專利名稱：牛支原體烯醇化酶及其編碼基因的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及牛支原體烯醇化酶及其編碼基因的新用途，特別涉及牛支原體烯醇化酶及其編碼基因在制備檢測纖溶酶原以及檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途。本發明屬于生物醫學領域。
背景技術：
牛支原體(Mycoplasma bovis)屬于柔壁菌門柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬，是牛支原體相關疾病的病原，可引起犢牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和關節炎，是一種重要的呼吸道病原體，目前牛支原體粘附宿主細胞的機制都還不明確。1961年，Hale在美國首次從一例患乳腺炎的牛乳中分離到該病原。目前，在北美洲、歐洲以及亞洲，牛支原體已經成為一種重要的病原菌并在多個國家與地區都有牛支原體相關疾病導致嚴重了經濟損失的報道。2008年，牛支原體首次在我國被分離鑒定，但到現在為止還沒有該疾病引起經濟損失的統計報道。牛支原體作為一種重要的牛呼吸道疾病的病原菌，有關它的粘附過程、致病機理以及免疫預防已經成為一個新的研究熱點。牛支原體通過在牛上呼吸道粘膜的定植，降低機體抵抗力引起其它病原體的繼發感染。牛支原體表面沒有發現專門的粘附結構，但是在其表面具有一組多變表面脂蛋白。該蛋白家族是多種病原菌的表面免疫相關蛋白，并且在致病菌與宿主細胞的黏附以及侵染宿主的過程中起到重要作用；同時具有很強的免疫原性，能夠刺激宿主產生很強的粘膜免疫。 進一步的研究發現在牛支原體表面存在除Vsp蛋白家族之外的粘附因子，例如pMB67、P26 抗原等并推測牛支原體表面存在著其它的粘附相關因子。纖溶酶原及其激活物廣泛存在于生物體內是一種92Ku大小的單鏈糖蛋白，在體外具有真核生物糖蛋白激活活性。該分子的結構包含有一個N端的氨基酸激活區其中包含著一個K5結合區，以及一個絲氨酸蛋白酶活性的區域。纖溶酶原以及它所激活轉換成的纖溶酶參與著眾多生理以及病理過程例如，纖維蛋白的溶解、周質蛋白溶解、癌細胞的組織侵染過程以及神經元細胞的死亡過程等。眾多細菌和支原體在其表面都存在纖溶酶原結合區域結構，使得這些病原體具有了菌體表面相關的水解蛋白能力，而這一能力能夠加強其在宿主內的侵染能力與擴散能力。新的研究還表明結合纖溶酶原可以明顯加強病原菌粘附宿主細胞的能力。已經有數種纖溶酶原結合受體在細菌及支原體中得到鑒定。
發明內容
本發明在克隆表達牛支原體基因時發現一個表達纖溶酶原結合蛋白的基因，并命名其為P18，該基因表達大小約為67Ku的重組蛋白。測序發現該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。經序列比對分析證實，該蛋白與牛支原體烯醇化酶(Genebank登錄號為YP_004683492. 1)的氨基酸序列具有100%的同源性，因此確定本發明所克隆得到的基因為牛支原體烯醇化酶基因。在體外表達該基因的重組蛋白后，通過western blot分析證明，證實牛支原體烯醇化酶具有良好的免疫活性，可被牛支原體抗體識別，從而可推測該基因可能是一種重要的牛支原體毒力基因。進一步的實驗表明，牛支原體烯醇化酶還具有與纖溶酶原的結合活性。在此基礎上，本發明人提出了本發明。首先，本發明提出了牛支原體烯醇化酶在制備檢測纖溶酶原試劑中的用途，優選的，所述的牛支原體烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a) SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有與纖溶酶原結合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物。在本發明的一個具體實施例中，所述的烯醇化酶含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本發明還提出了編碼所述烯醇化酶的基因在制備檢測纖溶酶原試劑中的用途，優選的，所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)編碼SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)編碼具有與纖溶酶原結合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物是通過將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、 缺失或插入而獲得的仍具有與纖溶酶原結合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物。在本發明的一個具體實施例中，所述的基因含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。其次，本發明提出了牛支原體烯醇化酶在制備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途，優選的，所述的牛支原體烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a) SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。