專利名稱：：熱穩定的高溫酸性α-淀粉酶基因、工程菌、重組酶及應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程領域。涉及一種熱穩定高溫酸性a-淀粉酶及其某因和歪組酶，包括熱穩定高溫酸性a-淀粉酶基因的表達載體；本發明還涉及其基因T程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157(已f2007年9月06日保藏在中國微牛物菌種保藏管理委員會普通微牛物中心，保藏編號為CG:M:CCNo.2i57);本發明還涉及該齒株產重組熱穩定卨溫酸性u-淀粉酶方法與產品。
背景技術：
：a—淀粉酶為a-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(a-1，4-glucan-4-gluca加hydrolaseEC.3.2丄1),是最軍:要的工業酶制劑之一，已被廣泛應用在食品、發酵、紡織、造紙和制藥等諸多行業。目前工業用a—淀粉酶主要來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(GeobacillusstearothermopMus)和地衣芽孢樸菌(Bacilluslicheniformis),這些酶的最適作用條件為90。C和pH6，存在的主要問題是熱穩定性差，高于i00。C和pH低于6.0時易失活，熱穩定性依賴cf。超嗜熱微生物由于能產生在a溫下活性a，且具有很好熱穩定性的超卨溫酶，而成為研究的熱點。超嗜熱微生物處于特殊的物理、化學和生態環境，使它們形成了極為特殊的生物結構、代謝機制，導致來fi超嗜熱微生物的超高溫酶具有獨特的結構和功能，顯示了其獨特的特性具有極高的熱穩定性，通常能抵抗化學變性劑如表面活性劑、有機溶劑和高酸高堿環境，其催化功能優于g前在各種工業生產中應用的酶。因此，超高溫酶己作為研究酶的進化、酶的穩定性和酶的活性機制、蛋白質結構和功能的關系以及生物催化性的模型。目前國外研究的超高溫酶在分子牛物學、淀粉加工、纖維素的降解、乙醇的生產及化學合成工業已有廣泛的應用(Vieilleetal.，2()()1)，已有卨溫聚合酶、糖酶、淀粉酶、蛋白酶等兒種極端酶開始工業化生產，并且已經創造了數十億美元的經濟效益(肖湘等，2006)。可以在80-nox:范圍內生長的超高溫菌，是a-淀粉酶最重要的潛在來源，國外已報道產高溫a—淀粉酶的超嗜熱微生物主要為烏茲熾熱球菌(Pyrococcuswoesei)，強烈'識!冉J求菌(P,furiosus)，!冉7JC高i顯I求菌(ThermococcushydrothermaHs)、Thermococcusprofundus、Desulfurococcusmucosus、Pyrodictiumabyssi、海生葡萄狀嗜熱菌(Staphylothermusmarinus)、嗜熱網絡球桿菌(:Dictyoglomusthermop'hilum)，海棲熱袍菌(Thermotogamaritime),其中來源于Pyi'ococcuswoesei、Pyi'ococcusfuriosus、Thermococcushydrothe皿alis、Thermococcusprofundus禾口Thermotogamaritime等中a-淀粉酶基岡已被克隆和表達到常溫宿主細胞巾。國內近幾年開展了從超嗜熱微生物中克隆a-淀粉酶基因的研究，如將強烈熾熱球菌的a-淀粉酶基因在不同常溫宿主中表達，以及海棲熱袍菌的a-淀粉酶基因在大腸桿菌屮的表達的研究。
發明內容本發明的目的之一是從嗜熱古菌中克隆-一種熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的基因。本發明的熱穩定高溫酸性a-淀粉酶基因來自超嗜熱古菌嗜熱球菌ThermococcussicuirH:j2i菌株。本發明采用的技術方案是根據NC:Bi中已報道的超嗜熱古菌a-淀粉酶的基因序列設計引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)的方法獲得了超嗜熱古齒嗜熱球菌ThermococcussiculiHJ21a—淀粉酶基因的保守序列，采用SiteFinding-PCR技術擴增獲得超嗜熱古茼嗜熱球茼ThermococcussiculiHJ21.a—淀粉酶基岡兩端的序列。通過序列分析和拼接獲得了1374bp完整的超嗜熱古菌嗜熱球菌ThermococcussiculiHJ21a-淀粉酶基因。測定了其堿棊序列，如序列表SEQIDNO.l.所示本發明的另一目的是提供包括上述熱穩定高溫酸性a-淀粉酶基因堿基序列的表達載體。