包含在螯合劑的存在下具有高穩定性的淀粉酶的變體的清潔組合物的制作方法

專利名稱：包含在螯合劑的存在下具有高穩定性的淀粉酶的變體的清潔組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含α -淀粉酶的變體的清潔組合物，所述變體相對于其親本酶對螯合劑具有改善的穩定性。
_4] 發明背景
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)構成一組酶，它們催化淀粉與其它直鏈和支鏈1，4_葡糖苷低聚-和多糖的水解。使用的第一細菌α -淀粉酶是來自地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)的α -淀粉酶，也稱為特妙淀粉酶，其已經被廣泛的表征并且已經測定了這種酶的晶體結構。堿性淀粉酶如來源于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的α-淀粉酶在WO 95/26397中公開，它們構成一組在洗滌劑中使用的特殊α-淀粉酶。多種這些已知的細菌淀粉酶已經經修飾已改善它們在特定應用中的功能。特妙淀粉酶和多種高效α -淀粉酶需要鈣以具有活性。發現特妙淀粉酶的晶體結構是四個鈣原子結合到α-淀粉酶結構中，所述結構由帶負電的氨基酸殘基配位。在其它α-淀粉酶中結合到結構中的鈣離子的量可能不同。這種對鈣的需求在其中存在強螯合化合物的應用中，例如在洗滌劑和清潔組合物中是一個缺點。如上所述，熟知的是許多酶依賴鈣或其它金屬離子如鎂或鋅以獲得活性和穩定性，因此，開發在包含螯合劑的洗滌劑和清潔組合物中既穩定又顯示良好性能的酶是一個挑戰。加入螯合劑以降低洗滌期間的水硬度、保護也可能存在的漂白劑，并且螯合劑也具有對移除污潰的直接效應。洗滌劑中依賴鈣的酶的穩定性有時能夠通過將鈣加到洗滌劑中進行改善，但是這常常將隨后破壞污潰移除效應。此外，將鈣加到液體洗滌劑中可能引起制劑問題，即，洗滌劑的物理穩定性問題。發明概沭因此，提供α-淀粉酶的組合物和變體將是有益的，它們對螯合劑穩定并且優選具有保留下來的或比親本α-淀粉酶更高的洗滌性能。因此，本發明的第一方面涉及包含親本α-淀粉酶的變體的清潔組合物，其中所述變體包含在一個或多個選自193、195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位點上的取代，所述位點使用根據SEQ ID NO :6的編號；并且還包含清潔助劑以及任選的至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O下測量時，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. 10mM。在另一方面，本發明涉及包含親本α-淀粉酶的變體的清潔組合物，其中所述α -淀粉酶的變體包含與SEQ ID NO 6至少70%相同的氨基酸序列；并且還包含在一個或多個選自193、195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位點上的取代，所述位點
使用根據SEQ ID NO :6的編號，并且還包含清潔助劑以及任選地還包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O下測量時，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. IOmM ;和清潔助劑。另一方面涉及包含親本α-淀粉酶的變體的清潔組合物，其中所述變體包含在一個或多個選自193、195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位點上的取代，所述位點使用根據SEQ ID NO :6的編號，并且還包含清潔助劑以及任選的至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O下測量時，在下述濃度下，所述螯合劑能夠將游離鈣離子的濃度從
2.OmM降低至O. IOmM,所述濃度小于能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. IOmM的檸檬酸鹽濃度的O. 9倍；和清潔助劑。在一個優選的方面，本發明涉及包含親本α-淀粉酶的變體的清潔組合物，其中所述變體包含在一個或多個對應于選自195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的 位點上的改變，并且還包含在一個或多個對應于選自116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458 的位點上的改
