專利名稱：趨于鈣耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的穩定化的制作方法
技術領域：
本發明涉及在酸性pH和/或存在強螯合劑的情況下，與其親本酶相比具有改進的穩定性的α-淀粉酶的變體。此外，本發明涉及編碼所述變體的核酸、產生所述變體的方法，和使用所述變體的方法。
背景技術：
α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一組酶組成，其催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。α -淀粉酶在幾個已知應用如洗滌劑、烘焙、釀造、淀粉液化和糖化(例如在高果糖糖漿的制備中或者作為從淀粉產生乙醇的一部分)中的工業使用具有悠久的歷史。α -淀粉酶的這些以及其它應用是已知的，并且利用源自微生物的α -淀粉酶，特別是細菌α -淀粉酶。最先使用的細菌α -淀粉酶是來自地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)的α -淀粉酶，也稱作Termamyl，其已經得到廣泛表征并且已經確定了這個酶的晶體結構。堿性淀粉酶，如AA560(SEQ ID NO: 2)，其披露于WO 00/60060中，形成了特殊的α-淀粉酶組，其已經用于洗滌劑中。已經對很多這些已知的細菌淀粉酶進行了修飾，從而改善它們在特定應用中的功能。Termamyl和很多高效α -淀粉酶的活性都需要I丐。在Termamyl的晶體結構中，發現在α-淀粉酶結構中有四個鈣原子通過帶負電的氨基酸殘基配位結合。對于鈣的需要在存在強螯合化合物的應用中是不足之處，如在洗滌劑中或從全谷物產生乙醇的過程中，其中使用α-淀粉酶水解包含大量天然螯合劑如肌醇六磷酸(鹽)的植物材料。已知對鈣不敏感的淀粉酶，例如，EP 1022334和WO 03/083054中披露的α -淀粉酶，和具有UNIPROT:Q03657中所披露序列的環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans) α -淀粉酶，但是在多種應用中進行淀粉水解和淀粉去除時，這些淀粉酶不及對鈣敏感的淀粉酶。因此，提供與其親本酶相比鈣敏感性降低的鈣敏感α -淀粉酶的變體是有益的。
發明內容
本發明涉及親本Termamyl-樣α -淀粉酶的分離的變體，其在對應于SEQID NO: 2的氨基酸1-485中的位置163、188、205、208和209的兩個、三個、四個或五個位置包含改變，其中所述改變獨立地為(i)緊鄰所述位置下游的氨基酸的插入， (ii)占據所述位置的氨基酸的缺失，和/或(iii)占據所述位置的氨基酸的取代，和其中所述變體具有α -淀粉酶活性。
本發明的變體進一步包含一個或多個其它取代。此外，所述分離的變體可以包含已知可改善α-淀粉酶性能的其他改變，包括對應于氨基酸183和184的缺失和在位置186、193、195、202、206、214、244、452、474和475中一個或多個位置的取代，并且每個位置對應于具有SEQ ID Ν0:2的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。本發明的變體與親本α -淀粉酶相比，鈣敏感性降低。本發明還涉及編碼變體α -淀粉酶或具有α -淀粉酶活性的多肽的分離的核苷酸序列，和包含所述核苷酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞。還提供用于制備本發明的變體的方法。本發明還涉及包含本發明的變體的組合物，特別是洗滌劑添加劑組合物、洗滌劑 組合物、用于手動或自動洗滌餐具的組合物或用于手動或自動洗滌衣物的組合物。此外，本發明涉及根據本發明的α -淀粉酶變體用于洗滌和/或餐具洗滌、織物退漿和淀粉液化的用途。本發明還涉及使用本發明的變體產生乙醇或其它化學品的方法。發明詳述定義α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一組酶組成,其催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。cDNA :術語“cDNA”意指能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少存在于相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現。編碼序列術語“編碼序列”意指直接指定多肽產物的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或其他起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。調控序列(control sequence):術語“調控序列”意指對編碼本發明變體的多核苷酸表達是必需的所有成分。各個調控序列對于編碼所述變體的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個調控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼變體的多核苷酸編碼區的連接。表達術語“表達”包括涉及變體產生的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語“表達載體”意指線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼變體的多核苷酸，并且所述多核苷酸與供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。片段術語“片段”意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α -淀粉酶活性。宿主細胞術語“宿主細胞”意指任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)。術語“宿主細胞”涵蓋親本細胞的任何后代，所述后代由于在復制過程中發生的突變而不同于親本細胞。改進的pH穩定性術語“改進的pH穩定性”在本文中定義為在特定pH溫育一段時間后顯示酶活性保留的變體酶，所述pH可降低親本酶的酶活性。