其是用常規方法將本發明的熱穩定高溫酸性a—淀粉酶基因的堿基序列連接f各種載休上構建而成，該載休可以是市售的質粒、粘粒、噬菌休或病毒載休等。較佳的是將PCR技術擴增到的熱穩定卨溫酸性a—淀粉酶基因產物和克隆載體pM::D18-T連接，形成克隆載體pMD18-T-amy,p:MD18-T-amy和表達載體p:Et-28a-His6分別用限制性內切酶消化，形成互補的粘性末端，經T4連接酶連接，形成熱穩定高溫酸性a-淀粉酶基因表達載體pEt-28a-ffis6-amy。本發明的再一目的是提供一種某因工程菌株，其是將包含本發明熱穩定高溫酸性a—淀粉酶基因堿基序列的表達載體轉化到感受態大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中得到的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157，如將表達載休pEt-28a-His6-amy轉化其中得到含有表達載休pEt-28a-ffis6-amy的大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pEt-28a扭s6-amyo本發明的乂-'目的是提供-'種制備重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的方法，其包括用k述木發明表達載體轉化宿主細胞，培養轉化體，獲得重組的熱穩定高溫酸性a-淀粉酶。本發明不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達歪組表達載體，在一優選實驗方案本發明使用BL21(DE3)。以上技術方案中所有基本分了生物操作均參照"分了克隆實驗指南"(第三版，科學出版社，2002年)本發明的^溫a-淀粉酶不僅可以水解淀粉，對于由葡萄糖以a-1,4糖苷鍵聚合的多糖都有.'定的催化能力。嗜熱古菌來源于太平洋深海熱液口，最適生長溫度為88"C。由于嗜熱古茼生長條件苛刻，人工培養困難，同時所含高溫a—淀粉酶的產量比較低，因此不能直接利用古生菌來生產a-淀粉酶。解決上述問題的有效方法就是利用棊因工程的方法將該基因轉入一種容易培養的宿主里面，進行表達。基f這一理論我們將高溫a-淀粉酶的基因導入大腸樸菌，進行表達。對來源于太平洋深海火熱液口的嗜熱古菌(通過培養、目的基因釣取，得到本發明所述高溫a-淀粉酶基因，基因測序工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。序列如SEQIDNO.l所示。我們將高溫a-淀粉酶基因重組到T系統載體上，然后轉入到大腸桿菌宿主巾，得到一株基岡工程茼株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157，已于2007年9月06日保藏在l卜:l微生物菌種保藏管理委員會普通微生物屮心，保藏編號為CGMCCNo.2157，保藏單位地址北京市朝陽區大屯路。基因工程菌表達產物是細胞內可溶性蛋白，通過超聲波破碎、加熱失活大腸樸菌雜蛋白，即nj進行分離純化得到重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶。本發明還具體公開了一種用以上技術方案中所述的基因工程菌株大腸埃希氏齒EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157產重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的制備方法，其步驟如F，(l)將基因工程菌株以1X的接種量接入裝有50m:L:LB(蛋白胨，1%;酵母粉，0.5%;NaCl，1%;pH7.0)培養基的250mL三角瓶屮，在37°C，180轉/分———F搖床培養，當培養菌液的OD,達到l.O時，再加入濃度為lmmol■L—'誘導劑IPTG，誘導4h,得發酵液；(2)將發酵液i3000Xg離心5min后去掉上淸，用3m:L牛理鹽水懸浮細胞，l:醫Xg離心5min去掉....匕清，重復此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細胞，()。C水浴中經超聲波破碎5min,13000Xg離心10min取上淸液即得重組熱穩定高溫酸性a—淀粉酶的粗酶液；(3)將制取的粗酶液用80。C水浴中處理30min，13000Xg離心10min取上清液，再用DEAE離子交換層析和Ni親和JS析的方法對至組酶進行純化，即得。