變，其中(a)所述改變獨立地為(i)緊接所述位點下游并鄰近所述位點的氨基酸的插入，(ii)占據所述位點的氨基酸的缺失，和/或(iii)占據所述位點的氨基酸的取代，(b)所述變體具有α -淀粉酶活性；并且(c)每個位點對應于具有氨基酸序列SEQ ID NO 6的酶的氨基酸序列的位點。在另一方面，本發明涉及包含親本α-淀粉酶的變體的清潔組合物，其中所述變體包含在氨基酸區域181、182、183、或184中的至少一個、至少兩個、或至少三個缺失，并且還包含在一個或多個選自195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的位點上的改變，并且還包含在一個或多個選自 116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458 的位點上的改變，其中(a)所述改變獨立地為(i)緊接所述位點下游并鄰近所述位點的氨基酸的插入，(ii)占據所述位點的氨基酸的缺失，和/或(iii)占據所述位點的氨基酸的取代，(b)所述變體具有α -淀粉酶活性；并且(c)每個位點對應于具有氨基酸序列SEQ ID NO 6的酶的氨基酸序列的位點。發明詳述定義α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)構成一組酶，它們催化淀粉與其它直鏈和支鏈1，4-葡糖苷低聚-和多糖的水解。已知α -淀粉酶來源于廣泛選擇的生物，包括細菌如來自芽孢桿菌屬例如地衣芽孢桿菌的菌種；來自真菌如米曲霉(Aspergillus oryzae) (TAKA-淀粉酶)或黑曲霉(Aspergillus niger)的菌種；來自植物如大麥的物種以及來自哺乳動物的物種。
野生型酶術語“野生型” α-淀粉酶指由天然存在的微生物例如天然存在的細菌、酵母或絲狀真菌表達的α-淀粉酶。當親本酶不是變體酶時，術語“野生型酶”和“親本酶”可互換使用。變體酶本文將術語“變體”定義為具有α-淀粉酶活性的多肽，其包含在親本或野生型α-淀粉酶的特定位點上一個或多個(或一個或若干個)氨基酸殘基的改變如取代、插入、和/或缺失。優選小于50個修改形式，更優選小于30個修改形式。經由人工干預，通過修飾親本α-淀粉酶獲得改變的α-淀粉酶。親本酶如本文所用，術語“親本” α-淀粉酶指進行修飾以產生本發明的變體α-淀粉酶的α-淀粉酶。這個術語也指與本發明的變體進行比較的多肽。親本可為天然存在的(野生型)多肽，或它甚至可為其通過任何合適方法制備的變體。例如，親本蛋白可為天然存在的多肽的變體，所述多肽的氨基酸序列已經被修飾或改變。因此，親本α-淀粉酶可具有一個或多個(或一個或若干個)氨基酸取代、插入、和/或缺失。因此，親本α-淀 粉酶可為親本α_淀粉酶的變體。親本也可為等位變體，它是由占據相同染色體座位的基因的兩個或更多個供選擇的替代形式中的任何一個編碼的多肽。改善的特性本文將術語“改善的特性”定義為與變體相關聯的特性，所述變體與親本ct -淀粉酶相比具有改善的特性。此類改善的特性包括但不限于例如當在EnzChek測定或PNP-G7測定中測量時提高的淀粉分解活性(如本文實施例部分所述)、提高的洗滌性能如去垢性能(例如對包含淀粉的污垢的去垢性能)、去污效果、抗變灰性能、穩定性如熱穩定性、pH穩定性、或在包括螯合劑在內的助洗劑存在下的穩定性、在粉末、液體或凝膠洗滌劑或盤碟洗滌組合物中的穩定性、改變的溫度依賴性能和活性特征、PH活性、底物特異性、產物特異性和化學穩定性。洗滌性能和/或盤碟洗滌性能可如下所述，按照本專利申請的“材料和方法”進行測量。優選地，本發明的變體包括改善特性的組合如改善的穩定性、改善的洗滌性能、改善的盤碟洗滌性能和/或在洗滌劑中改善的活性。改善的穩定性包括在濃縮洗滌劑產品中在貯藏期間的穩定性和在稀釋洗滌劑中在洗滌期間的穩定性。改善的特性包括在低溫下改善的洗滌或盤碟洗滌性能。在本文上下文中的術語“活性”是在特定條件下，通過每單位時間和每單位酶蛋白在包含三個或更多個1，4-α-連接的D-葡萄糖單位的多糖(例如淀粉)中水解1，4- a -D-糖苷鍵數量測得的淀粉水解活性，例如在特定條件下每mL酶樣品的每g酶蛋白獲得的活性。活性可如下所述，按照“材料和方法”在例如EnzChek測定或PNP-G7測定中進行測量。本專利申請中術語“活性”與“淀粉水解活性”互換使用。術語“比活性”常用于描述獲得的每mL(或g)酶蛋白的最大活性。改善的化學穩定性本文將術語“改善的化學穩定性”定義為在存在化學制品的情況下孵育一段時間后顯示保留酶活性的變體酶，所述化學制品是天然存在的或合成的，它們減少親本酶的酶活性。改善的化學穩定性也可使變體能夠在存在此類化學品的情況下更好地催化反應。在本發明的一個特定方面，改善的化學穩定性是在洗滌劑、具體地講在液體洗滌劑中的改善的化學穩定性。改善的洗滌劑穩定性具體講是當將本發明的α-淀粉酶的變體混合到包含螯合劑的液體洗滌劑制劑中時改善的α-淀粉酶活性穩定性，所述液體也包括凝膠或糊劑。液體洗滌劑制劑可指在衣物洗滌或自動盤碟洗滌過程中加入的濃縮洗滌劑或稀釋洗滌劑如洗滌溶液，即，其中加入濃縮洗滌劑的水溶液。