在本發明的一個具體實施例中，所述的烯醇化酶含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本發明還提出了編碼所述烯醇化酶的基因在制備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途，優選的，所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)編碼SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)編碼具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物是通過將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得的仍具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。在本發明的一個具體實施例中，所述的基因含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。需要說明的是，蛋白質的功能是由氨基酸序列所決定的，但是并不是說一個或幾個氨基酸的替換、缺失或插入都必將影響該蛋白質的功能，這一點是本領域技術人員所公知的。在本發明提供的氨基酸序列的基礎上本領域技術人員可以通過保守方式替換所述序列的氨基酸而方便地獲得本發明蛋白的多種衍生物。例如，可用其他疏水性氨基酸替換序列中的疏水性氨基酸，或用芳香族氨基酸替換其他芳香族氨基酸或用堿性氨基酸替換其他堿性氨基酸等，當然也可通過缺失或插入的方式刪除或增加幾個或多個氨基酸，只要該獲得的蛋白仍具有與本發明所述的蛋白相同的功能則都應該包括在本發明所要求的保護范圍之內，其中所述功能包括對支原體抗體的免疫原性和/或與纖溶酶原結合的能力，而不論這種免疫原性和/或與纖溶酶原結合能力強弱大小發生怎樣的變化，都應視為具有支原體抗體的免疫原性和/或與纖溶酶原結合的能力。本發明通過原核表達，獲得了牛支原體烯醇化酶并通過調整誘導條件成功的可溶性表達了該蛋白，并通過重組牛支原體烯醇化酶與纖溶酶原配體實驗以及牛支原體烯醇化酶與牛支原體抗體Western blot實驗最終證明該蛋白具有纖溶酶原結合活性與免疫原性， 因此能夠用于檢測纖溶酶原以及用于檢測或診斷由牛支原體引起的感染或疾病。并且也為以后研究牛支原體粘附機制，致病力以及疫苗的研制開辟了新的道路。
圖1為牛支原體烯醇化酶基因(P18)的分段PCR擴增片段電泳結果；1 :P18-5/P18-6 引物擴增產物；2 :P18_3/P18_4 引物擴增產物；3 :P18_1/P18_2 引物擴增產物；C 負對照；M =DNA Marker圖2為牛支原體烯醇化酶基因(P18)重疊PCR擴增電泳結果；1-2 牛支原體烯醇化酶基因擴增結果；C 負對照；M =DNAMarker圖3為表達、純化重組牛支原體烯醇化酶(P18)電泳結果；1 未誘導的pET_32a/BL21裂解液；2 誘導后的pET_32a/BL21裂解液；3 未誘導的PET-P18/BL21裂解液4 誘導后的pET_P18/BL21裂解液；5_6 純化后的牛支原體烯醇化酶重組蛋白；M :Protein weight Marker圖4為重組牛支原體烯醇化酶(P18)與纖溶酶原配體實驗檢測結果；1 純化后的牛支原體烯醇化酶重組蛋白；2 =BSA ；M =Protein weight Marker圖5為牛支原體烯醇化酶(P18)與牛支原體抗體Wfestern blot實驗檢測結果。1 純化后的牛支原體烯醇化酶重組蛋白；2 :E. coli蛋白；3 =BSA ；M =Protein weight Marker
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1牛支原體烯醇化酶基因(P18)的克隆和表達1、材料1. 1支原體培養牛支原體湖北分離株(HB)由本實驗室分離并鑒定(Vassalli J D，Sappino A P, and Belin D. The plasminogen activator/plasmin system[J].J Clin. Invest. 1991. 88 ) :1067-1072)。按照文獻(Radaelli Ε, Luini Μ. Bacteriological, serological, pathological and immunohistochemical studies of Mycoplasma bovis respiratory infection in veal calves and adult cattle at slaughter[J], Research in Veterinary Science 2008. 85(2) :282-290.)描述的方法，在含有 20%馬血清、10%酵母浸出液以及醋酸鉈(0. 125mg/ml)與青霉素QOOIU/ml)的PPLO培養基中擴大培養菌種。 在37. 0°C下培養3 5d后4°C，13000r/min離心30分鐘收集菌體，并用PBS沖洗菌體3次。菌體存于-70°C冰箱1. 2主要試劑組織/細胞DNA(小量)抽提試劑盒(上海華舜生物技術公司)；膠回收試劑盒 (上海華舜生物技術公司)；質粒提取試劑盒(omega) ；DAB顯色試劑盒(碧云天)；多種 HRP 酶標二抗(Sigma) ；Ni-NTA 樹脂(Novagen)；人血纖溶酶原(Sigma) ；rTaq 酶、dNTP、PCR Buffer (寶生物大連公司)。2、方法2. 