以上技術方案所述的方法得到的重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的性質為該酶的分了量為約50KD;最適作用溫度9(rC，在95。C和l()(rC分別有90%和7()%的酶活力；該酶熱穩定性不依賴于Ca2、酶液分別在80、90、iO(TC保溫5'h后，其殘余酶活分別為82%、77%和69%;該酶的作用pH范圍為pH49,最適作用pH為5.05.5,在pH4.5有81%的殘余酶活；在80°C和901:下該酶在pH59和pH58的范圍內穩定，該酶在100tMh，pH57.5的范闈內穩定；金屬離子K—'—、Na+對酶有激活作用，Hg2"、:Pb2+、Al3+、Cu2+、Fe3+和Zn2+能夠抑制酶活性;lmmmol-L-1和5mmmo1七-1N-溴代丁二酰亞胺對酶的活性具有抑制作川；該酷的Km為45mg'mi;1，Vmax為9mg.ml4.min1;該酶分解馬鈴薯淀粉為麥芽'始和4T-1唐。應用大腸桿菌工程菌EHJ21表達高溫蛋白經活性實驗鑒定，具有a-淀粉酶活性，該高溫蛋白即為所述的重組熱穩定高溫酸性a—淀粉酶。重組熱穩定卨溫酸性a-淀粉酶具有普通a-淀粉酶所不具備的特點，能在7()100。C高溫下催化反應，有很強的抗高溫和化學物質變性劑的作用；運用到生產中，有儲運成木低、加快動力學反應、對冷卻器系統要求標準低等優點。重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶可應用于淀粉水解，催化淀粉液化，在食品工業、生物化工，醫藥業等領域具有軍:要的應ltj潛力。圖l為本發明熱穩定高溫酸性a-淀粉酶基因的PCR擴增圖譜，其中，M:DNAMarker,i，2:為a—淀粉酶基因的PCR擴增產物。圖2為pMD18-T-amy的構建圖。圖3為本發明克隆質粒p:M:D18-T-amy的EcoRI和SalI:雙酶切分析圖譜，其中，M，DNAMarker,1，pMD18-T-amydigestedbyEcoRI/SalI。圖4為軍:組表達載體pEt-28a-His6-amy的構建圖。圖5為本發明表達質粒pEt-28a-His6-amy經EcoRI和SalI雙酶切分析圖譜，其中，Ml，M2，DMAMarker;1，a-淀粉酶基因的PCR擴增產物；2,EcoRI&Sall;3，pEt-28a-His6-amy/EcoRI:。圖6為本發明基因工程菌株表達產物重組熱穩定^溫酸性a-淀粉酶的SDS-PAGE電泳圖，其中，M為標準蛋白；1,2，純酶；3，Ni親和^析；4，D:EAE離子夂換層析；5:加熱處理；6，粗酶液；7，活性帶。圖7為溫度對重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶酶活力的影響圖。圖8為pH溫度對繭組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶酶活力的影響圖。圖9為重組熱穩定高溫酸性a—淀粉酶的溫度穩定性圖。圖10為重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的pH穩定性圖。圖ii為重組a—淀粉酶水解可溶性淀粉的Lineweaver-Burk圖。圖12為重組熱穩定卨溫酸性a-淀粉酶水解'纟鈴薯淀粉產物薄層層析圖，1-4為1、6、16、24h;Gl，葡萄糖；G2，麥芽糖；G3，左芽三糖；G4,麥芽四糖；G5，麥芽五糖；G6，麥芽六糖；G7，麥芽七糖。具體實施例方式以下參照附圖，進一歩描述本發明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發明，rfn不構成對其權利的限制。K列實施例中的材料與方法為所采用的分子克隆技術參見J.莎畝布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。所使用的工具酶購自大連寶生物公司和....匕海生工生物工程公司，具體的反應條件和使用方法均參考商品說明書。所使用的膠回收試劑盒購自大連寶生物公司，使用方法均參考商品說明書。實施例1。從ThermococcussiculiHJ21克隆熱穩定高溫酸性a—淀粉酶基因。根據NCBI屮已報道的超嗜熱古菌a-淀粉酶的雄閑序列設計引物，通過聚合酶鏈式反應的方法獲得了ThermococcussiculiHJ21a—淀粉酶基因的保守序列，采用SiteFinding-PCR技術擴增獲得ThermococcussiculiHJ21a—淀粉酶基因兩端的序列。通過序列分析和拼接獲得了i374bp完整的ThermococcussiculiHJ2ia-淀粉酶基因(見圖丄)，其堿基序列如SEQIDNo.l所示，編碼成熟肽的DNA的大小1374bp。