在本發明中液體洗滌劑用作液體衣物洗滌劑特別有效。穩定性術語“穩定性”包括貯存穩定性和在使用期間(例如在洗滌過程期間)的穩定性并反映淀粉酶根據時間的穩定性，例如當將淀粉酶保留在溶液(具體地講洗滌劑溶液)中時保留多少活性。例如α-淀粉酶的變體在31°C下，18小時后可具有超過70%的殘余活性(即，多少活性被保留)。穩定性受多個因素的影響，例如pH、溫度、洗滌劑組合物如助洗劑、表面活性劑等的量和類型。使用如“方法和材料”部分所述的EnzCheck測定或PNP-G7測定測量淀粉酶穩定性。改善的穩定性本文將術語“改善的穩定性”定義為變體酶展示出比親本α -淀粉酶提高的穩定性，例如當如“方法和材料”部分所述以EnzCheck測定測量時，在(I. 5w/v)DTPA的存在下，在31 °C，pH 8下，18小時后具有超過70%的殘余活性或相對于親本具有至少IOpp的殘余活性改善。如“方法和材料”部分所述，以親本殘余活性和變體殘余活性之間的差值計算變體相對于親本的殘余活性改善百分點(PP)。助洗劑助洗劑可根據M. K. Nagarajan等人，JAOCS,第61卷,9(1984年9月)， 第1475-1478頁所述的測試方法進行分類，所述方法用于測定將溶液中pH 8的水硬度從
2.OmM(CaCO3)降低至O. IOmM所需的最低助洗劑含量。所述助洗劑可尤其是與鈣和鎂離子形成水溶性絡合物的螯合劑。螯合劑是與某些金屬離子形成分子、鈍化所述離子以便它們不能與其它元素反應的化學物質，因此，粘合劑通過形成螯合物抑制化學活性。螯合是在配體和單個中心原子之間形成或存在兩個或更多個單獨的結合。所述配體可為任何有機化合物、硅酸鹽或磷酸鹽。在本發明上下文中術語“螯合劑”包括螯合劑、絡合劑、或多價螯合劑，它們與金屬離子如鈣和鎂形成水溶性絡合物。螯合效應描述了螯合配體對金屬離子的親和力比相似的非螯合配體集合對相同金屬的親和力更強。螯合劑具有與金屬離子，具體地講鈣(Ca2+)離子的結合能力，并且已經將其廣泛用于洗滌劑和組合物(一般來講，用于洗滌如衣物洗滌或盤碟洗滌)。然而螯合劑已經顯示它們自身抑制酶活性。在本專利申請中術語螯合劑與“絡合劑”或“螯合試劑”互換使用。因為大多數α -淀粉酶是鈣敏感的，這些螯合劑的存在可減弱酶活性。α -淀粉酶的鈣敏感性可通過在強螯合劑的存在下孵育給定α-淀粉酶并分析這種孵育對所討論的α-淀粉酶活性的影響進行測定。鈣敏感性α-淀粉酶將在孵育期間失去大部分或全部活性。表征螯合劑如上文所提到的，螯合物效應或螯合效應描述了螯合配體對金屬離子的親和力比相似的非螯合配體集合對相同金屬的親和力更強。然而，這種螯合效應的強度可通過多種類型的測定或測量方法進行測定，從而根據它們的螯合效應(或強度)區分螯合劑或給它們分級。在優選的測定中，可通過螯合劑在pH 8. O下將游離鈣離子(Ca2+)的濃度從2. OmM降低至O. IOmM或更低的能力表征它們,例如通過使用根據M. K. Nagarajan等人，JA0CS,第61卷,9 (1984年9月)，第1475-1478頁所述的方法進行測試。使用Nagarajan等人的方法表征螯合劑的實例在實施例2a中進行了描述。優選地，當在pH 8.0，21°C下測量時，根據本發明的螯合劑包括下列螯合劑，所述螯合劑在低于10mM，優選低于9. 5mM，優選低于9mM，優選低于8. 5mM,優選低于8mM,優選低于7. 5mM,優選低于7mM,優選低于6. 5mM,優選低于6mM,優選低于5. 5mM,優選地,優選低于5mM,優選低于4. 5mM,低于4mM,優選低于3. 5mM,優選低于3mM,優選低于2. 5mM,優選低于2mM,優選低于I. 5mM或優選低于ImM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. ImM或更低。優選地，當在pH 8，21°C下，在80mM的氯化鉀和49mM的EPPS((4-(2-羥乙基)哌嗪-I-丙磺酸))中測量時，根據本發明的螯合劑包括下列螯合劑，所述螯合劑在低于IOmM,優選低于9. 5mM,優選低于9mM，優選低于8. 5mM,優選低于8mM，優選低于7. 5mM,優選低于7mM,優選低于6. 5mM,優選低于6mM,優選低于5. 5mM,優選地,優選低于5mM,優選低于
4.5mM,低于4mM，優選低于3. 5mM,優選低于3mM，優選低于2. 5mM,優選低于2mM，優選低于
1.5mM或優選低于ImM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. ImM。在一個尤其優選的實施方案中，如“材料和方法”部分所述，當在pH 8，21°C下，在80mM的氯化鉀和49mM的EPPS中并使用用于測定游離鈣離子的濃度的鈣離子選擇性電極測量時，所述螯 合劑能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. ImM。因此優選地，如“材料和方法”部分所述，當在pH 8. 0，21°C下測量時，所述螯合劑包括下列螯合劑，所述螯合劑在低于10mM，優選低于9. 5mM,優選低于9. OmM,優選低于8. 5mM,優選低于8. OmM,優選低于7. 5mM,優選低于7. OmM,優選低于6. 5mM,優選低于6. OmM,優選低于5. 5mM,優選地，優選低于5. OmM,優選低于4. 5mM,低于4. OmM,優選低于3. 5mM,優選低于3. OmM,優選低于2. 5mM,優選低于