改進的pH穩定性還可以產生在這種pH條件下能更好地催化反應的變體。分離的變體術語“分離的”和“純化的”意指從與其天然相關的至少一種組分移出的多肽或多核苷酸。舉例而言，變體如通過SDS-PAGE測定的，可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，和至少90%純，而多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，和至少95%純。成熟多肽術語“成熟多肽”意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本領域中已知宿主細胞可產生兩種或更多種由相同多核苷酸表達的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/ 或N端氨基酸)的混合物。核酸構建體術語“核酸構建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或受修飾以本來不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的區段，或其為合成的。當所述核酸構建體含有表達本發明的編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”同義。可操作地連接術語“可操作地連接”意指這樣的構型，其中將調控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導編碼序列的表達。親本酶本文使用的術語“親本” α -淀粉酶指對其進行修飾，例如，取代，插入，缺失，和/或截短而產生本發明的酶變體的α -淀粉酶。這個術語還指與變體進行比較和比對的多肽。親本可為天然存在(野生型)的多肽，或可為通過任何適當手段制備的變體。例如，親本蛋白質可為天然存在的多肽的變體，其經過修飾或者在氨基酸序列中發生改變。親本還可為等位變體，其為由占據相同染色體基因座的基因的兩種或更多種可選形式中的任一種編碼的多肽。序列同一性參數“序列同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000, Trends Genet. 16:276-277),優選3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所執行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)來測定。使用的可選參數為缺口開放罰分(gap open penalty) 10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty) 0. 5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩陣。使用 Needle 標記為“最高同一'I"生(longest identity) ”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為同一'丨生百分比，并計算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數)就本發明而言，兩個脫氧核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，見上文)，優選3. O. O版或更高版本的Needle程序中所執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970，見上文)來測定。使用的可選參數為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分O. 5和EDNAFULL (NCBINUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數)亞序列術語“亞序列(subsequence) ”意指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有α-淀粉酶活性的片段。變體術語“變體”在本文中定義為在多肽的一個或多個特定位置包含一個或多個氨基酸殘基的一個或多個改變，如取代、插入、缺失和/或截短的α -淀粉酶。野生型酶術語“野生型” α-淀粉酶表示由天然存在的微生物，如在自然界中發現的酵母或絲狀真菌表達的α-淀粉酶。變體命名規則在本發明中，采用α -淀粉酶變體中氨基酸殘基位置的特定編號方式。例如，通過比對已知α-淀粉酶的氨基酸序列，可以用氨基酸位置編號命名任何α-淀粉酶酶中的任 何氨基酸殘基。使用源于SEQ ID NO: 2中披露的α -淀粉酶氨基酸序列的編號系統，與大量其它α -淀粉酶的氨基酸序列比對，可以表示結構同源性區域中α -淀粉酶中的氨基酸殘基的位置。在描述本發明的多種α -淀粉酶變體時，為便于提述，適用下述命名法。在所有情況下，采用公認的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。取代。對于氨基酸取代，使用下述命名法原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226用丙氨酸取代蘇氨酸表示為“Thr226Ala”或“Τ226Α”。多個突變用加號(“ + ”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在位置205和411的突變，分別用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，和用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S)。在詳明特定位置(其中根據實際的親本可以由不同氨基酸占據所述位置)的氨基酸取代的情況中，原始氨基酸可以表示為X或Xaa。例如“X226A”意指占據位置226的氨基酸用A或Ala取代，與原始序列(親本序列)中占據位置226的氨基酸無關。籃失。對于氨基酸缺失，使用下述命名法原始氨基酸、位置*。因此，在位置195的甘氨酸的缺失表示為“Glyl95*”或“G195*”。多個缺失用加號(“ + ”)分隔，例如，“Glyl95*+Ser411*，，或 “G195*+S411*，，。通入。對于氨基酸插入，使用下述命名法原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入氨基酸。因此在位置195的甘氨酸后面插入賴氨酸表示為“Glyl95GlyLys”或“G195GK”。多個氨基酸的插入表示為[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入氨基酸#1、新插入氨基酸#2，等等]。例如，在位置195的甘氨酸后面插入賴氨酸和丙氨酸表示為“Gly195GlyLySAla”或“G195GKA”。在這種情況下，通過向插入的氨基酸殘基前面的氨基酸殘基位置編號加小寫字母來對插入的氨基酸殘基編號。因此在上述實例中序列為