實施例2。克隆質粒pM:D18-T-amy的構建。根據實施例l.得到的a-淀粉酶的基岡序列，設計正向引物1和反向引物2。在引物1加上EcoRI酶切位點，在引物2加上Sail酶切位點。引物l.序列5，GCGCGAATTCATGAACAGGGGTATAT-3'，劃線部分為EcoRI位點。引物2序列5，-TAGTCGACTCAGCCCACCCCACAG-3,劃線部分為SalI位點。以ThermococcussiculiHJ21基因組DNA為模板進行PCR擴增，結果如圖1，擴增出的片段約1400'bp，與預測的結果一致。PCR產物電泳，利用TaKaRa公司GelExtractionKit試劑盒割膠回收純化。與pMD18-T載體連接，構建了克隆質粒pMD18-Lamy(見圖2)，轉化大腸桿菌感受態細胞，通過藍白菌落初步篩選陽性克隆，進一歩將重組質粒用EcoRI和SalI同時進行雙酶切后電泳檢領U，在1.4kb處"-條特異性亮帶(見圖3)，證明所選重組了為陽性克隆，與已經獲得的淀粉酶基因序列對比表明序列完全正確。實施例3。表達載體pEt-28a-His6-amy的構建。重組T-載體(pMD18-T-amy)和pEt-28a-:ffis6分別進行EcoRI和SalI雙酶切，其酶切反應體系(20PL)如下10XbufferH2uLEcoRI(或SalI)(l()U.u1uLpEt-28a-His6(或PCR產物)14uL將pMD18-T-amy進行EcoRI和SalI雙酶切，膠回收1/lkb條帶，對pEt-28a質粒進行EcoRI和SalI雙酶切，膠回收5.6kb的條帶；將前后兩次膠回收產物混合，i6°C連接18h(如圖4)，構建了N端含有A個組氨酸標簽的表達載體pEt-28a-His6-amy。外源基因在E.coli表達吋，為'/簡化表達產物的純化步驟，通常添加His、M:BP等標簽，使表達產物可以通過M-NTA層析柱純化(Schliebenetal.，2004)。岡此在構建表達載體時在N端添加了:ffis。標簽。重組質粒pEt-28a-扭s。-amy經EcoRI和SalI雙酶切，電泳驗證發現在1,4kb左右處出現一條亮帶，證明軍:組i—F.確，見圖5。實施例4。一種用于表達實施例1所述的熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157,它是將實施例3所述的表達載休pEt-28a-His6-amy轉化到大腸桿菌E.coliB:L2i(:DE3)中得到的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMC:CNo2157。實施例5。-'種用實施例4所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo21.57產重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的制備方法，其步驟如卜.，(1.)將棊因工程菌株以1%的接種量接入裝有50mLLB培養某的25()mL三角瓶中，在37。C，180轉/分下搖床培養，當培養菌液的ODe。。達到1.0時，再加入濃度為lmmolL-1誘導齊IJIPTG，誘導4h，得發酵液;(2)將發酵液i3000Xg離心5min后去掉上淸，用3m:L牛理鹽水懸浮細胞，l:醫Xg離心5min去掉....匕清，重復此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細胞，()。C水浴中經超聲波破碎5min,13000Xg離心10min取上淸液即得重組熱穩定高溫酸性a—淀粉酶的粗酶液；(3)將制取的粗酶液用80。C水浴中處理30min，13000Xg離心10min取上清液，再用DEAE離子交換層析和Ni親和JS析的方法對至組酶進行純化，即得。上述歩驟(3)采用加熱處理、DEAE離子交換層析、Ni親和層析的方法對重組酶的粗酶液進行了純化(見表l)，在SDS-PAGE上a-淀粉酶的活性染色帶與考馬斯亮藍染色帶一致，其分子量為50KDa(見圖6)。表1粗酶液的純化<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例6。實施例5所制得的重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的酶學性質研究。[ooeo](1—)溫度對酶活力的影響。將酶分別在50、60、70、80、85、90，95和IO(TC水浴中進行酶活測定。用pH5.0的乙酸鈉溶液配置的1%(w，"淀粉溶液作為作用底物。