2.OmM,優選低于I. 5mM或優選低于I. OmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至 O. IOmM0在一個尤其優選的實施方案中，當在pH 8和21°C下，在80mM的氯化鉀和49mM的EPPS中測量時，所述螯合劑在9mM至O. 5mM,優選9mM至ImM，優選8mM至ImM，優選7mM至ImM,優選6mM至ImM,優選5mM至ImM,優選4mM至ImM,優選3mM至ImM,優選2mM至ImM,優選 9. OmM 至 I. 5mM,優選 8. OmM 至 I. 5mM,優選 7. OmM 至 I. 5mM,優選 6. OmM 至 I. 5mM,優選
5.OmM 至 I. 5mM,優選 4. OmM 至 I. 5mM,優選 3. O 至 I. 5mM,優選 2. 5mM 至 I. OmM,優選 2. OmM至I. ImM，優選I. 85mM至I. OmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. 10mM。游離鈣離子的濃度從2. OmM的Ca2+降低至O. IOmM對應于水硬度從200ppm(在酸性CO2的存在下，CaCO3為Ca(HCO3)2形式)降低至lOppm。最低助洗劑含量根據螯合劑鈉鹽并基于100%干燥螯合劑計算。螯合劑的螯合效應也可相對于檸檬酸鹽進行測量。給能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. IOmM的檸檬酸鹽濃度賦值為I并且將螯合劑的結果與該值比較。當在PH 8. O和21°C下測量時，在下述濃度下，根據本發明的優選的螯合劑能夠將游離鈣的濃度從2. OmM降低至O. 10mM，所述濃度低于檸檬酸鹽濃度的O. 9倍，例如低于O. 8倍，例如低于O. 7倍，例如低于O. 6倍，例如低于O. 5倍，例如低于O. 4倍，例如低于O. 3倍，例如低于O. 2倍，例如低于O. I倍。當在pH 8. 0，21°C下使用用于測定游離鈣離子的濃度的鈣離子選擇性電極測量時，當在PH 8. O和21°C下，在80mM的氯化鉀和49mM的EPPS中測量時，在下述濃度下，根據本發明的優選的螯合劑能夠將游離鈣的濃度從2. OmM降低至O. 10mM，所述濃度低于檸檬酸鹽濃度的O. 9倍，例如低于O. 8倍，例如低于O. 7倍，例如低于O. 6倍，例如低于
O.5倍，例如低于O. 4倍，例如低于O. 3倍，例如低于O. 2倍，例如低于O. I倍。在一個尤其優選的實施方案中，當在pH 8. O和21°C下測量時，在下述濃度下，所述螯合劑能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. 10mM，所述濃度低于能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. IOmM的檸檬酸鹽濃度的I. O倍至O. I倍，例如低于O. 9倍至O. I倍，例如低于O. 8倍至O. I倍，例如低于O. 7倍至O. I倍，例如低于O. 6倍至O. I倍，例如低于O. 5倍至O. I倍，例如低于O. 4倍至O. I倍，例如低于O. 35倍至O. I倍，例如低于O. 3倍至O. I倍。本發明的另一個實施方案涉及包含親本α -淀粉酶的變體的清潔組合物，其中所述變體α -淀粉酶包含在一個或多個選自193、195、197、198、200、203、206、210、212和213的位點上的取代，所述位點使用根據SEQ ID NO :6的編號，并且還包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O下測量時，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. IOmM ;和清潔助劑，在本發明的一個優選的實施方案中，所述清潔組合物包含親本α-淀粉酶的變體，其中所述變體包含在一個或多個在193至213的范圍內的位點上的取代,所述位點使用根據SEQ ID NO :6的編號，并且還包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8下測量時，在下述濃度下，所述螯合劑能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. 10mM，所述濃度小于能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. IOmM的檸檬酸鹽濃度的O. 9倍；和清潔助劑。本發明的另一個實施方案涉及包含親本α -淀粉酶的變體的清潔組合物，其中所述變體α -淀粉酶包含與SEQ ID NO 6至少70%相同的氨基酸序列，并且還包含在一個或多個選自193、195、197、198、200、203、206、210、212和213的位點上的取代，所述位點使用根據SEQ ID NO :6的編號，并且還包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O下測量時，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. 