其中所述處理以按果實重量不少于0.5%。的酶劑量進行。
13.權利要求12的工藝，其中所述處理以按果實重量O.5%。_5%、0. 5%。-1%、1%。_1%或2%o -1%范圍內的酶劑量進行。
14.前述權利要求中任一項的工藝，其中所述果實選自下組葡萄、櫻桃番茄、李子/梅子、杏、酸果蔓、藍莓和櫻桃。
15.權利要求14的工藝，其中所述果實為葡萄。
全文摘要
本發明涉及一種用于果干制備的工藝，所述工藝包括在干燥步驟前將果實與多聚半乳糖醛酸酶接觸。多聚半乳糖醛酸酶能進一步與果膠酯酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶和脂肪酶組合使用。
文檔編號A23B7/02GK102762104SQ201180010309
公開日2012年10月31日 申請日期2011年2月25日 優先權日2010年2月26日
發明者吳桂芳, 趙娟, 閆愛華, 韓明光 申請人:諾維信公司