至組a-淀粉酶的最適作用溫度9CTC時，在95。C和100。C分別:"90%和70%的酶活力(見圖7)。(2)pH對酶活力的影響。將酶液與在不同pH的i%(wv1)的可溶性淀粉溶液中在95T下進行酶活力測定。采用兩種方法配制不同pH的lX(wv,的可溶性淀粉溶液，第一種方法為不同pH值的緩沖液為50mmol.L—1檸檬酸鈉緩沖液(pH3.04.0);50mmo1L—1乙酸鈉緩沖液(pH4.06.0);5()mmo1L-1磷酸鈉緩沖液(pH6.07.5);5()腿01'L-'Tris-鹽酸緩沖液(pH7,59,0)。第二種方法用各種不同pH的Britton-Robinson緩沖液(pH41l)(Rauenetal.，1964)。ig組a—淀粉酶的作j-tjpH范圍為pH49，最適作用pH為5.5,在pH4.5和pH5.0分別閂、-f/81%和93%的相對酶活(見圖8)。(3)溫度對酶熱穩定性的影響。將酶分別在80、90和iOO。C的水浴中保溫進行溫度對酶穩定性的實驗，同時在每個溫度下增加一組含有5mmo1L—1Ca21的酶液，用以驗證該酶的熱穩定性是否依賴Ca2+，每個溫度保溫5h,每隔l'h取出.'組樣品，迅速置T冰水中，待保溫結束后統.-進行酶活力測定，以未處理酶液作為對照。重組a-淀粉酶熱穩定性好，酶液分別在80、90、100。C分別保溫5h后，其殘余活性分別為82%、77%和69%(見圖9)。(4)pH對酶穩定性的影響。將酶液與不同pH的伯瑞坦-羅賓森(Britton-Robinson)緩沖液pH4.59混合，分別在8()、9()和l()()t:的水浴中保溫lh后取測定殘余酶活，以未處理的酶液的酶活設為丄00%。在不同pH的伯瑞坦-羅賓森緩沖液中分別在80、90和iOO。C處理丄'h，實驗結果表明在8()"C和9()'C下該酶在pH59和pH58的范圍內均有較好的穩定性，該酶在10(TC下pH穩定范圍變窄，只在pH57.5范圍內M示較好的穩定性。在三個溫度下pH5.5穩定，pH5.0和pH6.0的穩定性也很好，相對酶活均在80%以l:，見圖10。(5)金屬離子或化學試劑對酶活性的影響。將各種金屬離子與酶液混合，使其最終濃度分別達到1..()mmol■L—1和5.0mmo卜L入然后在9(TC下測酶活。將各種常用化學試劑與酶液混合，使其最終濃度分別為lmmol.U1和5mmo1.L—1測酶活，均以未處理的酶液的酶活設為100%。金屬離了K+、Nai對酶有激活作用，Kg,Pb2+、Afi、Cu2+、Fe3+和Zi^等能夠強烈的抑制酶活性(見表2)。lmmmol■L—1的尿素、碘乙酸、EDTA和DTT溶液對酶的抑制作用較弱，而lmmmol.:L"和5mmmo1.:L"NBS對酶的活性具有較強抑制作用(見表3)。表2金屬離子對歪組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶影響金屬離子1mmolLT15mmolLT1MetalionCa2+97.5±3.481.2±3.6Co2+81.8±0.153.0±2.1Ba2+111.6±6.298.4±0.8Hg2+32.7±2.80.0±0.0IT116.2±0.497.1±2.1Pb2+0.0±0.00.0±0.0Mn2+46,6±0.68.1±0.0Ni+57,4±0.121.3±3.0Mg2+100.2±3.526.0±0.9Si>111.3±0.845.5±2.1Li+103.8±0.362.7±0.6Ag+Al3+112.0±0.2106.9±3.00±0.01.1±0.0Cu2+O士O.OO士O.ONa+102.6±0.3109.5±1.6Fe3+0.0±0.00.0±0.0Zn2+3.3±9.71.1±0.0表3化學試劑對重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶影響變性劑degenaration1mmolLT15mmol.LT尿素ureau95.0±0.17104.8±0.56SDS101.2±2.0374.9±1.83三氯乙酸TCA0.8±0.490碘乙酸Iodoaceticacid85.0±4.350EDTA67.9±2.8422.1±1.03N-溴代丁二酰亞胺O土O.O0±0.0(NBS)N-Bromosuccinimide二硫蘇糖醇112.1±0.49106.1±5.26Drthiothreitol_(6)酶動力學研究。選擇適當的nj溶性淀粉濃度梯度進行酶動力學研究，梯度為2、3、'1、5、8、丄0、15、20、30和40g.:L—'，反應休系為取i90uL不同濃度的淀粉溶液加入淀粉酶1()PL，于9()。