10mM。因此，根據本發明的螯合劑能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. 10mM，所述螯合劑的濃度比在相同條件下將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至O. IOmM所需的檸檬酸鹽濃度更低。作為另外一種選擇，將螯合劑和金屬離子如鈣和/或鎂離子形成的絡合物的強度表達為log K值(平衡或結合或分離或穩定常數)。這個常數可在給定pH、給定穩定和給定離子強度下測量。如上文所提到的那樣，將螯合劑和金屬離子如鈣和/或鎂離子形成的絡合物的強度表達為log K值(平衡或結合或分離或穩定常數)，該常數可通過等溫滴定微量熱法(isothermal titration calorimetry, ITC),如 A. Nielsen 等人，Anal. Biochem.,第 314卷，(2003)，第227-234頁所述進行測量，并且根據K值，可將log K計算為K值的對數(底數10)。通過這種方法測得的log K值將取決于溫度、pH、離子強度而不同，因此，當比較log K值時，在相似、優選在相同條件下測定它們是重要的。此外，通過導入標準物如檸檬酸鹽作為基準，可減少實驗中變量造成的影響。優選地，如本專利申請的“材料和方法”部分所述測定log K，因此，在本發明的一個實施方案中，當如“材料和方法”部分所述，在pH10和19°C下測量log K時，在根據本發明的組合物中的螯合劑具有至少3，例如至少4，例如至少5，例如至少6，例如至少7，例如至少8，例如至少9，例如至少10，例如至少11的log K。在根據本發明的組合物中的螯合劑的log K值也可在3-11的范圍內，例如3-10，例如3-9，例如3-8，例如4-11，例如5-11，例如6-11，例如4-10，例如5-10，例如4-9，例如5-9，例如4-8，具體地講5-8。優選地，在根據本發明的組合物中的螯合劑的log K值是至少1，例如至少I. 33，例如至少I. 67，例如至少2，例如至少2. 33，例如至少2. 67，例如至少3，例如至少3. 33，例如至少3. 67倍的檸檬酸鹽log K的因數，所述檸檬酸鹽的log K如實施例2b所述進行測定。根據本發明的組合物中的螯合劑也可在因數1-3.67的范圍內，例如
1-3.33，例如 1-3. 00，例如 1-2. 67，例如 I. 33-3. 67，例如 I. 33-3. 33，例如 I. 33-3. 00，例如
I.33-2. 67，例如 I. 67-3. 67，例如 I. 67-3. 33，例如 I. 67-3，具體地講 I. 67-2. 67 倍的檸檬酸鹽log K，所述檸檬酸鹽的log K如“材料和方法”部分所述進行測定。可用的螯合劑可為，但不限于下列螯合劑N-(1，2-二羧基-乙基)_D，L-天冬氨酸(105)4-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-單乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N，N- 二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-單丙酸(ASMP)、亞氨基二琥珀酸(IDA)、N_(2_磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亞氨二乙酸郎0么)、0-丙氨酸4，^二乙酸(α-ALDA)、絲氨酸-N，N-二乙酸(SEDA)、異絲氨酸-N，N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N，N-二乙酸(PHDA)、鄰氨基苯甲酸-N，N- 二乙酸(ANDA)、對氨基苯磺酸-N、N- 二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N，N- 二乙酸(TUDA)、磺甲基-N，N-二乙酸(SMDA)、N-(羥乙基)-乙二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、氨基三亞甲基膦酸(ATMP)。優選的螯合劑可包含氨基并且可為例如氨基-聚羧酸酯或膦酸酯。它可為包含一個、兩個或三個氨基(通常為仲或叔氨基)的單體分子，并且它可包含兩個、三個、四個或五個羧基或甚至更多個羧基。螯合劑可包含磷或不含磷。有多個螯合劑分類方法，一個方法可為如下方法螯合劑具有或基于羧酸根基團如EDTA(乙二胺四乙酸)、NTA(2，2'，2"-次氮基三乙酸酯)、檸檬酸根(鹽或酯)、2_羥基丙烷-1，2，3-三羧酸酯、DTPA(二亞乙基三胺五乙酸)、MGDA(甲基甘氨酸二乙酸或N，N’ -雙(羧甲基)丙氨酸)、EGTA(乙二醇四乙酸)、EDDS (I，2-乙二胺-N，N’ - 二琥珀酸)、GLDA(L_谷氨酸、N，N- 二乙酸)、聚羧酸酯如PAA [聚(丙烯酸)]、PAA/PMA[共聚(丙烯酸/馬來酸)]、或它們的混合物。