權利要求
1.一種分離的變體α-淀粉酶，其在與SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置163、188、205、208和209相對應的位置包含兩個或更多個改變，其中 (a)所述變體與SEQID勵2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16和17中任一個具有至少70%并且低于100%的序列同一性， (b)每個改變獨立地為取代、缺失或插入；并且 (C)所述變體具有α-淀粉酶活性。
2.權利要求I 的變體，其與 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16 和 17 中任一個具有至少80%的序列同一性。
3.權利要求I 的變體，其與 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16 和 17 中任一個具有至少90%的序列同一性。
4.權利要求I 的變體，其與 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、ll、12、13、14、15、16 和 17 中任一個具有至少95%的序列同一性。
5.權利要求1-4中任一項的變體，其中在位置163、188、205、208和209的改變為取代。
6.權利要求1-5中任一項的變體，其中所述改變選自X163Q，N，X188N,X205N, X208Y和 X209N, S。
7.權利要求1-6中任一項的變體,其進一步包含選自下組的一個或多個改變在與位置183和184相對應的位置的缺失，和在與選自下組的位置相對應的位置的取代186、193、195、202、206、214、244、452、474 和 475。
8.權利要求1-7中任一項的變體，其進一步包含選自下組的一個或多個改變X181*+X182*， X182*+X183*， X183*+X184*， X185K, X167W, X202L/I/T, X203Y,X167W+X168E+X169E+X170R, X51T+X109G+X203Y, X109G+X203Y,X189W,X189ff+xl90E+xl93T,X190E, X193T, X303K, X303K+x305R+x306D+X409N+X432N+X434D, X305R, X306D, X409N,X432N, X434D。
9.權利要求1-8中任一項的變體，其進一步包含選自下組的一個或多個改變A113E，N116V, V117F, L118K, A119V, V120I, N123D, N126D, N128T, Q129K, G133E, D134P, Y135F,T136E, A139G, D144T, N150D, T151Q, D154S, R158N, W159S, Y160E, V165T, W167F, Q169A,S170K, R171G, Q172*， F173E, Q174R, N175T, R176G, I177V, Y178F, K179R, F180I, R181A,D183E, G184N, A186K, W189E, E190N, S193T/D, N195F, Y203F, V206I，E212D，V214R 和 N215R。
10.權利要求1-9中任一項的變體，其進一步包含選自下組的一個或多個改變D183*+G184*，G186A,Y, T, T193F, N195F, M202L, I, T,S,A, I206F,Y, V214I,S244A, D, E, N, Q, ff, T452HY, G474R, G475R。
11.權利要求1-10中任一項的變體，其選自下組D188N+D209S ；D163N+D188N+D209S；D163N+D188N+D205N+D209S ；D163N+D188N+D205N+M208F+D209S ；D207N+D209S ；D163N+D207N+D209S ；D163N+D188N+D207N+D209S ；D163N+D188N+D199N+D207N+D209S ；D163N+D188N+D199N+D205N+D207N+D209S ；D163N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S ；D163N+R181A+G182N+G186N+D188N+D205N+D209S ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+D209S ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S ；D163N+R181A+G182N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S;D163N+R181A+G182N+K185T+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+N409D+D432N+A434P ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W+H408W+N409D+D432N+A434P ；N128W+D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+K242P+S244W ；D163N+R181A+G182N+K185T+G186N+D188N+D205N+M208F+D209S+V238I+K242P+S244W ；和D163Q+D188N+M208F+D209S+K242P+S244W。