C下準確反應1()min,取出If^迅速加入2()()uLDNS沸水浴5min，加入3mL蒸餾水，在520nm下測定吸光值。以fH濃度的可溶性淀粉作為底物，對重組的純化淀粉酶進行酶動力學測定，根據Lineweaver-Burk理論，由方程V1=Km'Vmax1'S—i+Vmax1求得該酶的Km為45mg.m:L—1，Vmax為9.0mg.ml—1mn—:l(見圖11)。(7)虛組熱穩定高溫酸性ci—淀粉酶水解產物特異性研究。以1%(w.v。的馬鈴薯淀粉作為底物，襯-ii升底物溶液中加入100UL稀釋的酶液，置f9(rC水浴中，分別反應l、6、16和2他，取不同反應時間的產物進行高效薄層層析，展劑使用正丁醇、乙酸和水的混合物，顯色劑為5%濃硫酸和乙醇溶液，使用噴霧器將顯色劑均勻噴撒到千燥后的薄層板上，置于1()5。C下顯色2()3()min。該重組超卨溫a-淀粉酶可以很好的水解馬鈴薯淀粉，在作用lh后既已將馬鈴薯淀粉糊精化，繼續反應后形成含麥芽糖在內的一系列寡糖，隨著水解時間的延長糊精逐漸減少，麥芽寡糖含量逐漸升高，連續作用24h后層析圖中未發現葡萄糖生成(見圖12)，表明該重組a-淀粉酶分解馬鈴薯淀粉，其主要產物是麥芽糖和麥芽三糖。SEQIDNO.l<11()>淮海工學院<120>熱穩定的高溫酸性a-淀粉酶基因、工程菌、重組酶及應用<15()>2()()81()()21753.5<151>2008-08-12<160>1<170>:Patentnversion3,3<210>1<211>1862<212>DNA<2L3>ThermococcussiculiHJ2丄<4()()>1:0091]cgcgaaagctgcgagctgtgcgagaaggcaaagcgcgtcaagaatctcatcgaactctaa60:0092]cttttttcccactattgaaacacgacgttccattttcaacacttaatcccatgttctttt120:0093]acgtcctttoatg腺catto站g她Mgctto組站ttcaccgc伊gtg站站Mtot180:0094]gggcacgtgcccaaatagatacgtgggggattgccatgaacaggggtatattggcggcac24-0:0095]tggtgatagccctggttgtcttaagcgtctctgctgtccctgcaaaggccgagacccttg300:0096]aaaacggcggagtgataatgcaggccttctactgggacgtccccggtgggggaatctggt360:0097]gggacaccatagcccagaagataccagactgggcgagcgcaggaatttcggcaatatgga420:0098]ttccccccgcgagc牆gggc噸agcggcggctectccatgggctocgatccctocgact4-80:0099]acttcgacctcggcgagtactaccagaagggaaccgttgagacccgcttcggctccaagg540:0100]ccgagctggtgaacatgataaacaccgcccacgcctacaacatgaaggtcatagccgaca600:0101]tagtcatcaaccaccgcgccggcggagacctcgagtggaaccccttc魄aacgactaca660:0102]cctggaccgacttctccaaggttgcctccggcaagtocaccgccaactocctcgacttcc720:0103]acccgaacgagcttcacgcgggcgattccggaacctttggcggctatccggacatatgcc780:0104]acgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgccgcctacc840:0105]tcaggagcatcggcgttgatgcctggcgcttcgactacgtgaagggctacggcgcttggg900:0106]tggtcaaggactggctcagctggtggggcggctgggcggtaggagagtactgggacacca960:0107]acgtcg噸ccctcctg堪ctgggcctocgac紹cggtgccaaggtcttcgacttcccgc1020:0108]tctactacaagatggacgaggccttcgataacaacaacattcccgcgctggtagatgccc1080<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求一種熱穩定高溫酸性α-淀粉酶基因，其特征在于，它具有序列表中的SEQIDNO.1所示的堿基序列。