包含磷的螯合劑可為多磷酸鹽或磷酸鹽，例如三聚磷酸鈉(STP)、HEDP (I-羥基亞乙基-I，I-二膦酸)、EDTMP [I，2-乙二胺四(亞甲基膦酸]、EDTMPA (乙二胺四亞甲基膦酸)、DTPMP ( 二亞乙基三胺五亞甲基膦酸)、DTMPA ( 二亞乙基三胺五亞甲基膦酸)。螯合劑可包含氮如 EDTA、NTA、DTPA, PDTA, GLDA, MGDA, EDDS, EDTMP, EDTMPA,以及 DTPMP 或 ASMA、ASDA, ASMP, IDA、SMAS, SEAS、SMGL, SEGL, MIDA、a -ALDA、SEDA、ISDA、PHDA, ANDA, SLDA,TUDA, SMDA, HEDTA, DEG, ATMP、或它們的混合物。因此，優選的螯合劑可為但不限于下列螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五亞甲基膦酸(DTMPA、DTPMP)、羥基亞乙基二膦酸(HEDP)、1，2_乙二胺N，N' - 二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、
2-羥基吡啶-N-氧化物(HPNO)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N，N-二乙酸(N，N- 二羧甲基谷氨酸四鈉鹽(GLDA)和次氮基三乙酸(NTA)、或它們的混合物。所述螯合劑可以酸性形式或鹽形式存在，優選地，所述螯合劑可以鈉、銨或鉀鹽形式存在。螯合劑在所述組合物中的量可為O. 0001重量％至20重量％，優選O. 01至10重 量％，更優選O. I重量％至5重量％。親本a -淀粉酶親本a -淀粉酶主要可為期望由其制備在貯藏或使用期間(例如在洗滌或淀粉水解過程中)具有改善的穩定性的任何a -淀粉酶。因此，改善的穩定性可視為貯藏期間淀粉水解活性損失的降低或使用期間提高到活性和性能。已知α-淀粉酶來源于廣泛選擇的生物，包括細菌如來自芽孢桿菌屬例如地衣芽孢桿菌的菌種；來自真菌如米曲霉(ΤΑΚΑ-淀粉酶)或黑曲霉的菌種；來自植物如大麥的物種以及來自哺乳動物的物種。親本α-淀粉酶主要可為任何起源的任何此類α-淀粉酶。熟知的是由芽胞桿菌屬產生的許多α-淀粉酶在氨基酸水平上是高度相同的。因為發現這些α-淀粉酶基本上相同，認為它們屬于同一類的α-淀粉酶，稱為“特妙淀粉酶樣α-淀粉酶”類。因此，在本文上下文中，術語“特妙淀粉酶樣α-淀粉酶”旨在指示α-淀粉酶，具體地講芽孢桿菌屬α -淀粉酶，其在氨基酸水平上表現為基本上相同，g卩，與具有如本文SEQ ID NO 20 (TermamyI )所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶至少60%的同一性。特妙淀粉酶樣α -淀粉酶許多已知芽孢桿菌屬α -淀粉酶的同一性可見于下表I :表權利要求
1.一種清潔組合物，包含 (a)親本a-淀粉酶的變體，其中所述變體包含在一個或多個選自195、193、197、198、·200、203、206、210、212、213和243的位點上的取代，所述位點使用根據SEQ ID NO 6的編號；和 (b)清潔助劑，優選地，其量為0.01至99.9重量％ ;以及任選的 (c)至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8.0下測量時，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. 10mM。
2.如權利要求I所述的組合物，包含螯合劑，其中 (a)當在21°C和pH8. 0下，在80mM的氯化鉀和49mM的EPPS中測量時，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. IOmM ;和/或 (b)當在如實施例2a所述的測定中測量時，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. IOmM ;和/或 (c)所述螯合劑在低于8mM，優選低于7mM，優選低于6mM，優選低于5mM，優選低于4mM的螯合劑濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. IOmM ;和/或 (d)當在21°C和pH8下測量時，在下述螯合劑濃度下，所述螯合劑能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. 10mM，所述螯合劑濃度低于能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. IOmM的檸檬酸鹽濃度的0. 9倍；和/或 (e)在下述螯合劑濃度下，所述螯合劑能夠將游離鈣離子的濃度從2.OmM降低至·0.IOmM,所述螯合劑濃度低于能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. IOmM的檸檬酸鹽濃度的0. 7倍，例如低于0. 5倍，例如低于0. 3倍。