12.權利要求1-11中任一項的變體，其選自下組D188N+D209SD163N+D188N+D209SD163N+D188N+D205N+D209SD163N+D188N+D205N+M208F+D209SD207N+D209SD163N+D207N+D209SD163N+D188N+D207N+D209SD163N+D188N+D199N+D207N+D209SD163N+D188N+D199N+D205N+D207N+D209SD163N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209SD163N+R181A+G182N+G186N+D188N+D205N+D209SD163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D205N+D209SD163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D205N+M208F+D209SD163N+R181A+G182N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209SD163N+R181A+G182N+K185T+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209SD163N+R181A+G182N+K185T+A186N+D188N+D199N+D205N+M208F+D207N+D209S。
13.權利要求1-12中任一項的變體，其選自下組D207N+D186ND207N+D186N+D162ND207N+D186N+D162N+D203ND207N+D186N+D162N+D203N+M206YD207N+D186N+D162N+D203N+M206Y+D105ND207N+A184K+T187E D207N+A184K+T187E+D186ND207N+A184K+T187E+D186N+D162ND207N+A184K+T187E+D186N+D162N+D203ND207N+A184K+T187E+D186N+D162N+D203N+M206YD207N+A184K+T187E+D186N+D162N+D203N+M206Y+D105N。
14.一種洗滌劑組合物，其包含權利要求1-13中任一項的變體和表面活性劑。
15.一種組合物，其包含權利要求1-13中任一項的變體和選自下組的一個或多個酶β -淀粉酶，纖維素酶(β -葡糖苷酶、纖維二糖水解酶和內切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纖維素酶(例如，木聚糖酶)，異淀粉酶，異構酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶和支鏈淀粉酶。
16.權利要求1-13中任一項的變體用于洗滌和/或餐具洗滌的用途。
17.權利要求1-13中任一項的變體用于將織物脫漿的用途。
18.權利要求1-13中任一項的變體用于產生烘培產物的用途。
19.權利要求1-13中任一項的變體用于液化含淀粉材料的用途。
20.一種產生液化淀粉的方法，所述方法包括用權利要求1-13中任一項的變體液化含淀粉材料。
21.—種產生發酵產物的方法，所述方法包括 a.用權利要求1-13中任一項的變體液化含淀粉材料以產生液化醪； b.糖化所述液化醪以產生可發酵的糖；和 c.在存在發酵生物體的情況下發酵所述可發酵的糖。
22.—種產生發酵產物的方法，所述方法包括用權利要求1-13中任一項的變體、葡糖淀粉酶和發酵生物體接觸淀粉底物。
23.權利要求21或22的方法，其中發酵產物選自下組醇(例如乙醇和丁醇)，有機酸(例如，琥珀酸和乳酸)，糖醇(例如，甘油)，抗壞血酸中間物(例如，葡糖酸，2-酮-D-葡糖酸，2，5- 二酮-D-葡糖酸，和2-酮-L-古洛糖酸)，氨基酸(例如，賴氨酸)，蛋白質(例如，抗體及其片段)。
24.編碼權利要求1-13中任一項的變體的分離的多核苷酸。
25.包含權利要求24的多核苷酸的核酸構建體。
26.包含權利要求25的核酸構建體的表達載體。
27.包含權利要求25的核酸構建體的宿主細胞。
28.—種產生變體的方法，所述方法包括 a.在適合表達α-淀粉酶的條件下培養權利要求27的宿主細胞；和 b.從所述培養基回收變體。
29.用權利要求24的多核苷酸轉化的轉基因植物、植物部分或植物細胞。
30.一種用于制備親本α-淀粉酶的變體的方法，所述方法包括下述步驟 a.提供編碼親本α-淀粉酶的核酸，b.在核酸序列中引入改變，而在兩個、三個、四個或五個位置產生編碼的氨基酸殘基的改變，所述位置對應于親本α-淀粉酶中選自下組的位置163、188、205、208和209 ;所述改變獨立地為 (i)緊鄰所述位置下游的氨基酸的插入， ( )占據所述位置的氨基酸的缺失，和/或 (iii)占據所述位置的氨基酸的取代， c.任選地在核酸序列中引入其它改變，使親本α-淀粉酶的B-結構域中的一個或多個氨基酸殘基改變為SEQ ID NO:9中對應的氨基酸殘基； d.任選地在核酸序列中引入其它改變，而產生選自下組的編碼的氨基酸殘基的改變X183*+X184*，X186A, Y, T, X193F, X195F, M202L, I, T, S,A, X206F,Y, X214I,X244A, D, E, N, Q, ff, X452H, Y, X474R 和 X475R ； e.在適當的宿主生物體中表達改變的核酸序列；和 f.回收變體α-淀粉酶， 其中每個位置對應于具有SEQ ID ΝΟ:2的氨基酸序列的酶的氨基酸序列中的位置。
全文摘要
本發明涉及親本α-淀粉酶的變體，所述變體在鈣耗竭條件或低pH時穩定性或活性提高。
文檔編號C12N9/28GK102884183SQ201180011774
公開日2013年1月16日 申請日期2011年1月4日 優先權日2010年1月4日
發明者C.安德森 申請人:諾維信公司