2.-浙熱穩定高溫酸性a-淀粉酶，其特征在T，它具有序列表中S:EQI::DNO.l所示的堿基序列編碼的蛋白序列。3.--種堿基序列的表達載體，其特征在于，它是包括權利要求l所述的熱穩定高溫酸性a—淀粉酶基因的堿基序列的表達載體pEt-28a-His6-amy。4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于，它由下列方法制得將權利要求l所述的熱穩定高溫酸性a-淀粉酶基因的堿基序列擴增，與質粒pMD18-T載體連接，得到克隆載休pMDi8-T-amy,再將克隆載休pM:Di8-T-amy和表達載休pEt-28a-His6分別經EcoRI和Sail雙酶切后連接得到表達載體pEt-28a-ffis6-amy。5.-f巾用T表達權利耍求2所述的熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的基因工程菌株大腸埃希氏茼EHJ21.(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.21.57，其特征在于，它是將權利要求3或4所述的表達載體pEt-28a-Hivamy轉化到人腸桿菌E.coHBL21(DE3)中得到的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMC:CNo.2157。6.-—種用權利要求5所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EschericWacoliEHJ21)CGMCCNo.2157產重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶的制備方法，其特征在f,其步驟如(1)將基因工程齒株以1%的ft種一接入裝有5()mLLB培養基的25()mL二角瓶中，在3rC，180轉/分下搖床培養，當仏;'「茵液的CO,達到1.0時，再加入濃度為lmmol'L-1誘導劑IPTG，誘導4h，得發酵液；(2)將發酵液13000Xg離心5mfn后去掉上清，用3mL生理鹽水懸浮細胞，13000Xg離心5min去掉上清，歪復此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細胞，()。C水浴屮經超聲波破碎5min，13000Xg離心10min取上清液即得重組熱穩定高溫酸性a—淀粉酶的粗酶液；(3)將制取的粗酶液用80。C水浴中處理30min，i3000Xg離心i0min取上淸液，再用DEAE離子交換層析和Ni親和層析的方法對重組酶進行純化，即得。7.-'種如權利耍求6所述方法得到的重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶，其特征在丁-:該酶的分子量為50KD;適合作用溫度9(rC，在95。C和l()(rC分別有9()%和70%的酶活力；該酶熱穩定性不依賴于Ca2—，酶液分別在80、90、100"C保溫5h后，其殘余酶活分別為82%、77%和69%;該酶的作J1:jpH范圍為pH4.9，適合作用pH為5.05.5，在pH4.5:"81X的殘余酶活；在80。C和90i:下該酶在pH59和pH58的范圍內穩定，該酶在10()lMh，pH57.5的范圍內穩定；金屬離了K—'—、Na+對酶有激活作用，Hg2+、Pb2+、Af丄、Cu2+、:Fe3+和Zn2丄能夠抑制酶活性;丄mmmol-L-1和5mmmo1.L—'N-溴代丁二酰亞胺對酶的活性具有抑制作用；該酶的Km為45mg'mL—、Vmax為9mg'ml—1,in1;該酶分解馬鈴薯淀粉為麥芽糖和麥芽三糖。8.—種如權利要求7所述重組熱穩定高溫酸性a-淀粉酶在淀粉水解中的應用。全文摘要本發明公開了一種來自超嗜熱古菌嗜熱球菌(ThermococcussiculiHJ21)編碼熱穩定高溫酸性α-淀粉酶基因，提供了該基因序列；提供了含有該基因序列的表達載體pEt-28a-His6-amy和表達該熱穩定的高溫酸性α-淀粉酶的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157；本發明還提供了利用該基因工程菌株表達的重組熱穩定高溫酸性α-淀粉酶的制備方法及酶性質與應用。文檔編號C12R1/01GK101691576SQ20091016337公開日2010年4月7日申請日期2009年8月13日優先權日2009年8月13日發明者劉姝,劉紅飛,呂明生,房耀維,王淑軍,秦松,陸兆新申請人:淮海工學院