3.一種清潔組合物,包含 (a)親本a-淀粉酶的變體，其中所述變體包含在一個或多個選自195、193、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位點上的取代，所述位點使用根據SEQ ID NO 6的編號；和 (b)清潔助劑，優選地，其量為0.01至99. 9重量以及任選的(c)至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. 0下測量時，在下述螯合劑濃度下，所述螯合劑能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. 10mM，所述螯合劑濃度低于能夠將游離鈣離子從2. OmM降低至·0.IOmM的檸檬酸鹽濃度的0. 9倍。
4.如權利要求I或權利要求2所述的組合物，其中 (a)所述變體包含至少兩個在一個或多個對應于位點195、193、197、198、200、203、·206、210、212、213或243的位點上的取代，所述位點使用根據SEQ ID NO :6的編號；和/或 (b)所述親本a-淀粉酶序列通過下列取代中的至少一個進行修飾193為[G、A、S、T或 M];位點 195 為[F、W、Y、L、I 或 V];位點 197 為[F、W、Y、L、I 或 V];位點 198 為[Q 或N];位點 200 為[F、W、Y、L、I 或 V];位點 203 為[F、W、Y、L、I 或 V];位點 206 為[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D 或 E];位點 210 為[F、W、Y、L、I 或 V];位點 212 為[F、W、Y、L、I 或 V]或位點 213 為[G、A、S、T 或 M];或 243 為[F、W、Y、L、I 或 V];和 / 或 (C)所述親本a -淀粉酶序列通過下列取代中的至少一個進行修飾193為T ;位點195為F或Y ;位點197為F或L ;位點198為N ;位點200為F ;位點203為F ;位點206為Y ;位點210為Y ;位點212為V或位點213為A ;或位點243為F和/或所述變體還包含在氨基酸區域181、182、183、或184中的至少一個、至少兩個、或至少三個缺失(使用SEQ ID NO 6用于編號);和/或 (d)所述變體包含在一個或多個對應于成熟多肽SEQID NO :6的位點193、195、197、.198、200、203、206、210、212、213的位點上的取代和在一個或多個對應于成熟多肽SEQ IDNO 6 的位點 116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、.320、339、359、418、431、434、447、458 的位點上的取代；和 / 或 (e)在螯合劑的存在下，在pH8和31°C下，18小時后，所述變體具有至少60%的殘余活性，其中在21°C和pH 8.0下，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. IOmM ;和/或 (f)在螯合劑的存在下，在PH8和31°C下，18小時后，所述變體具有至少70%的殘余活性，其中在21°C和pH 8.0下，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. IOmM,并且其中所述殘余活性如“材料和方法”部分所述進行測量；和/或 (g)當如“材料和方法”部分所述在AMSA中測量時，所述變體與所述親本a-淀粉酶相比具有改善的洗滌性能。
5.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中所述螯合劑選自EDTA、MGDA、EGTA、DTPA, DTPMP, HEDP,以及它們的混合物。
6.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中所述親本a-淀粉酶的變體包含在一個 或多個對應于選自成熟多肽 SEQ ID NO 6 的 195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的位點上的改變，并且還包含在一個或多個對應于選自成熟多肽SEQ ID NO :6的116、118、.129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、.434、447、458的位點上的改變；其中 (a)所述一個或多個改變獨立地為 (i)緊接所述位點下游并鄰近所述位點的氨基酸的插入， (ii)占據所述位點的氨基酸的缺失，和/或 (iii)占據所述位點的氨基酸的取代， (b)所述變體具有a-淀粉酶活性；并且 (c)每個位點對應于具有氨基酸序列SEQID NO 6的酶的氨基酸序列的位點。