1、基因組的提取與目的基因的克隆應用組織/細胞DNA抽提試劑盒按照說明書獲取基因組。根據本實驗室測定的牛支原體湖北分離株(HB)全基因組序列(NC_015725. 1) (Li Y，Zheng H，Liu Y，et al. The Complete Genome Sequence of Mycoplasma bovis Strain Hubei-I[J]. 2011, PLoS ONE 6(6) :e20999.)，針對牛支原體烯醇化酶基因(P18)序列設計引物。由于在大腸桿菌中TGA 編碼是終止密碼子而在支原體中編碼為色氨酸。我們通過重疊PCR的方法設計3対特異性引物將牛支原體烯醇化酶基因(P18)中的TGA突變為TGG。引物信息見表1。反應程序均為95°C 5min ；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 60s，共 32 個循環；72°C 7min。PCR 產物經的瓊脂糖凝膠電泳檢測。表1牛支原體烯醇化酶基因(PlS)PCR擴增引物
權利要求
1.牛支原體烯醇化酶在制備檢測纖溶酶原試劑中的用途，優選的，所述的牛支原體烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)將SEQID NO :1所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有與纖溶酶原結合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述的烯醇化酶含有SEQID N0:1所示的氨基酸序列。
3.編碼權利要求1所述烯醇化酶的基因在制備檢測纖溶酶原試劑中的用途，優選的， 所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)編碼SEQID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)編碼具有與纖溶酶原結合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物的核苷酸序列， 該蛋白衍生物是通過將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得的仍具有與纖溶酶原結合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物。
4.按照權利要求3所述的用途，其特征在于所述的基因含有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
5.牛支原體烯醇化酶在制備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途，優選的，所述的牛支原體烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)將SEQID NO :1所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。
6.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述的烯醇化酶含有SEQID N0:1所示的氨基酸序列。
7.編碼權利要求5所述烯醇化酶的基因在制備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途，優選的，所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)編碼SEQID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)編碼具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物是通過將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得的仍具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。
8.按照權利要求7所述的用途，其特征在于所述的基因含有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明公開了牛支原體烯醇化酶及其編碼基因的新用途。具體的，本發明公開了牛支原體烯醇化酶及其編碼基因在制備檢測纖溶酶原以及檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途。本發明通過原核表達，獲得了烯醇化酶蛋白并通過調整誘導條件成功的可溶性表達了該蛋白，進一步的，通過重組烯醇化酶蛋白與纖溶酶原配體實驗以及烯醇化酶蛋白與牛支原體抗體Western blot實驗最終證明該蛋白具有纖溶酶原結合活性與免疫原性，因此能夠用于檢測纖溶酶原以及用于檢測或診斷由牛支原體引起的感染或疾病。并且也為以后研究牛支原體粘附機制，致病力以及疫苗的研制開辟了新的道路。
文檔編號C12Q1/68GK102533940SQ201210006999
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者劉洋, 李媛, 辛九慶 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所, 哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司