7.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中所述親本a-淀粉酶的變體包含在氨基酸區域181、182、183、或184中的至少一個、至少兩個、或至少三個缺失，并且還包含在一個或多個選自195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的位點上的改變，并且還包含在一個或多個選自 116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、.303、320、339、359、418、431、434、447、458 的位點上的改變，其中 (a)所述一個或多個改變獨立地為 (i)緊接所述位點下游并鄰近所述位點的氨基酸的插入， (ii)占據所述位點的氨基酸的缺失，和/或 (iii)占據所述位點的氨基酸的取代， (b)所述變體具有a-淀粉酶活性；并且 (c)每個位點對應于具有氨基酸序列SEQID NO :6的酶的氨基酸序列的位點。
8.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中在包含螯合劑的組合物中，所述變體相對于所述親本a-淀粉酶或相對于SEQ ID N0:6具有改善的穩定性，其中在21°C和pH 8.0下，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM降低至0. 10禮，優選地，其中在螯合劑的存在下，在PH 8下，18小時后，所述變體具有至少60%的殘余活性，其中在21°C和pH 8. 0下，所述螯合劑在低于IOmM的濃度下能夠將游離鈣離子的濃度從2.OmM降低至0. 10mM，其中所述殘余活性如“材料和方法”部分所述進行測量。
9.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中所述具有淀粉分解活性的變體具有的氨基酸序列與成熟多肽SEQ ID NO :6、8、10、12、18或20具有至少60%，更優選至少65%，更優選至少70%,更優選至少75%,更優選至少80%,更優選至少85%,甚至更優選至少90%,并且最優選至少95%的同一性。
10.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中所述具有淀粉分解活性的親本多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸優選在至少低嚴格條件下，更優選在至少中嚴格條件下，甚至更優選在至少中-高嚴格條件下，并且最優選在至少高嚴格條件下與下列序列雜交a)成 熟多肽編碼序列SEQ ID NO :5、7、9或11、17、19 ； (ii)包含成熟多肽編碼序列SEQ ID NO 5、7、9、11、17、19的基因組DNA序列；或(iii) (i)或(ii)的全長互補鏈。
11.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中所述淀粉酶為親本a-淀粉酶的變體，其中所述親本a -淀粉酶為SEQ ID NO 6的酶，并且所述變體包含缺失D183*和G184*以及下列突變組中的一個(a)N195F+H210Y；(b)N195F+V206L、H、Y；(c)N195F+V206L+H210Y；(d)N195F+V206Y+Y243F； (e)NS18056-當我們得到突變時(f)S193T+V206L；(g)G133E+G149R+N195Y+Y203F+V206L； (h)I206L、Y； ⑴Y243F(j)N195F+V206L+Y243F ；(k)N195F ;或(1)V206F+Y243F。
12.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中所述螯合劑選自DTPA、HEDP、MGDA、DTPMP,以及它們的混合物。
13.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中所述清潔助劑包含以下中的一種或多種香料微膠囊、織物調色劑、蛋白酶、聚乙烯亞胺聚合物、脂肪酶、以及它們的任何混合物。
14.如任一項前述權利要求所述的組合物，其中所述組合物為液體衣物洗滌劑組合物。
15.—種衣物洗滌方法，包括優選在30°C或更低的溫度下，或更優選在20°C或更低的溫度下，用根據任一項前述權利要求的組合物洗滌衣服。
全文摘要
本發明涉及包含α-淀粉酶的變體的清潔組合物以及包含此類組合物的清潔方法，所述變體相對于其親本酶對螯合劑具有改善的穩定性。
文檔編號C12N9/28GK102753670SQ201180008929
公開日2012年10月24日 申請日期2011年2月10日 優先權日2010年2月10日
發明者埃斯基爾森·西格納·拉森, 安妮特·赫勒·約翰森, 延斯·厄布羅, 弗蘭克·溫特·拉斯穆森, 拉爾斯·貝耶爾, 斯文·卡斯加德, 林塞·蘇珊·比伊克, 米歇爾·米克, 艾倫·斯文森, 菲利普·弗蘭克·蘇特, 邁克爾·紹爾特, 馬斯·埃斯克隆·比約恩沃德 申請人:寶潔公司